hiv、梅毒检测课件

HIV抗体、梅毒抗体、梅毒筛查技术筛查技术平昌疾控 李勇2011.04.21HIV抗体筛查依据： 全国艾滋病检测技术规范 （ 2009年修订版） 全国艾滋病检测工作管理办法 艾滋病检测实验室的管理艾滋病检测实验室的管理 国家对艾滋病检测实验室实行分类管国家对艾滋病检测实验室实行分类管理，按照实验室的职能、开展检测工理，按照实验室的职能、开展检测工作的性质及范围共分三类实验室，分作的性质及范围共分三类实验室，分别是别是 艾滋病参比实验室、艾滋病检测艾滋病参比实验室、艾滋病检测确证实验室、艾滋病检测筛查实验室确证实验室、艾滋病检测筛查实验室（包括：艾滋病筛查中心实验室、艾滋病筛查（包括：艾滋病筛查中心实验室、艾滋病筛查实验室和艾滋病检测点）实验室和艾滋病检测点） 。艾滋病检测点的申请和验收程序（一）申请设立艾滋病检测点的机构或单位应填写（一）申请设立艾滋病检测点的机构或单位应填写 “艾滋病检测点资格审批申请表艾滋病检测点资格审批申请表 ”（附（附件件 2），向当地区县卫生行政部门提出申请，经区县卫生行政部门批准后报市（州）卫），向当地区县卫生行政部门提出申请，经区县卫生行政部门批准后报市（州）卫生行政部门审批。生行政部门审批。（二）艾滋病检测点基本标准（二）艾滋病检测点基本标准1.人员条件人员条件 ：至少由：至少由 2名经过市（州）级以上艾滋病检测技术培训并获得培训证书的专业名经过市（州）级以上艾滋病检测技术培训并获得培训证书的专业人员组成。人员组成。2.建筑条件建筑条件 ：需有艾滋病检测区域或专用实验台，能开展简便、快速检测。：需有艾滋病检测区域或专用实验台，能开展简便、快速检测。3.设备条件设备条件 ：需配备快速试验所必须的物品，包括：需配备快速试验所必须的物品，包括 加样器、普通冰箱、操作环境温度控加样器、普通冰箱、操作环境温度控制设备、消毒与污物处理设备、一次性消耗品、安全防护用品。制设备、消毒与污物处理设备、一次性消耗品、安全防护用品。（三）对符合规定、材料齐全的申请者，由所在市（州）卫生行政部门指定（三）对符合规定、材料齐全的申请者，由所在市（州）卫生行政部门指定 2人以上人员人以上人员组成的艾滋病检测点评审专家组（专家组成员必须经过省级以上艾滋病检测相关培训组成的艾滋病检测点评审专家组（专家组成员必须经过省级以上艾滋病检测相关培训）根据本方案艾滋病检测点基本标准对申报单位进行现场验收，同时使用）根据本方案艾滋病检测点基本标准对申报单位进行现场验收，同时使用 5份盲样对其份盲样对其进行实验操作及结果判读进行现场操作考核。进行实验操作及结果判读进行现场操作考核。（四）专家组对通过现场验收的检测点报请市（州）卫生行政部门批准及备案。（四）专家组对通过现场验收的检测点报请市（州）卫生行政部门批准及备案。（五）市（州）级卫生行政部门对通过验收者发出批复通知，同时抄送省卫生厅、省疾病（五）市（州）级卫生行政部门对通过验收者发出批复通知，同时抄送省卫生厅、省疾病预防控制中心和市（州）疾病预防控制中心，未通过验收者整改后可重新提出申请。预防控制中心和市（州）疾病预防控制中心，未通过验收者整改后可重新提出申请。基基 本本 概概 念念艾滋病艾滋病 (AIDS)又称又称 获得性免疫缺陷综合征获得性免疫缺陷综合征 ，是由，是由人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒 (HIV)感染所引起的一种免疫缺感染所引起的一种免疫缺陷性疾病。陷性疾病。 HIV在病毒分类中属逆转录病毒科慢在病毒分类中属逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。全球流行的病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。全球流行的HIV可分为可分为 2型：型： HIV-1型和型和 HIV-2型。型。 HIV-1型是型是引起艾滋病流行的主要病原（引起艾滋病流行的主要病原（ 90%以上）。以上）。 HIV-2型主要局限于西非等国。应用型主要局限于西非等国。应用 免疫印迹法免疫印迹法 (WB)可以将二者明确地区别开来。可以将二者明确地区别开来。