下呼吸道感染细菌培养操作规范

ICS点 击 此 处 添 加 中 国 标 准 文 献分 类 号 WS中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准 XX/T XXXXX XXXX下呼吸 道 感染 细 菌 培养操 作 规 范Standard for Bacterial Culture Procedures of Lower Respiratory Tract Infections点 击 此 处 添加 与国 际标 准 一 致性 程度 的 标识（ 报 批稿）（本 稿 完 成 日 期 ：）XXXX - XX - XX 发 布 XXXX - XX - XX 实 施中 华 人 民 共 和 国 国 家 卫 生 计 生 委 员 会 发 布1XX/T XXXXX XXXX目 次前言 . 4引言 . 51 范 围 72 术 语 及 定 义 72.1 支 气 管 肺 泡 灌 洗液 72.2 保 护 毛 刷 标 本 72.3 库 什 曼 螺 旋 纤 维 72.4 夏 科 雷 登 结 晶 72.5 弹 性 纤维 72.6 纤 毛 柱 状 上 皮 细 胞 82.7 肺 泡 巨 噬 细 胞 83 分 析前 83.1 标 本 采集 83.1.13.1.23.1.33.1.43.1.5咳 痰 8气 管 吸 出物 8血 培养 8诱 导 痰 （ 通 常 不用 于 细 菌 培 养 ） 8气 管 镜 标 本 83.2 标 本 运送 93.3 筛 选 并 拒 收 下 呼 吸道 细 菌 培 养 标 本 94 分 析中 94.1 痰 及 气 管 吸 出 物 标 本 处 理 94.1.14.1.24.1.34.1.44.1.5标 本 处 理 要 求 9接 种 标 本 9培 养 9标 本 涂 片 及 革 兰 染 色 . 10显 微 镜 观 察 革 兰 染 色 结 果 . 104.2 气 管 镜 标 本 处 理 . 104.2.14.2.24.2.34.2.44.2.5支 气 管 肺 泡 灌 洗液 定量 培 养 . 10保 护 毛 刷 定 量 培 养 . 11接 种 其 他 培 养 基及 培养 . 11革 兰 染 色 标 本 处 理 . 11剩 余 BAL 标 本 检测 其他 病 原 . 114.3 连 续 培 养 并 观 察 慢生 长 菌 . 114.4 分 离 并 鉴 定 下 呼 吸道 重要 致 病 菌 （ 参 见 附 录 C） 112XX/T XXXXX XXXX4.4.14.4.24.4.34.4.44.4.54.4.64.4.74.4.84.4.9链 球 菌 属 . 11苛 养 革 兰 阴 性 杆菌 （在 麦 康 凯 平 板 上 难 生 长 ） . 12革 兰 阴 性 双 球菌 . 12革 兰 阴 性 杆 菌 （在 麦康 凯 平 板 上 生 长 良 好） . 12葡 萄 球 菌属 . 13肠 球 菌 属 . 13革 兰 阳 性 杆 菌 . 13鉴 定 丝 状 真 菌 . 13涂 片 时 可 见 但 培养 不生 长 的 细 菌 . 134.5 质 量 控制 . 134.5.14.5.24.5.34.5.4革 兰 染 色 . 13抗 酸 染 色 . 13培 养基 . 14试 剂 . 145 分 析 后 报 告 结 果 . 145.1 革 兰 染 色 报 告 . 145.1.1 痰 标 本 报 告 原 则 （ 见 表 1） 145.1.2 BAL 细 胞 离 心 涂片 报 告 155.2 报 告 有 临 床 意 义 的微 生物 . 165.2.15.2.25.2.35.2.45.2.5报 告 的 病 原 菌 . 16培 养 和 涂 片 相 符 合 时报 告 的 病 原菌 . 16有 临 床 意 义 的 数 量 . 16报 告 有 临 床 意 义 数 量的 非 优 势 菌 . 16报 告 有 临 床 意 义 数 量的 优 势 菌 . 165.3 对 非 致 病 菌 的 报 告 . 175.3.15.3.25.3.35.3.4报 告 “ 肠 杆 菌 科革 兰 阴 性 菌 ” 17报 告 “ 非 发 酵 革 兰 阴性 杆 菌 ” . 17只 生 长 肠 球 菌 和凝 固 酶 阴 性 葡 萄 球 菌 . 17报 告 “ 分 离 到 口咽 部正 常 菌 群 ” 175.4 平 板 上 无 细 菌 生 长 . 175.5 结 果 解 释 . 17附 录 A（ 规 范 性 附 录 ） 附 录 B（ 规 范 性 附 录 ） 附 录 C（ 规 范 性 附 录 ）下呼 吸 道 感 染 主 要 类 型 及 常 见 病 原体 . 18支气 管 镜 采 集 的 标 本 适 合 诊 断 的 病 原 体 和 检 验 项 目 . 19常 见 可 疑 菌 落 形 态 及 经 典 快速 鉴 定 方 法 . 