仪器分析》课程

Modern Instrument Analytical Method 仪器分析仪器分析 课程课程厦门大学精品课程厦门大学精品课程仪器分析仪器分析 (含实验含实验 )第十二章Chapter Twelve分子荧光分子荧光 :Fluorescence分子磷光分子磷光 :PhosphorescenceModern Instrument Analytical Method12.1 分子发光的基本原理分子发光的基本原理v第一次记录荧光现象的是第一次记录荧光现象的是 16世纪西班牙的内科医生和植物学家世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes， 1575年他提到在含有一种称为年他提到在含有一种称为 “Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。色。v直到直到 1852年，年， Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石，他还由发荧光的矿石 “萤石萤石 ”推演而提出推演而提出 “荧光荧光 ”这一术语。这一术语。v1867年，年， Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝应用铝 桑色素配合物的荧光进行铝的测定。桑色素配合物的荧光进行铝的测定。v19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到 1928年，才由年，才由Jette和和 West提出了第一台荧光计。提出了第一台荧光计。Modern Instrument Analytical Method一一 . 分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生1. 单重态与三重态单重态与三重态2. 分子的活化与去活化3.分子发光的类型分子发光的类型按激发的模式分类：按激发的模式分类： 按分子激发态的类型分类：按分子激发态的类型分类： 光致发光光致发光化学发光化学发光 /生物发光生物发光热致发光热致发光场致发光场致发光摩擦发光摩擦发光分子发光分子发光分子发光分子发光 荧光荧光磷光磷光瞬时荧光瞬时荧光迟滞荧光迟滞荧光按光子能量分类：按光子能量分类：斯托克斯荧光斯托克斯荧光 (Stokes)： ex em共振荧光共振荧光 (Resonance)： ex = em荧光荧光 Modern Instrument Analytical Method分子的活化与去活化S0S1T1S2紫紫外外可可见见吸吸收收光光谱谱外转移外转移紫紫外外可可见见共共振振荧荧光光光光谱谱内转移内转移荧光荧光 系间系间窜跃窜跃磷磷光光反系间反系间窜跃窜跃迟迟滞滞荧荧光光振动弛豫振动弛豫 . 无辐射跃迁的类型无辐射跃迁的类型振动弛豫振动弛豫 : Vr 10-12sec外外 转转 移移 :无辐射跃迁无辐射跃迁回到基态回到基态内内 转转 移移 :S2S1能级能级之间有重叠之间有重叠系间窜跃系间窜跃 : S2T1能级能级之间有重叠之间有重叠反系间窜跃反系间窜跃 :由外部获由外部获取能量后取能量后 T1 S2 . 辐射跃迁的类型辐射跃迁的类型共振荧光：共振荧光： 10-12 sec荧荧 光：光： 10-8 sec磷磷 光：光： 110-4 sec迟滞荧光迟滞荧光 :10210-4 secModern Instrument Analytical Method二二 . 分子荧光分子荧光 (磷光磷光 )光谱光谱1. 荧光荧光 (磷光磷光 )激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱荧光荧光 (磷光磷光 )均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。同波长的荧光。A. 激发光谱激发光谱固定固定 em=620nm(MAX)ex =290nm (MAX)固定发射波长固定发射波长扫描激发波长扫描激发波长荧光激发光谱与荧光激发光谱与紫外紫外 -可见吸收光可见吸收光谱类似谱类似Modern Instrument Analytical Methodex =290nm (MAX)固定固定 em=620nm(MAX) 固定固定 ex=290nm (MAX)em= 620nm(MAX)B. 发射光谱发射光谱 (荧光光谱荧光光谱 )固定激发波长固定激发波长 扫描发射波长扫描发射波长C. 激发光谱与发射激发光谱与发射光谱的镜像关系光谱的镜像关系S04321S14321发射光谱的形状与激发波长无关：发射光谱的形状与激发波长无关：分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于使分子被激发到高于 S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。1 41 31 21 11 41 41 21 1Modern Instrument Analytical MethodD.磷光光谱磷光光谱 与与 发射光谱相同条件下的磷光光谱发射光谱相同条件下的磷光光谱激发光谱激发光谱发射光谱发射光谱2. 三维荧光光谱三维荧光光谱I F f (ex 、 em)蒽的激发光谱蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长I F f (ex 、 em)蒽的发射光谱蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图 蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱Modern Instrument Analytical MethodVB1和和 VB2的三维荧光光谱的三维荧光光谱RLSDSTSATSADS散射片三维共振光散射光谱散射片三维共振光散射光谱3.三维共振光散射光谱三维共振光散射光谱ADSATSTSRLSDS散射片三维共振光散射等高线光谱图散射片三维共振光散射等高线光谱图共振光散射共振光散射瑞利散射瑞利散射固定固定 ex=270nm拉曼光拉曼光二级共振光散射二级共振光散射三级共振光散射三级共振光散射荧光光谱有用区间荧光光谱有用区间Modern Instrument Analytical Method三三 . 