HIV形态与结构 HIV呈球形，直径呈球形，直径 100-120nm 内含内含 RNA分子及酶（逆转录酶、整合酶喝蛋白酶）分子及酶（逆转录酶、整合酶喝蛋白酶） 外层有包膜，膜上为突起插入，突起由糖蛋白（外层有包膜，膜上为突起插入，突起由糖蛋白（ gp120）和）和跨膜蛋白（跨膜蛋白（ gp41）以共价键连接而成。）以共价键连接而成。 HIV基因：基因： 3个结构基因和个结构基因和 6个调节基因个调节基因 3个结构基因：个结构基因： env、 gag、 pol表达的蛋白：表达的蛋白：env-gp160、 gp120、 gp41gag-p55、 p24、 p17pol-p66、 p51、 p31HIV感染机理（一）感染机理（一） HIV病毒侵入人体后，其表面糖蛋白病毒侵入人体后，其表面糖蛋白 gp120与细胞表面与细胞表面受体蛋白受体蛋白 CD4以高亲和力结合，吸附到宿主细胞上；以高亲和力结合，吸附到宿主细胞上；gp120再与宿主细胞表面辅助受体相互作用，使病毒与再与宿主细胞表面辅助受体相互作用，使病毒与宿主细胞膜更接近；宿主细胞膜更接近； gp41产生一系列构象变化，其产生一系列构象变化，其 N端端的融合肽片段插入宿主细胞膜，导致病毒包膜与细胞膜的融合肽片段插入宿主细胞膜，导致病毒包膜与细胞膜的最终融合，病毒的最终融合，病毒 RNA进入细胞。进入细胞。 在在 HIV感染后，最先能够监测到病毒感染后，最先能够监测到病毒 RNA、然后是、然后是 p24抗原，抗原， 最后是抗体最后是抗体 。 HIV感染机理感染机理 （二）（二） 感染感染 HIV后，机体针对后，机体针对 HIV基因编码的抗原性物质产生相应抗体基因编码的抗原性物质产生相应抗体，在临床上具有重要诊断学意义的主要是对抗结构基因编码抗原，在临床上具有重要诊断学意义的主要是对抗结构基因编码抗原(如如 gpl60， gpl20， gp41， p66， p55， p51， p31， p24， p17等等 )的抗的抗体。体。 由于个体差异、各种病毒蛋白的浓度和抗原性强弱不同及不同由于个体差异、各种病毒蛋白的浓度和抗原性强弱不同及不同个体对不同抗原成分的反应性均有所不同，因此相应抗体的产生个体对不同抗原成分的反应性均有所不同，因此相应抗体的产生时间和不同个体对相同抗原成分的免疫应答强度等存在一定差别时间和不同个体对相同抗原成分的免疫应答强度等存在一定差别，此外，检测方法和使用试剂的敏感性不同对，此外，检测方法和使用试剂的敏感性不同对 HIV抗体的检出时抗体的检出时间产生一定影响。在感染间产生一定影响。在感染 HIV后，患者血清中最先出现后，患者血清中最先出现 p24抗原抗原，继之，各种，继之，各种 HIV抗原可达到高峰；抗原可达到高峰； 2-6周后，随着周后，随着 HIV-l抗体产抗体产生及浓度的不断增加，生及浓度的不断增加， HIV抗原渐趋降低或检测不出。临床通用抗原渐趋降低或检测不出。临床通用ELISA、免疫印迹法（、免疫印迹法（ WB）和目前开始推广的快速诊断法检测）和目前开始推广的快速诊断法检测HIV抗体。抗体。HIV感染的主要检测方法（一）感染的主要检测方法（一） 目前检测目前检测 HIV的方法很多，总体来说可以分为的方法很多，总体来说可以分为 抗抗体检测体检测 和和 病毒检测病毒检测 两大类。病毒检测包括两大类。病毒检测包括 细胞培细胞培养养 (病毒分离病毒分离 )、 p24抗原检测抗原检测 和和 病毒核酸检测病毒核酸检测 。 早期对早期对 HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体的抗体 ,间接地诊断间接地诊断 HIV感染。感染。 近几年，分子生物学方法不断被应用到近几年，分子生物学方法不断被应用到 HIV的检的检测中，测中， HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了，核酸检测已经成为了 HIV实验室诊断的发展方实验室诊断的发展方向。向。HIV感染窗口期感染窗口期 窗口期的问题？抗体通常是在感染后窗口期的问题？抗体通常是在感染后 3 8周能够被检测出来。周能够被检测出来。 95%在三个月可以检测在三个月可以检测出抗体。