20参考 文 献 223XX/T XXXXX XXXX前 言本 标 准 按 照 GB/T 1.1给 出 的 规 则 起 草 。 本 标 准 由 卫 生 部 临 床 检 验 标 准 专 业 委 员 会 提 出 。本 标 准 起 草 单 位 ： 卫 生 部 临 床 检 验 中 心 、 陕 西 省 人 民医 院 、 安 徽 省 立 医 院 、 卫 生 部 北 京 医 院 、 北京大学 人 民 医 院 、 中 国 医 学科 学院 北 京 协 和 医 院 、 首 都医 科大 学 附 属 北 京 友 谊 医 院 、 解放 军 总 医 院 、 浙 江 省 温 州 医 科 大学 附 属 第 二 医 院本 标 准 主 要 起 草人 ： 胡 继 红 、 任 健康 、 马 筱 玲 、 胡 云 建 、 王 辉 、 徐 英 春 、 苏 建 荣 、 罗 燕 萍 、 李 向 阳4XX/T XXXXX XXXX引 言1.口 咽 部 定 植 菌 群 变 化 对 肺部 感 染 的 重 要 影响 在 人 类 口 咽 部 位 定 植 着 大 量 需 氧 菌 、兼 性 厌 氧 菌 和 厌 氧 菌 等 微 生 物 ， 口 腔 菌 群 总 数 可 达 1010CFU/mL 1012CFU/mL。 健 康 人咽 部 定 植 细 菌 最少 ，咽 部需 氧 的 正 常 菌 群主 要由 革 兰 阳 性 菌 组 成 。 人 体基础 条 件 的 变 化 会 改 变 咽 部 定植 菌 群 的 种 类 和 数 量 。 长 期 接 触 某 些 携 带 侵 袭 性 定植 菌 人 群 ， 如日托儿童 的 父母 的 肺 炎 链 球 菌 、 流 感 嗜血 杆 菌 定 植 数 量 会 增 加 ； 在 免 疫 抑 制 、 慢 性 肺 病 、 广 谱 抗 菌 药 物 治 疗 或住 院 患者等 人 群 中 ， 革 兰 阴 性 杆菌 的 优 势 明 显 增 加 。 因 此， 口 咽 部 菌 群 变 化 对 肺 部感 染 有 着 重 要 影 响 。2.肺 部 感 染 的 常 见 机 制 肺部 感 染 的 最 常 见 机 制 是 肺泡 内 吸 入 了 口 咽 部 定 植 菌 ， 吸 入 性 肺 炎 患 者 咽 部菌 群种类 趋 向 于 侵 袭 性细 菌 或 耐 药 细 菌 ， 如 肺炎 链 球 菌 或 革 兰 阴 性 杆菌 。 健康 宿 主 吸 入 口 腔 定 植 菌 后常 无 临 床 症 状 ， 细 菌通常 被粘 液 柱 状 纤 维 清 除 。 因 此 ， 吸 入 能 否 引 起 肺 部感 染取 决 于 吸 入 菌 的 致 病 性 及数 量 ， 患 者 免 疫 系 统 和 呼 吸道功 能 等 诸 方 面 的 因 素 。吸入 气 溶 胶 引 起 的 肺 部 感 染占 第 二 位 ， 主 要 原 因 是 使用 了 不 清 洁 的 呼 吸 机。 血 液 播 散性 肺 炎 占 第三 位，感 染 通常 造 成 双 肺下 叶 肺炎 。 由呼 吸 道 感 染引 发 的菌 血 症 占 12%，因此对 肺 部 感 染 的 高 热 患 者 送 检 血 培 养 ， 有 利 于 发 现 肺 部感 染 的 病 原 菌 。3.痰 涂 片 对 下 呼 吸 道 感 染 病原 菌 诊 断 的 重 要 作用 下 呼 吸 道感 染 类 型及 常 见 病 原 见 附 录 A。 除 引起 社区 非 典型 肺 炎 的 病原 不 能 常 规 培养 外 ， 其 他 常 见肺部 感 染 的 病 原 菌 均 可 常 规 培 养 方 法 分 离 。 但 培 养 方法 敏 感 性 低 ， 无 法 判 断 分离 菌 的 来 源 。 涂片 革 兰 染 色方 法 对 于 评 价痰 标 本 是 否 合 格 、 提 高 病原 菌 诊 断 的 特 异 性 起 到 了重 要 作 用 。 涂片 还 可发现 培 养 不 能 生 长 的 细 菌 。因 此 ， 涂 片 方 法 提 高 了 培养 方 法 的 特 异 性 及 敏 感 性。4.支 气 管 纤 维 镜 标 本 定 量 培养 的 临 床 意 义 支气 管 肺 泡 灌 洗 液 和 保 护 毛刷 标 本 适 合 用 做 定 量 细 菌培 养 ， 对 菌落 数 大 于 阈 值 的 细 菌 报 告 下 呼吸道感染 的 致 病 菌 ， 特 异 性 达 82% 91%， 诊 断 价 值 远 高于 痰 标 本 ， 但 因 其 有 创 的 采 集方 式 而 不 易 获 取 。 支气 管纤 维 镜 采 集 的 标 本 类 型 及适 合 检 验 项 目 见 附 录 B。5.