ndm-1基因的检测与确认

ICDC, China CDCNDM-1基因的检测与确认中国疾病预防控制中心传染病预防控制所ICDC, China CDCNDM-1简介v 一个新发现的耐药基因，全长 826bpv 编码 1型新德里金属 -内酰胺酶造细菌成对碳青酶烯类药物耐药v 位于质粒上最初发现在肺炎克雷伯杆质粒 pKpANDM-1上Genbank FN396876 （ 2009.11.24）v 具有可移动性可在不同种属细菌间转移革兰阴性：肠杆菌科、不动杆菌、假单胞菌革兰阳性：？E.coli Genbank AB571289 （ 2010.07.10）ICDC, China CDCNDM-1的基因检测v PCR检测v 序列测定 最终确认v 检测对象： 已经过表型筛检的菌株进行 NDM-1基因确认 对大批菌株直接进行筛检 对标本的检测v 高通量、快速、准确ICDC, China CDCPCR检测方法 模板制备v 模板制备：菌株、标本v 菌株（ 1） G-细菌：a. 水煮模板：新鲜培养物悬浊于 100-200l纯水沸水浴 10min以上8000rpm以上离心 5min吸取上清， -20 保存b. 试剂盒提取基因组 DNA（说明书）ICDC, China CDCPCR检测方法 模板制备v 菌株（ 2） G+细菌：a. 试剂盒提取基因组 DNA（说明书）溶菌酶充分作用b. 水煮模板：新鲜培养物悬浊于 100-200 l纯水低温反复冻融（ -40 以下或液氮）沸水浴 10min以上8000rpm以上离心 5min吸取上清， -20 保存2. 标本：根据标本类型不同选择相应的试剂盒ICDC, China CDCPCR检测 引物选择v 引物选择： 扩增片段位于 CDS正向的 191-482位置（反向 345-636位置）483-769位置（反向 58-344位置） 引物特异性较好，理论上无非特异扩增片段引物 引物序列（ 5 3） 产物大小（ bp） 退火温度 ( )引物 117U-191 CAGCACACTTCCTATCTC 292 5517L-465 CCGCAACCATCCCCTCTT引物 2F-58 GGCGGAATGGCTCATCACGA 286 60R-344 CGCAACACAGCCTGACTTTCICDC, China CDCPCR检测 PCR体系v 引物合成稀释 冻干粉末，开启前 10000rpm离心 5min 小心开盖，防止粉末喷出 1.0OD+268 l纯水，充分震荡混匀 ，浓度 20 M（ 20 mol/L）v 20 l体系（右图） 若使用含有 Mg2+的 10buffer的加入量同上表， MgCl2体积用水补齐 PCR Premix预混液（根据说明书）成分 体 积 （ l）10buffer 2dNTP （ 10mM each） 1.6MgCl2 （ 2.5mM） 1.2Primer-F（ 20M） 1Primei-R（ 20M） 1Taq（ 5U/l） 0.2纯 水 12DNA 1ng总 体 积 20ICDC, China CDCPCR检测 PCR体系v 没有阳性对照，如何确保体系正常运转v 同批 配置体系时：增加 1管不使用 NDM-1引物加入常用引物及模板，扩增其他已知片段v 人工合成长片段 DNA作为阳性对照？不建议合成 ：首次发现时如何排除 “污染 ”质疑如果一定要合成：在中间区域加入 若干数量的突变位点作为区别合成片段与实际阳性片段的标志ICDC, China CDCPCR检测 PCR反应条件与电泳v 反应条件 ：（约耗时 1小时 25分钟）94 5min94 15secTm 30sec 25个循环72 30sec72 5minv 电泳： 1.5%琼脂糖电泳marker： DL2000ICDC, China CDC基因序列测定 最终确认v PCR阳性结果：携带 NDM-1基因非特异扩增v 最终确认：序列测定v 测序公司，当天得到结果v 测序样品： 100 l以上 PCR产物v 引物及其浓度：上下游引物各 10 l（ 20uM）v 测序要求：双向、测通，提供拼接好的序列ICDC, China CDC基因序列测定 测序结果判读v 测序彩图：峰体清晰、无套峰ICDC, China CDC基因序列测定 测序结果判读v 双向测序结果拼接v 起始段结果（ 10-30bp）、反应结果段结果（ 500bp）不可用ICDC, China CDC基因序列测定 序列比对v 下载参考序列：Genbank： FN396876.1 /nuccore/255031061AB571289、 HQ171206、 HM853678v 将测度序列与参考序列比对：常用软件： Clustal、 DNAstar、 Megav 最终确认是否为 NDM-1基因序列v 判定该细菌携带 NDM-1基因ICDC, China CDCNDM-1基因携带与耐药v 抗生素敏感性 细菌表型特征耐药基因正确表达，表现出细菌的抗生素敏感性一种细菌可具有多种耐药机制NDM-1只是其中一种该细菌表现出的抗生素