分子荧光分子荧光 (磷光磷光 )强度与荧光物质浓度的关系强度与荧光物质浓度的关系1. 荧光强度荧光强度 (磷光磷光 )与浓度的关系与浓度的关系光吸收定律光吸收定律 （ Lambert Beer Law）相应的吸光分数为：相应的吸光分数为：荧光强度（荧光强度（ IF） 与相应的吸光分数成正比：与相应的吸光分数成正比：按照级数展开式：按照级数展开式：Modern Instrument Analytical Method对于稀溶液，当对于稀溶液，当 bc1000 p(s) 2.6 2.5 1.4 0.23 0.014 0.00236.溶剂效应溶剂效应蓝移蓝移 : E n * E n * 红移红移 : E* E* 在极性溶剂中：在极性溶剂中：无溶剂化作用无溶剂化作用 有溶剂化作用有溶剂化作用Modern Instrument Analytical Method三 . 金属螯合物的荧光1. 螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光2. 螯合物中金属离子的发光螯合物中金属离子的发光8-羟基喹啉羟基喹啉弱荧光弱荧光8-羟基喹啉羟基喹啉 -Zn螯合物螯合物黄绿色强荧光黄绿色强荧光2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯无荧光无荧光2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯 -Al螯合物螯合物强荧光强荧光T1系间窜跃系间窜跃S0S1d *、 f*d * d f* f 荧光荧光分子内能量转移分子内能量转移Modern Instrument Analytical Method四 . 荧光的熄灭1. 碰撞熄灭碰撞熄灭荧荧 光光 熄熄 灭灭 ：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光强度降低或消失的现象。荧光熄灭剂荧光熄灭剂 ：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。相对速率相对速率1K1 M*K2 M* Q与分子的直径与分子的直径、粘度、温度等因、粘度、温度等因素有关。素有关。2. 能量转移熄灭能量转移熄灭再吸收过程：再吸收过程： 共振能量转移：共振能量转移：分子内能量转移：分子内能量转移： hv激发激发发射发射熄灭熄灭Modern Instrument Analytical Method3. 氧的熄灭作用氧的熄灭作用氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，4. 自熄灭与自吸收自熄灭与自吸收当荧光物质的浓度大于当荧光物质的浓度大于 1g/L时，常发生荧光的自熄灭时，常发生荧光的自熄灭 (浓度熄灭浓度熄灭 )自吸收：自吸收：没有除氧，溶液中没有除氧，溶液中难以观察到磷光难以观察到磷光由于由于 F 1， 使荧光使荧光强度减弱或消失强度减弱或消失 .形成二聚体：形成二聚体：由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。灭现象。Modern Instrument Analytical Method12.3 荧光荧光 (磷光磷光 )分光光度计分光光度计一一 . 主要组成及部件的功能主要组成及部件的功能荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图光源光源氙氙灯灯激发单色器激发单色器样品池样品池光电倍增管光电倍增管数据处理数据处理仪器控制仪器控制光源光源 样品池样品池激发激发单色器单色器检测器检测器 数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射发射单色器单色器发射单色器发射单色器问题：问题： 荧光分光光度荧光分光光度计与紫外计与紫外 -可见分光光可见分光光度计有何异同点？度计有何异同点？Modern Instrument Analytical Method二二 . 光源光源1. 光源的要求：光源的要求：v发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱v光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小v有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命2.氙灯光源氙灯光源常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：氙灯光源氙灯光源 高压汞光源高压汞光源波长范围：波长范围： 2001000nm工作压力工作压力 ： 520 atm启动电压：启动电压： 2040KV使用寿命：使用寿命： 10002000h最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源：发射波长范围宽发射波长范围宽 发射光强度大发射光强度大Modern Instrument Analytical Method3. 高压汞灯光源高压汞灯光源应用广泛的应用广泛的 线光源线光源 ：253.7 296.5 302.2 312.6313.2 365.0 365.5 366.3404.7 435.8 546.1 557.0579.0 (nm )光源光源 样品池样品池激发激发滤光片滤光片检测器检测器 数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射发射单色器单色器光源光源 样品池样品池激发激发滤光片滤光片检测器检测器 数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射发射滤光片滤光片Modern Instrument Analytical Method玻玻璃璃滤滤光光片片的的透透射射率率干干涉涉滤滤光光片片的的透透射射率率截截止止涉涉滤滤光光片片的的透透射射率率Modern Instrument Analytical Method三三 . 单色器单色器平面衍射光栅平面衍射光栅 线色散率线色散率 聚光本领聚光本领分辨率分辨率四四 . 检测器检测器光电倍增管光电倍增管放大倍数：放大倍数： 2n5n;n=10,103107， 最大最大 108109五五 .样品池：