流式细胞术在肿瘤学中的应用马丽5

流式细胞术在肿瘤学中的应用贵阳医学院附属医院中心实验室马莉什么是流式细胞仪？（ Flow Cytometer,FCM) 在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheathfluid流式细胞术流式细胞术是应用流式细胞仪对悬浮液中的细胞流式细胞术是应用流式细胞仪对悬浮液中的细胞或细胞器进行快速测量和多参数检测的细胞分析或细胞器进行快速测量和多参数检测的细胞分析技术，是上世纪技术，是上世纪 70年代在单细胞分析和分选基础年代在单细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞理化特性，诸如大小、上发展起来的对细胞理化特性，诸如大小、 DNA、 RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并分类收、蛋白质、抗原等进行快速测量并分类收集的高科技技术。它综合了激光技术，计算机技集的高科技技术。它综合了激光技术，计算机技术，流体力学，细胞化学，单克隆抗体，荧光化术，流体力学，细胞化学，单克隆抗体，荧光化学，分子生物学等各门学科，在对细胞群体的亚学，分子生物学等各门学科，在对细胞群体的亚群进行定量分析时，具有其它手段无法比拟的优群进行定量分析时，具有其它手段无法比拟的优越性。越性。流式细胞仪特点及检测标本 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析； 可检测的样本种类多样(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 细胞周期及 DNA倍体分析在临床肿瘤中应用 免疫指标检测在临床肿瘤中应用 监测癌基因与抗癌基因表达在肿瘤发生发监测癌基因与抗癌基因表达在肿瘤发生发展中的作用展中的作用 监测分析肿瘤多药耐药 细胞凋亡流式细胞周期与 DNA倍体分析的基本原理通过 DNA检测进行细胞周期分析细胞周期： G0、 G1、 S、 G2 、 M细胞周期中 DNA含量： G0/G1-2C（二倍体）S期 -2C 4C、 G2/M-4C（四倍体） DNA荧光染料特异性与细胞 DNA结合 DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度与 DNA所吸收荧光分子多少成正比。 最常用的荧光染料：碘化丙啶（ PI）FCM分析细胞周期的基本方法DNA含量的表示 细胞群的 DNA含量在 FCM中一般以 DNA指数（ DNA index， DI)表示相对含量，一个正常的二倍体细胞峰，其 G0/G1期细胞DNA含量为 2C， DI值为 1.0。 DI=（样本 G0/G1期细胞峰平均荧光道数） /（正常二倍体标准细胞 G0/G1期细胞峰平均荧光道数）DNA倍体的判定标准 二倍体的 DI为 1.0，四倍体的 DI为 2.0。 变异系数（ CV）：标准细胞 CV 3%， 新鲜组织标本 5%。 DNA倍体判定标准， DNA非整倍体具有 2个分离的 G0/G1峰，并根据 DI值判断 DNA倍体。对于一个正常人体的二倍体细胞群， G0/G1期占 85-90%以上，S+G2M细胞占 10-15%以下。 以二倍体参考细胞 G0/G1期细胞 DNA含量定为 2C值 DI=1.0，基于标准二倍体细胞的 CV在 5%以下，判定标准即； DNA二倍体 =2C+2CV， DNA异倍体不等于2C+2CV。 1. DI = 1.0 0.1 (0.91.10) 为二倍体。 2. DI = 1.0 0.15 (0.851.15) 为近二倍体。 3. DI = 2.0 0.1 (1.902.10) 为四倍体。 4. DI 2.10为多倍体 5. 其余 DI均为异倍体。流式细胞周期与 DNA倍体的分析方法 （一）单细胞悬液制备 1、新鲜或冰冻实体组织：酶消化法、 机械法 、化学试剂处理法等。 剪碎法：取新鲜或冰冻（浸泡于生理盐水中）实体组织 0.5cm3，眼科手术剪剪碎，加入生理盐水， 300目尼龙膜过滤， 200g离心 5min，生理盐水洗涤二次。 半自动机械法单细胞制备系统：是目前较为理想的方法，简便，实用，单细胞获取率较高，特别适用于临床应用。 由于各种实体组织成份、特性各不相同，对不同的实体组织必须采用不同的单细胞分散方法，才能使单细