下 呼 吸 道 感 染 细 菌 培 养 的局 限 性 培 养 结 果 假 阴 性 的 原 因 大 致包 括 ： 培 养 方 法 不 支 持 所有 致 病 菌 生 长 、 采集 标 本前 患 者 使 用 了抗菌 药物 、 延 误 了 送 检 时 间 、 口 腔正 常 菌 群 污 染 了 标 本 等 ； 定 量 培 养 的 菌 落 数 接 近 阈 值 时 结 果 不 易解 释 ； 而 假 阳性 报 告 可 因 过 度 解 读 结 果， 把 非 致 病 菌 当 作 致 病 菌 报 告 ， 从 而 误 导 医 生 治 疗 ， 也 会 造 成 严 重 后 果 。5XX/T XXXXX XXXX下 呼吸 道 感染 细 菌 培养 操 作 规 范1 范 围本 规 范 旨 在 为 医 疗 机 构 微 生物 实 验 室 推 荐 常 规 细 菌 培养 方 法 检 测 下 呼 吸 道 感 染病 原 菌 的 检 验 流程 ， 既痰 （ 细 菌 ） 培 养 项 目 。 明 确了 肺 部 感 染 患 者 下 呼 吸 道 标 本 适 合 诊 断 的 病 原 和 检验 项 目 ； 要 求 细 菌培 养 同 时做 革 兰 染 色 涂 片 ； 规 范了 下 呼吸 道 标 本 的采 集 、运 送 、痰 涂 片 标 本合 格 判 断 ， 痰 /气 管吸 出物定性 和气 管 镜采 集 标 本 定 量 细 菌培 养 程 序 ， 病 原 菌 筛 查 和 判断 ， 结 果 报 告 的 临 床 意 义 和格 式 内 容 等 操 作 流程 。2 术语 及 定 义2.1支 气 管 肺 泡 灌 洗 液 bronchoalceolar lavage； BAL利 用 纤 维 支 气 管 镜 向 支气管 肺 泡 内 注 入无 菌生 理 盐 水 灌 洗 ， 抽 吸并 收集 肺泡灌 洗 液 ， 通 过检 查 其 细 胞成份 、 可溶 性 物 质 和感 染性病 原 菌 ， 诊 断 肺 部 相 关 疾 病 、 评 价 疗 效和 预 后 。2.2保 护 毛 刷 标 本 protected specimen brushings;PSB通 过纤 维 支气 管 镜 在 亚 段 支气管 处 找到 脓 性分 泌物 部位， 推 出 双 层 套管 中毛 刷 远 端 填 塞的 聚 乙 二 醇， 伸 出 毛 刷 ， 刷 取 脓 性 分泌 物 ， 将 毛 刷 退 回 双 层 套管 取 出 后 ， 剪 下 毛 刷 送 检 。 因 操 作 过 程有双 层 套 管 保 护 ，毛 刷 采 集 的 标 本 避 免了 上 呼 吸 道 及 口 腔 定 植 细 菌 的 污 染 。2.3库 什 曼 螺 旋 纤 维 Curschmanns spiral fibers呈毛 虫 状 蜷 曲 ， 革 兰 染 色可 见 中 轴 蓝 染 ， 边 缘 淡 红 色 。 因慢 性 炎 症 时 细 支 气 管 分 泌的 粘 液 浓 缩 而成 。2.4夏 科 雷 登 结 晶 Charcot-Leyden Crystal可 见 于 支 气 管 ， 为 菱 形 或 针 状 六 边 形 无 色 透 明 结 晶 ， 其 两 端 尖 长 ， 大 小 不 等 ， 折 光 性 强 ， 由嗜酸粒 细胞 破 裂 后 嗜 酸 性 颗 粒 相 互融 合 而 成 , 可 用 碘 染 色 。 可 在 稍 放 置 的 痰 中 找 到 嗜酸 性 粒 细 胞 堆 。 在 对 烟曲 菌有 变态 反 应 的 哮 喘 患 者 或肺 部 感 染 寄 生 虫 患 者 的 痰液 中 常 见 。2.5弹 性 纤 维 elastic fibers肺 组 织 有 破 坏 性 病 变 如 肺 脓肿 、 肺 癌 等 时 ， 痰 中 可 出 现 弹 性 纤 维 ， 证 明 痰 液 标 本 来 自 下 呼 吸 道 。2.66XX/T XXXXX XXXX纤 毛 柱 状 上 皮 细 胞 ciliated columnar epithelium cell纤 毛柱状 上 皮 细 胞 主 要分 布 在 下 呼 吸 道 内 表 面 ， 在 柱 状 细 胞 的 游 离 面 附 有能 摆 动 的 纤 毛 ， 是能分 泌 粘液的 杯 状 细 胞 ， 分 泌 的粘 液能 粘 着 并 清 除 灰 尘 和 细 菌等 异 物 ， 借 助 纤 毛 有 节 律 性的 摆 动 ， 将 含 有 灰 尘 、 细 菌 的粘 液 排 除 至 喉 部。2.7肺 泡 巨 噬 细 胞 alveolar macrophages来自 血 中 单 核 细 胞 ， 脱 落 的 型 肺 泡 上 皮 或 肺 泡 间 隔 细 胞 。 细 胞 体 积 大 ， 胞 质 丰 富 ， 核 圆 形 、 卵 圆 形或 肾 形 ， 略 偏 位 ， 染 色 质细 致 均 匀 ， 偶 见 核 仁 ， 涂片 中 有 巨 噬 细 胞 证 明 痰 液 标 本 来 自 下 呼 吸 道 。3 分析前3.1 标 本采集3.1.1 咳痰a) 咳痰 前 ， 患 者 用 无 菌 生 理 盐 水 漱 口；b) 指 导 患 者 咳 出 深 部 痰 ， 勿 留取 唾 液 和 鼻 咽 腔 分 泌 物 。