植生、生化实验解读--北大吴光耀

2011年精英教案第五届全国中学生物竞赛培训植生、生化实验解读课北京大学生命科学学院吴光耀 教授 1. 蛋白质测定 (1) 总 N量测定 有机 N(甘氨酸 ) + H2SO4 2CO 2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (NH4) 2SO4 + 2NaOH 2H 2O + Na2SO4 + 2NH3 NH4HB4O7+ HCl + 5H2O NH 4Cl + 4H3BO3 用酸滴定氨1. 蛋白质测定 (2) 双缩脲法 测两个以上的肽键 碱性环境双缩脲与 Cu+生成紫红色化合物 540nm (NH2) 2CO 2 NH 2-CO-NH-CO-NH2 +NH31. 蛋白质测定 (3) Folin-酚法 是改进的双缩脲法 640nm 同时测定了酪氨酸酚基。1. 蛋白质测定 (4) 紫外法 280nm 比色1. 蛋白质测定 (5) 考马斯亮蓝法 考马斯蓝 G-250可与蛋白结合 , 从红色染料转变成蓝色。 595nm 测定吸收值2. 核酸测定 (1) RNA 测定 地衣酚法 RNA + HCl 糠醛 (核糖转变 ) 糠醛 + 3,5-二羟基甲苯 (地衣酚 ) 鲜绿色 670nm比色2. 核酸测定 (2) DNA 测定 二苯胺法 DNA + 冰乙酸 羟酮基戊醛 (脱氧核糖转化 ) 羟酮基戊醛 + 二苯胺 蓝色 595nm 比色2. 核酸测定 (3) 定磷法 有机磷 + 高氯酸 无机磷 无机磷 + 磷钼酸 钼蓝 660nm 比色2. 核酸测定 (4) 紫外法 260nm 比色3. 质粒 DNA提取和测定 (1) 扩增质粒 LB + 氨苄青霉素 (2) 细菌裂解 +碱 (质粒 DNA出来 , 染色体 DNA变性 ) (3) 沉淀蛋白 +乙酸钾、酚 -氯仿 (4) 纯化质粒 DNA 水相质粒 DNA用乙醇沉淀 + RNase 溶于 Tris缓冲液中 (5) 260nm测定 , 或电泳测定4. DNA平板电泳 (1) 制胶 Tris-硼酸缓冲液 (TBE) + 1%琼脂糖 (2) 加液 TBE液 (3) 加样 样品 + 花青素 (4) 电泳 滤光板看 DNA移动过程5. PCR (Polymerase chain reaction) - DNA扩增 (1) 模板、引物、 dNTP、聚合酶、缓冲液、Mg+ (2) 过程 : 模板双链分开 结合引物 新链合成 (3) 可用毛囊 DNA Y染色体 DNA, 设计引物,PCR, 男有女无 .播放动画6. 层析 (1) 分配层析 纸层析、液相层析 (2) 吸附层析 活性碳、氧化铝 (3) 交换层析 离子交换剂 (4) 凝胶层析 Sephadex Sepharose S7. 糖的测定 (1) 萘酚反应 糖 + 酸 糠醛 +萘酚 紫环反应 (2) 蒽酮反应 糖 + 蒽酮 +硫酸 兰绿色7. 糖的测定 (3) 间苯二酚反应 酮糖 + 酸 羟甲基糠醛 +间苯二酚 鲜红色 (4) 甲基间苯二酚反应 戊糖 + 酸 糠醛 +地衣酚 兰色沉淀 己糖 - 褐色沉淀8. 还原糖测定 (有自由醛基 ) (1) 费林反应 葡萄糖 + Cu(OH) 2+ NaOH 氧化亚酮 红黄色9. 叶绿素性质 双羧酸的酯 酯溶性 . 非极性溶剂 (正己烷、石油醚 ) 荧光 +HCl 去镁叶绿素 +乙酸铜 铜代叶绿素 +NaOH 皂化10. 线粒体氧化磷酸化 磷氧比 (P/O): 这一电子传递链过程中 , 形成ATP的量与消耗氧分子之间的比为磷氧比11. 希尔用离心机分离了菠菜叶绿体 , 他在分离叶绿体中加入氧化态的氧化还原剂 -2,6二氯靛酚 (DCIP) 后照光 , 发现 DCIP被还原 (氧化态兰色 , 还原态无色 ), 并有氧的释放 。回答问题 :(1) 你认为分离叶绿体要下述哪些条件 A. 一定 pH的缓冲液 B. 溶液有一定的渗透势 C. 离心分离的叶绿体用水悬浮 D. 离心时 ,离心速度愈高愈好 E. 在摄氏 4度操作和离心最好 F. 在室温操作最好回答问题 :(1) 你认为分离叶绿体要下述哪些条件 A. 一定 pH的缓冲液 B. 溶液有一定的渗透势 C. 离心分离的叶绿体用水悬浮 D. 离心时 ,离心速度愈高愈好 E. 在摄氏 4度操作和离心最好 F. 在室温操作最好回答问题 :(2) 你认为这一实验证明了什么 ? 光反应产生氧 B. CO2被还原 C. 光反应产生还原剂 D. 水被光解回答问题 :(2) 你认为这一实验证明了什么 ? 光反应产生氧 B. CO2被还原 C. 光反应产生还原剂 D. 水被光解希尔进一步实验 , 他将分离叶绿体悬液破碎 , 离心 , 分成绿色的沉淀和无色的上清液两部分 , 沉淀再用缓冲液悬浮。发现绿色部分照光可放氧 , 如将两部分在暗处混合 , 加入 14CO2, 一定时间后 ,则 14C被标记在六碳糖上。 回答问题 :(1) 上述进一步实验说明什么 ? A. 光合作用可分为需光和不需光两部分 B. CO2固定是不需光的 C. 氧的释放要光 D. 水的氧化要光 E. 水的还原要光 F. 光产生还原剂 G. 还原剂用于 CO2还原 H. 光通过叶绿体起作用 I. 六碳糖可氧化产生 CO2回答问题 :(1) 上述进一步实验说明什么 ? A. 光合作用可分为需光和不需光两部分 B. CO2固定是不需光的 C. 氧的释放要光 D. 水的氧化要光 E. 水的还原要光 F. 光产生还原剂 G. 还原剂用于 CO2还原 H. 光通过叶绿体起作用 I. 六碳糖可氧化产生 CO2回答问题 :(2) 实验中能否用 NaH14CO3代替 14CO2 A. 不能 B. 能回答问题 :(2) 实验中能否用 NaH14CO3代替 14CO2 A. 不能 B. 能 单选题1、这是 Stitt研究果糖 1， 6-双磷酸酯酶（ F1， 6Pase）被调节的一个实验结果，图中表明在磷酸二羟丙酮（ DHAP）增