出抗体。 在窗口期，病毒抗体不能被检出，但可以在窗口期，病毒抗体不能被检出，但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能够在个体感染后先于血清转化够在个体感染后先于血清转化 2 18 d被检被检测到。因此，在血清转化期通过检测测到。因此，在血清转化期通过检测 p24抗抗原作为早期辅助诊断原作为早期辅助诊断 HIV感染的一种方法感染的一种方法。HIV感染的主要检测方法（二）感染的主要检测方法（二）-HIV抗体检测抗体检测 检测抗检测抗 -HIV抗体是抗体是 HIV/AIDS诊断的一项重要指诊断的一项重要指标，抗标，抗 -HIV抗体测定作为血清学诊断要求准确抗体测定作为血清学诊断要求准确、可靠，必须经、可靠，必须经 初筛初筛 、 复检试验复检试验 和和 确认实验确认实验 三个三个步骤。步骤。 初筛实验方法主要有：酶联免疫试验（初筛实验方法主要有：酶联免疫试验（ELISA）、）、 明胶颗粒凝集试验（明胶颗粒凝集试验（ PA）、）、 快速免疫快速免疫（层析或渗滤）试验（层析或渗滤）试验（ RT）。）。 确认试验主要用免疫印迹试验（确认试验主要用免疫印迹试验（ WB）。）。HIV检测程序及流程图 筛查试验筛查试验 : 标本验收合格后，用筛查试剂进行检标本验收合格后，用筛查试剂进行检测，如呈阴性反应，报告测，如呈阴性反应，报告 HIV抗体阴性；对呈阳抗体阴性；对呈阳性反应的标本，须进行重复检测性反应的标本，须进行重复检测 复检复检 :对筛查呈阳性反应的标本用原有试剂和另对筛查呈阳性反应的标本用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂重复检测。如外一种不同原理或不同厂家的试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告两种试剂复测均呈阴性反应，则报告 HIV抗体阴抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。确认实验室进行确认。 应尽可能将重新采集的受检者血液标本和原有标应尽可能将重新采集的受检者血液标本和原有标本一并送检。本一并送检。样品样品初筛试验筛查试剂阳性反应 阴性反应复检试验一阴一阳 均阴性反应均阳性反应阴性报告送确认实验室确认试验筛查试验的流程图 原有试剂 +另一不同原理（或厂家）试剂或另外两种不同原理（或厂家）试剂酶联酶联 免疫吸附试验免疫吸附试验 (ELISA) 基本原理基本原理 :是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物，是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物，酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物 ,然后加入酶底物然后加入酶底物 ,经酶的催化或水解作用经酶的催化或水解作用 ,无色底物产生颜色无色底物产生颜色 ,用肉用肉眼、酶标仪观察结果。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免眼、酶标仪观察结果。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。p 初筛用的初筛用的 HIV ELISA试剂目前已经发展到试剂目前已经发展到 第四代第四代 检测试剂。检测试剂。第一代第一代 试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板 ,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯 ,假阳性率较高。假阳性率较高。第二代第二代 试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用板，由于纯化抗原的使用 ,特异性有了很大提高。特异性有了很大提高。第三代第三代 试剂使用双抗原夹心法检测抗体试剂使用双抗原夹心法检测抗体 ,进一步提高了敏感性。进一步提高了敏感性。 -目前国内外主要使用第三代目前国内外主要使用第三代第四代第四代 试剂则在第三代的基础上进一步增加了试剂则在第三代的基础上进一步增加了 P24抗原的检测抗原的检测 ,把把HIV抗原和抗抗原和抗 P24的抗体同时包被反应板的抗体同时包被反应板 ,可同时检测血清中的可同时检测血清中的 HIV抗抗体和体和 P24抗原。检出时间提前了抗原。检出时间提前了 4-9.1d，用于，用于 血源筛查血源筛查 等。等。HIV抗体筛查试验基本要求 筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批检合格、临床评估质量优良、在有效期批准、批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。内的试剂。 目前常用的筛查试剂有酶联免疫、颗粒凝集和其目前常用的筛查试剂有酶联免疫、颗粒凝集和其它快速诊断试剂。它快速诊断试剂。 建议采用国家参比室试剂考评质量优良的试剂建议采用国家参比室试剂考评质量优良的试剂 -中国疾病预防控制中心性艾中心网站中国疾病预防控制中心性艾中心网站快速检测（ RT）（ 1） 常用的主要有以下几种：常用的主要有以下几种：明胶颗粒凝集试验（明胶颗粒凝集试验（ PA） ： PA是是 HIV血清抗体检测血清抗体检测的一种简便方法，是将的一种简便方法，是将 HIV抗原致敏明胶颗粒作为抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有温）。当待检样品含有 HIV抗体时，经抗原致敏的抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原明胶颗粒与抗体发生抗原 -抗体反应，根据明胶颗抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。粒在孔中的凝集情况判读结果。斑点斑点 EIA或称斑点或称斑点 ELISA（ dot-EIA） ：以硝酸纤维：以硝酸纤维膜为载体，将膜为载体，将 HIV抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同抗原。加血清样品作用，以后步骤同 ELISA。阳性。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在在 10 min以内，使用抗原量少。以内，使用抗原量少。快速检测（ RT）（ 2）斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验金金 标纸标纸 条采用双抗原条采用双抗原 夹夹 心法免疫心法免疫 测测 定原理，定原理， 选选择经纯择经纯 化的基因工程制化的基因工程制 备备 的的 gp36、 gp41、 p24抗抗原作原作 为为 包被抗原和包被抗原和 gp41、 gp36基因工程抗原和基因工程抗原和 p24合成合成 肽肽 作作 为为 胶体金胶体金 结结 合抗原。合抗原。当待当待 检标检标 本中含有本中含有 HIV抗体抗体 时时 ，先和金，先和金 标记标记 抗抗原原 结结 合，由于合，由于 层层 析作用反析作用反 应应 复合物沿硝酸复合物沿硝酸 纤维纤维 膜膜向前移向前移 动动 ，当遇到包被抗原，当遇到包被抗原 时时 ，形成，形成 Ag-Ab-Ag-Au复合物而富集在包被复合物而富集在包被 线线 上，形成上，形成 红红 色沉淀色沉淀 线线 。同同 时时 在包被膜上在包被膜上 还还 有一条有一条 质质 控控 线对线对 照，故当有两照，故当有两条条 红线时红线时 判判 为为 阳性，只有一条阳性，只有一条 红线时红线时 ，判，判 为为 阴阴性。性。该该 方法方法 试剂稳试剂稳 定，可室温定，可室温 长长 期保存。期保存。 试验时试验时不需任何不需任何 设备设备 ，迅速、，迅速、 简简 便、特异性便、特异性 较较 好，敏感好，敏感性性 约约 相当于中度敏感的相当于中度敏感的 ELISA，适用于，适用于 应应 急急 检测检测、 门诊门诊 急急 诊诊 个体个体 检测检测 ，尤其是基，尤其是基 层单层单 位。位。样本要求 1.采集静脉采集静脉 血清血清 或或 血浆血浆 ，并避免样品溶血。