3.1.2 气管 吸 出物当 气 管 插 管 的 患 者 出 现 肺 炎症 状 时 ， 从 气 管 中 吸 痰 留取 气 管 吸 出 物 标 本 。注 ： 仅 当出 现 肺炎的 临 床表 现 （如 发热 或浸 润 ） 时 采集气管吸出物 标 本 ， 否 则 勿培养气管吸出物 ， 因气管在插管24h 后即有定植菌，培养 结 果可能与疾病不符。3.1.3 血培养当下 呼 吸 道 感 染 患 者 伴 有 高 热 症 状 时 ， 送 检 血 培 养 （具 体 参 考 血 培 养 标 本 采 集和 送 检 要 求 ） 。3.1.4 诱导 痰 （ 通 常 不 用 于 细 菌 培养）a) 当咳 痰 困 难 时 ， 先 用 湿 牙 刷清 洁 口 腔 粘 膜 、 舌 头 和 牙 龈 ， 勿 用 牙 膏 ；b) 再用 无 菌 水 或 生 理 盐 水 漱 口；c) 用超 声 雾 化 器 ， 患 者 吸 入 约 20mL 30mL 的 3% NaCl 后， 留 取 标 本。3.1.5 气管 镜 标 本3.1.5.1 采集 气 管 镜 标 本 注 意 事 项a) 气管 镜 可采 集 到感 染 部 位 高 质 量 的 标 本 ， 包 括 支 气 管肺 泡 灌洗 液 标 本 （ BAL） 、支 气 管灌 洗 液 标本（ bronchial washings,BS)、 保 护 毛刷 标 本（ PSB）及 支 气管 穿 刺活 检 标 本 ，均由 呼吸 科 医生或 经 培 训 医 生 采 集；b) 为 防 止 污 染 ， 应 采 用 吸 入 麻醉 剂 ， 勿 从 工 作 腔 中 吸 取灌 洗 液 标 本；c) 标 本 采 集 顺 序 为 ： 支 气 管 灌洗 液 （ BS） 、支 气 管 肺 泡灌 洗 液 （ BAL） ， 保 护 毛 刷和 活 检标 本 ， 避免 带 血。3.1.5.2 支气 管 肺 泡 灌 洗 液 标 本 (BAL)7XX/T XXXXX XXXX用 不 少 于 140mL 无 菌 生理 盐 水 灌 洗 小 支 气 管 和 肺 泡 ， 40mL 80mL 回 收的 灌洗 液 中 包 含 约 1mL 支气 管末梢 和 肺 泡 中 的 分 泌 物 ；弃 去 前 段 可 能 污 染 部 分 ，收 集 其 余 部 分 后 立 即 送 检 。3.1.5.3 保 护 毛 刷 (PSB)保 护 毛 刷 因 有 双 层 套 管保 护 ， 不 易 污 染 上 呼吸 道和 口 腔 定 植 菌 。 用 无菌 剪刀 剪 断 毛刷 ， 置 于含 1mL生理 盐 水 的 无 菌 容 器 中 （ 仅 供 需 氧 培 养 ） ， 快 速 送 检 。3.2 标 本 运 送用无 菌 防 漏 容 器 收 集 标 本 ， 贴 好 标 本 信 息 （ 条 码 ） 后， 在 1h 2h内 （ 室 温 ） 送至 微 生 物 实 验 室。注 1： 若送 检标 本超 过 2h，将 导 致 有 临 床意 义 的致病 菌 数量减少，非苛养的口咽部定植菌 过 度生 长 。 为 防止口咽部 正常菌群的 过 度生 长 ， 可将 标 本放置 2 8 环 境 ， 但培 养 分离到肺炎 链 球菌等苛养菌的机会和数量会减少。注 2： 若 标 本延 迟 送 检 超 过 2h 后未 冷 藏 （超 过 2h 24h， 2 8 ）， 应 在 报 告中 说 明因延 误 送 检标 本，可能 对培 养 结 果造成的影响。3.3 筛 选 并 拒 收 下 呼 吸 道 细 菌 培养 标 本a) 拒收 24h 内 重 复 采 集 的 痰 细 菌 培 养 标 本b) 唾液c) 鼻冲 洗 液 和 分 泌 物 、 鼻 孔 拭子d) 咽部 标 本e) 未 经 保 护 套 管 收 集 的 支 气 管刷 培 养 标 本f) 痰的 厌 氧 菌 培 养 标 本注 ： 除支气管穿刺吸出物、 PSB、 活 检标 本、胸水或其他未 经污 染以外的 标 本做 厌 氧菌培养均不合格。g) 诱导 痰注 ： 诱导 痰 标 本只适用于 检测 卡氏肺 孢 子菌和 结 核分枝杆菌， 对 其他病原菌 检 出效果差。4 分析中4.1 痰及 气 管 吸 出 物 标 本 处 理4.1.1 标 本 处 理 要 求a) 接种 标 本 及 涂 片 操 作 必 须 在 级 生 物 安 全 柜 中 进 行 ；b) 应 在 接收 后 1h 内 尽 快 处 理 所有 标 本 ， 特 别 是 来 自 急 诊 、 新 入 院 患 者 和 有 创 方 法 采 集的 标 本 （ 如 ： BAL 和 肺 活 检 标 本 ） ， 以 保 证 致 病 菌 的 活 性 ， 避 免 造成 重 复 采 集 标 本；c) 使用 全 自 动 接 种 前 处 理 系 统 的 实 验 室 按 厂 家 说 明 书 处 理 标 本 ， 洗 痰 、 液 化 后自 动 接 种 和 涂片 革 兰染 色 。4.1.2 接种 标 本用无 菌 拭 子 挑 取 脓 性 或 无 血部 位 痰 或 气 管 吸 出 物 ,分 别 接 种 血 平 板 、 巧 克 力 平板 和麦 康 凯 /中 国 兰 平 板，分 区 划 线 后 立 即 培 养 。4.1.3 培养将接种 的 血平板、巧克力平板放 二 氧化碳培养箱 （ 5% 10%CO2）、麦康 凯 /中国 蓝 平 板 放普通培养 箱，35 37 条 件 下 培 养 24h 48h， 血 平 板 、 巧 克力 平 板 最 好 培 养 至 72h。8XX/T XXXXX XXXX4.1.4 标 本 涂 片 及 革 兰 染色接种 平 板 后 ， 用 刚 接 种 平 板的 拭 子 重 新 挑 取 脓 性 或 无血 部 位 痰 或 气 管 吸 出 物 涂抹 玻 片 ， 涂 片 应 薄且 均 匀（ 透 过 涂 片 部 位 可 看 清楚 下 面 印 刷 品 的 字 迹 ） 。 自 然 干 燥 或 恒 温 干 燥 器 上干 燥 后 ， 经 甲醇固 定 （ 化 学 纯 ， 在棕 色 玻 璃 瓶 或 塑 料容 器 中 贮 存 ） 或 火 焰 快 速固 定 3次 ， 革 兰 染 色 ，晾 干后 读 片。注 1： 革 兰 染色脱色 时间 因 选 用不同的脱色 剂 而异。 1） 95%乙醇 脱 色 时间为 30s； 2）丙 酮 -乙 醇 （ 体 积 比 为 3:7,棕 色瓶室温保存 ， 有效期 1 年 ） 脱色 时间 1s 5s， 脱色效果 一 致性好 ； 3） 丙 酮 （ 试剂纯 ） 脱 色 时间 最短 ，当 标 本中含大量宿主 细 胞 时 脱色效果好。注 3： 使用革 兰 染色 仪 染色的 实验 室按照厂家操作 说 明 书进 行，注意条件 优 化，使涂片染色 结 果达到 满 意效果。4.1.5 显 微 镜 观 察 革 兰 染 色 结 果痰 涂 片 在低 倍 物 镜 下 检 测 20个 40个 视 野， 气 管 吸出 物涂 片 分 别 在 低 倍 镜 视 野 （ LPF） 和 油 镜 视 野（ OIF） 下 观 察 。 计 算 有 细 胞 视 野 的 细 胞 平 均 数 量 ， 记录 鳞 状 上 皮 细 胞 （ SECs） 和 多 形 核 白 细 胞 （ WBCs) 的数 量 。注 1： 低倍 镜 下 细 胞 计 数： 1+（偶 见 ） ：少于 1 个 /LPF； 2+（少 量 ） ： 1 个 9 个 /LPF； 3+（ 中 量）： 10 个 25 个/LPF； 4+（大量）：大于 25 个 /LPF.注 2： 油 镜 下 细 菌 计 数 ： 1+（偶 见 ）： 少于 1 个 / OIF； 2+（少量 ）： 1 个 5 个 / OIF； 3+（中量 ）： 6 个 30 个 /OIF； 4+（大量）：大于 30 个 /OIF.4.2 气管 镜 标 本 处 理4.2.1 支气 管 肺 泡 灌 洗 液 定 量 培 养4.2.1.1 混匀 标 本用力 涡 旋 震 荡 BAL标 本 30s 60s。4.2.1.2 平板 计 数 （ 102CFU/mL）用 经 校 准 的 加 样 器 （ 或 经 验证 的 10 L接 种 环 ） 取 10 l BAL标 本 ， 分 别 点 种 血 平板 和 巧 克 力 平 板 (已 回复 至 室 温 ） ， 再 用 灭 菌 L型玻 棒 涂 布 平 板 。 培 养 后 菌落 计 数 ： 菌 落 数 =相 同形 态 菌 落 数 100CFU/mL。4.2.1.3 平板 计 数 （ 103CFU/mL）方法 1： 用 1 L 定 量 接 种 环 （ 经 验 证 ） 取 1 环 BAL 标 本 ， 分 别 接 种 血 平 板和 巧克 力 平板 ， 用无 菌 L 型 玻棒 涂 布 平 板 ； 培养 后 菌 落 计 数 ： 菌 落 数 =相同 形 态 菌 落 数 1 03CFU/mL。方法 2：取 1 只 标 记 “1 :100” 含 5ml 磷 酸 缓 冲 液 （ PBS） 试 管 ，加 入 50 l BAL 原 液 标 本 ， 涡 旋 震 荡 ；再 从 中 取 100 l 分 别 接 种 血 平 板 和 巧 克力 平 板 ， 用 灭 菌 L 型 玻 棒涂 布 平 板 。注 1： 磷酸 缓 冲液配制： 0.067mol/L Na2HPO3 70ml 与 0.067mol/L KH2PO3 30ml 混合 （ pH7.2),高 压 灭 菌后使用。注 4： 若用接种 环 密涂平板，生 长 的菌落数量会低于 实际 数量。但用 L 棒涂布平板 计 数，定量 培 养 结 果更准确。