，并避免样品溶血。 2.如果血清或血浆样本收集后如果血清或血浆样本收集后 7天内检测，天内检测，样品须放在样品须放在 2-8 保存，如果大于保存，如果大于 7天则须冷天则须冷冻（冻（ -20 ）保存。）保存。 3.如果要使用血浆样本，需使用如果要使用血浆样本，需使用 EDTAK2或或EDTAK3抗凝，使用其他抗凝剂的血浆样抗凝，使用其他抗凝剂的血浆样本可能会得到不正确的结果。本可能会得到不正确的结果。 【 建议最好建议最好不使用肝素钠抗凝剂的血浆标本不使用肝素钠抗凝剂的血浆标本 】 。胶体金快速试验胶体金快速试验 -操作步骤操作步骤 1、将待测标本从储存条件下取出，平衡至室温并编号。 2、将所需数量的测试卡从包装盒中取出平衡至室温，打开铝箔包装袋，平置于台面上。 3、用微量加样器取 50I检测样本，加到测试卡的加样处。 【 也可以用试剂包装中自带的一次性滴管滴加测试标本 2滴 】 。 4、加样后， 30分钟内（从加样后计时起）最终观察并记录测试结果。胶体金快速试验胶体金快速试验 -结果判断结果判断1、 阳性：阳性： 测试卡在检测区（测试卡在检测区（ T）和对照区）和对照区 (C)位置各出位置各出现一条紫红色条带（共现一条紫红色条带（共 2条红色带），判为阳性。条红色带），判为阳性。【 特别注意：测试区（特别注意：测试区（ T）内的紫红色条带可呈现颜色深）内的紫红色条带可呈现颜色深浅的现象。在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅浅的现象。在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，即使只有非常弱的色带也应判定为阳性结果。检测线，即使只有非常弱的色带也应判定为阳性结果。检测线颜色的深浅的程度与样品中抗体的滴度没有一定的必然颜色的深浅的程度与样品中抗体的滴度没有一定的必然联系。阳性标本必须使用其他方法确认。联系。阳性标本必须使用其他方法确认。 】2、阴性、阴性 ：测试卡只在对照区：测试卡只在对照区 (C)位置出现一条紫红色条位置出现一条紫红色条带。带。3、失效：、失效： 对照区对照区 (C)未出现紫红色条带，表明不正确的未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏或者是样本中抗体的含量操作过程或试剂盒已变质损坏或者是样本中抗体的含量过高。在此情况下用新的测试卡重新测试。如果问题仍过高。在此情况下用新的测试卡重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号试剂。然存在，应立即停止使用此批号试剂。 阴性反应 阳性反应失效（无意义）注意事项（一） 1、金标快速测试卡仅用于、金标快速测试卡仅用于 HIV抗体的现场初筛，抗体的现场初筛，对于所有使用本测试卡检测结果为阳性的样品必对于所有使用本测试卡检测结果为阳性的样品必须进行进一步确证须进行进一步确证 【 阳性标本请填写阳性标本请填写 艾滋病检艾滋病检测点测点 HIV抗体复检检测单抗体复检检测单 及时送县疾控中心复及时送县疾控中心复核检测核检测 】 。 初筛结果不得出具阳性报告。初筛结果不得出具阳性报告。 2、本测试卡仅用于人血清（浆）标本中、本测试卡仅用于人血清（浆）标本中 HIV抗体抗体的检测，其它体液和样品可能得不到准确的结果的检测，其它体液和样品可能得不到准确的结果。所以必须使用符合要求的检测标本。所以必须使用符合要求的检测标本。 3、样本的加样建议用微量加样器按试剂说明书、样本的加样建议用微量加样器按试剂说明书准确加入。准确加入。 4、实验环境应保持一定温湿度，避免在过高温、实验环境应保持一定温湿度，避免在过高温度下进行实验度下进行实验注意事项（二）5、测试卡从包装中取出后，应尽快进行实验，避、测试卡从包装中取出后，应尽快进行实验，避免放置于空气中过长时间，导致受潮。免放置于空气中过长时间，导致受潮。6、测试卡可在室温下保存，谨防受潮。低温下保、测试卡可在室温下保存，谨防受潮。低温下保存的测试卡应平衡至室温方可使用。存的测试卡应平衡至室温方可使用。7、不能使用超过效期的试剂。、