4.2.1.4 平板 计 数 （ 105CFU/mL）取 1 只 标 记 “ 1:104” 含 5ml PBS 试 管 ， 加入 50 L 经 1:100 稀 释 的 标 本 （ 见 4.2.1.3 方法 2）， 涡旋 震 荡 ； 从 中 取 100 L 分 别 接 种 血 平 板 和 巧 克 力 平 板 ， 用 灭 菌 L 型 玻 棒 涂 布平 板 ； 培 养 后 菌 落 计 数： 菌落 数 =相 同 形 态 菌落 数 1 03CFU/mL。4.2.2 保 护 毛 刷 定 量 培 养9XX/T XXXXX XXXX4.2.2.1 混匀 标 本将 1mL带 毛 刷 的 标 本 管 用力 涡 旋 震 荡 30s 60s。4.2.2.2 平板 计 数 （ 10CFU/mL）用加 样 器 取 100 L标 本 分 别 接 种 血 平 板 和 巧 克 力 平 板 ， 用 无 菌 L型 玻 棒 涂 布平 板 ， 培 养 后 菌 落 计 数 ： 菌落 数 =相 同 形 态 菌 落 数 10CFU/mL。4.2.2.3 平板 计 数 （ 102CFU/mL）用加 样 器 取 10 L标 本 （或 用 10 L接 种 环 ） 分 别 接种 血平 板 和巧 克 力 平 板， 用 无菌 L棒 涂 布 平 板 ， 培养后 菌 落 计 数 ： 菌 落 数 =相同 形 态 菌 落 数 1 02CFU/mL。4.2.2.4 平板 计 数 （ 103CFU/mL）方法 1：用 1 L 接 种 环 取 1 环 PSB 标 本 ， 分 别 接种 血平 板 和 巧 克 力 平 板 ， 用 无菌 L 棒 涂 布 平板 ； 方法 2：取 1 只 标 记 “1 :100” 的装 有 5mL 磷 酸 缓 冲 液 试 管 ， 加 入 50 L PSB 原液 标 本 ， 涡 旋震 荡 ，从中 取 100 L 分 别 接 种 血 平 板 和 巧 克 力 平 板， 用无 菌 L 型 玻 棒 涂 布 平板； 培养 后 菌 落 计 数 ：菌 落 数 =相同 形 态 菌 落 数 1 03CFU/mL。4.2.3 接种 其 他 培 养 基 并 培养完 成 血 平 板 和 巧 克 力 平 板 稀 释 涂 碟 后 ， 可 取 100 LBAL标 本 或 PSB标 本 接 种 麦康 凯 或 中 国 蓝 培 养 基。 培养 步 骤 同 4.1.3； 对 有 创 方式 采 集 的 肺 组 织 标 本 应 延 长 培 养 至 4天。4.2.4 革 兰 染 色 标 本 处 理在完 成 标 本 定 量 培 养 后 ， 取适量 BAL标 本 进 行 细 胞离 心； 保 护 毛 刷 标 本 可直 接 涂片 。 经 自 然 干 燥 、 甲醇 固 定 或 火 焰 快 速 固 定 3次， 革 兰 染 色。4.2.5 剩余 BAL 标 本 可 用 于 其 他 病原 检 测对 剩余 BAL标 本离 心 后 ，可 根据 需 要 进 行 病 毒 、分 枝 杆菌 、 军团 菌 和 真 菌培 养 ；或 做 病毒 、 卡 氏 肺 孢子 菌 、 抗 酸 染 色 和 真 菌 涂片 染 色 （ 见 参 考 文 献 4的 第六 篇 相 关 章 节 ） 。4.3 连 续 培 养 并 观 察 慢 生 长 菌观 察 定 性培 养 18h 24h后 的平 板 ,为 检 出 可 能 生 长 的 丝 状 真 菌、 慢 生 长 菌、 苛 养的 革 兰 阴 性 杆 菌 如 博德 特 菌属 (Bordetella spp.)， 平板 在 检 查 后 继 续 培养至 48h后 ，再 观 察 培养 48h的 平 板 ， 可能 发 现 培 养 24h未 发 现 的 细 菌 形 态 。4.4 分离 并 鉴 定 下 呼 吸 道 重 要 致病 菌 （ 参 见 附 录 C）4.4.1 链 球 菌 属4.4.1.1 - 溶 血 链 球菌a) 检查 -溶 血 菌 落 并 鉴 定触 酶 阴 性 且 呈 链 状 或 成 对 排 列的 球 菌；b) 用 吡 咯 烷 酮 芳 胺 酶 （ PYR） 试验 鉴 定 化 脓 链 球 菌 ； 或 密涂 后 粘 贴 杆 菌 肽 纸 片 （ 0.04U/片 ） ， 35 过夜 培 养 ， 若 有 抑 菌 环 ， 则报 告 化 脓 链 球 菌 ， 任 何 数量 均 应 报 告；10XX/T XXXXX XXXXc) 患儿 标 本 检 查 是 否 有 窄 溶 血 环 ， 并 鉴 别 B 群 链 球 菌 （无 乳 链 球 菌 ）， 若 CAMP 试验 （ 金 黄色 葡 萄球 菌 ） 阳 性 ， 则 任 何 数 量 均 应 报 告 ；d) 鉴 定 其 他 有 临 床 意 义 数 量 的 优 势 生 长 -溶 血 链 球菌 ；注 ： 不必 报 告小菌落的 -溶血 链 球菌或 F群 链 球菌， 这类 菌均 为 上呼吸道正常菌群。4.4.1.2 肺炎 链 球菌鉴别 草 绿 色 链 球 菌 和 肺 炎 链 球 菌 ， 检 查 形 态 与 肺 炎 链 球 菌 相 似 的 -溶 血 菌落 ，做 以 下 试 验 ：a) 胆汁 溶 菌 试 验 ： 在 菌 落 上 滴 10%去 氧 胆 酸 钠 溶 液 1 滴 ， 置 35 15min 30min 后 ， 若 菌 落 溶 解 ， 报告 “ 肺 炎 链 球 菌 ” ； 若 菌落 不 溶 解 ， 则 用 奥 普 托 辛（ optochin,OP） 敏 感 试 验 再 确 认 。b) OP 敏 感 试 验 ： 将 菌 落 密涂 于血 平板 ， 粘 贴 OP 纸 片 （ 5 g/片 ） ， 经 35 、 5%CO2 环 境 过 夜 培 养， 若出现 抑 菌 圈 （ 直 径 大 于 14mm 判 为 敏 感 ） ， 报 告 “ 肺炎 链 球 菌 ” ；c) 药 敏 试 验 ： 快 速 挑 起 相 似 菌落 ， 做 药 敏 试 验 ； 同 时 粘 贴 OP 纸 片 确 认 纯 度 ，以 检查 药 敏 结 果 是 否混 有 其 他 草 绿 色 链 球 菌 （ 污 染 菌 ） 。注 ： 存在 对 胆汁耐受或 对 奥普托辛耐 药 的肺炎 链 球菌株，将 这 两个 试验联 合 检测 可减少 错误报 告。4.4.2 苛养 革 兰 阴 性 杆 菌 （ 在 麦 康 凯 平 板 上 难 生 长 ）4.4.2.1 流感 嗜 血 杆 菌流感 嗜 血 杆 菌 是 只 生 长 在 巧克 力 平 板 上 的 球 杆 菌 ， 在血 平 板 上 不 生 长 ， 但 在 葡萄 球 菌 周 围 可呈 卫 星 状生长 。 血平 板 卫 星 阳 性 （菌落 不 溶血）、 MH平板 卫 星 试 验 阴性 可 判断 是流 感嗜血 杆 菌， 也 可 做 ALA（ aminolevulinic acid） 试验 确 认 ， 并 做 -内 酰 胺 酶 试 验 。4.4.2.2 博德 特 菌 属有重 要 临 床 意 义 的 博 德 特 菌在 血 平 板 上 生 长 ， 触 酶 和 脲 酶 均 为 阳 性 ， 培 养 48h出 现 肉 眼 可 见 菌 落。4.4.2.3 其 他 苛 养 革 兰 阴 性 杆菌除非 呈 优 势 生 长 或 数 量 很 多 ， 通 常 无 需 鉴 定 其 他苛 养的 革 兰 阴 性 杆菌 ， 如艾 肯菌 属 ， 因 这 些 均 为 上 呼吸 道 正 常 菌 群 ， 很 少 引 起呼 吸 系 统 疾 病 。4.4.3 革 兰 阴 性 双 球菌a) 检测 有 意 义 数 量 的 、 用 接 种 环 可 推 移 的 菌 落 ， 按表 1 确 认 是 卡 他 莫 拉 菌 ， 90%以上 卡他莫拉 菌 株的 -内 酰 胺 酶 试 验 为 阳 性。b) 检查 巧 克 力 平 板 上 氧 化 酶 阳 性 的 任 何 菌 落 ， 并 在 血 平板 上 不 生 长 或 生 长 不 良 ， 按表 1 确 认鉴 定 脑膜 炎 奈 瑟 菌 ， 无 需 常 规 做 药 敏 试 验 。4.4.4 革 兰 阴 性 杆 菌 （ 在 麦 康 凯 平板 上 生 长 良 好 ）a) 若只 生 长 了 一 种 细 菌 并 达 到了 有 临 床 意 义 的 数 量 ， 而无 其 他 致 病 菌 ， 通 过 初 步 试 验 筛 查 ， 此菌 若为 肠 杆 菌 科 细 菌 特 别 是 肺炎 克 雷 伯 菌 ， 需 做 鉴 定 和 药 敏 试 验 ；b) 对 于 住 院 患 者 ， 不 管 是 否 有其 他 病 原 菌 ， 检 查 有 意 义 数 量 的 铜 绿 假 单 胞 菌 、 鲍 曼 不 动 杆菌 、洋 葱伯 克 霍 德 菌 和 嗜 麦 芽 窄 食 单 胞 菌 ， 因 这 些 菌 是 典 型的 多 重 耐 药 菌 ， 可 造 成 医院 内 流 行 。c) 若生 长 一 种 以 上 其 他 等 量 的革 兰 阴 性 杆 菌 ， 做 初 步 试验 ， 并 报 告 （如 ： 吲 哚 、 氧 化 酶 、 在麦 康 凯平 板 上 的 气 味 和 形 态 、 菌落 色 素 和 克 氏 双 糖 试 验 的 结 果 ）。4.4.5 葡萄 球 菌 属11XX/T XXXXX XXXXa) 若革 兰 染 色 显 示 占 优 势 的 成堆 球 菌 与 白 细 胞 相 关 ， 而无 其 他 有 意 义 数 量 的 致 病菌 ， 只 对 有 临 床 意义 数 量 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 进 行 鉴 定 。b) 若是 住 院 患 者 ， 依 照 感 染 控制 原 则 ， 即 使 少 量 菌 也 应 用 头 孢 西 丁 检 测 苯 唑 西 林是 否 耐 药 。c) 仅 当 凝 固 酶 阴 性葡 萄 球 菌 在平 板 上呈 90%以 上生 长 纯 度 时 ，才 需 鉴 定 到 种 水 平和 /或 做 药 敏 试 验， 其 他 葡 萄 球 菌 均 为 呼 吸道 正 常 菌 群。4.4.6 肠 球 菌 属a) 生 长 肠 球 菌 则 无 需 报 告 ， 除 非 生 长 数量 达 90%以 上 纯 培 养 ， 用 初 步 生 化 试 验 鉴 定 确 认 。d) 很多革 兰 阳 性 球菌是呼 吸 道正常菌群 ， PYR 阳 性 甚 至胆汁七 叶 苷 和亮氨酸 肽 酶 （ leucine aminopeptidase， LAP）阳 性。4.4.7 革 兰 阳 性 杆 菌a) 排除 任 何 数 量 来 自 免 疫 抑 制患 者 的 奴 卡 菌 属 和 马 红 球菌 （ 粘 液 样 菌 落 、 脲 酶 阳性 ） ；b) 如有 大 芽 孢 革 兰 阳 性 菌 ， 排除 炭 疽 芽 孢 杆 菌 和 蜡 样 芽 孢 杆 菌；c) 有限 地 鉴 定 棒 状 杆 菌 ， 当 出 现 下 列 任 何 情 况 的 大 量 优势 菌 生 长 时 ， 再 使 用 鉴 定革 兰 阳 性杆菌 的 商品 试 剂 盒 ：1) 当菌 株 快 速 脲 酶 试 验 阳 性 时 （ 假 白 喉 棒 状 杆 菌 、 假 结 核 棒 状 杆 菌 脲 酶 阳 性）2) 标 本 来 自 ICU 的 插 管 患者d) 通常 ， 其 他 革 兰 阳 性 杆 菌 不引 起 肺 炎 ， 故 不 必 鉴 定 。4.4.8 鉴 定 丝 状 真 菌a) 对 分 离 到 的 丝 状 真 菌 做 鉴 定 （ 除 外 实 验 室 或 环 境 污 染的 霉 菌 ， 如 青 霉 菌 ） （ 见 参考 文 献 4 之 第 六篇 第 五 节 ）；注 ： 从培养超 过 48h的平皿上分离 双 相真菌（如 荚 膜胞 浆 菌和球 孢 子菌），或酵母 样 菌落形 态 ；b) 检查 陈 旧 培 养 物 以 排 除 新 生 隐 球 菌 ， 无 需 进 一 步 鉴 定其 他 酵 母 样 真 菌；注 ： 念珠菌通常不会引起肺炎 ， 除非是 肿 瘤患 者 （如 ： 白血病） 、 肺移植患者或新生 儿 。 酵 母 菌属于口腔正常定植 菌群，即使从下呼吸道 标 本中分离到念珠菌，不管是什么种，都与疾病无关，除非有 组织 病理学 证 据。4.4.9 涂片 时 可 见 但 培 养 不 生 长 的 细 菌如果 涂 片 时 可 见 细 菌 ， 但 培养 后 未 见 细 菌 生 长 ， 可 能因 使 用 了 抗 菌 药 物 引 起 的 ； 但 也 不 能 排 除 可能 存在 军 团 菌 、 百 日 咳 博 德 特菌 和 分 枝 杆 菌 。 实 验 室 应 及 时 与 临 床 联 系 ， 扩 大 标 本 送 检 的 培 养 范 围 。4.5 质 量 控 制4.5.1 革 兰 染 色a) 应对 新 购 置 或 新 批 号 的 商 品化 革 兰 染 色 试 剂 做 室 内 质 控 ， 常 规 质 控 频 率 为 每 周 1 次；b) 革 兰 染 色 阳 性 质 控 菌 株 ： 金黄 色 葡 萄球 菌 ATCC25923， 深 紫 色 球 菌 为 合 格；c) 革 兰 染 色 阴 性 质 控 菌 株 ： 大 肠 埃希 菌 ATCC25922 ， 红 色 杆 菌 为 合 格 。4.5.2 抗酸 染 色a) 应对 新 购 置 或 新 批 号 商 品 化 抗 酸 染 色 试 剂 做 室 内 质 控， 常 规 质 控 频 率 为 每 周 1 次；b) 抗酸 染 色 阳 性 质 控 菌 株 ： 结 核 分 枝 杆 菌 ATCC25177（弱 毒 株 ） ， 红 色 分 枝 状 杆菌 为 合 格 ；注 ： 或用快生 长 分枝杆菌作 为 阳性 质 控菌株。c) 虽 然 由 两 种 致 病 菌 同 时 引 起的 感 染 不 常 见 ， 但 当 两 种形 态 的 细 菌 均 与 白 细 胞 相关 时 也 应报 告 ；12XX/T XXXXX XXXXc) 抗酸 染 色 阴 性 质 控 菌 株 ： 大 肠 埃希 菌 ATCC25922 ， 蓝 色 杆 菌 为 合 格 。4.5.3 培养基4.5.3.1 血平板购 买 或 自 制 的 5%羊 血 平 板 每批 次 做 室 内 质 控 的 菌 株 ：a) 化 脓 链 球 菌 ATCC19615， -溶 血 ， 生 长 良 好 为 合格 ；b) 肺炎 链 球 菌 ATCC49619， -溶 血 （ 草 绿 色 溶 血 ）， 菌落 中 间 凹 陷 的 典 型 菌 落 特征 为 合 格 。4.5.3.2 巧克 力 平板购 买 或 自 制 的 巧 克 力平 板 ，每 批 次做 室 内 质 控的 菌 株： 流 感嗜 血 杆菌 ATCC49247， 生 长饱 满 、 典 型 的湿 润 、 半 透 明 菌 落 为 合 格。4.5.4 试剂4.5.4.1 每批 号 、 每 周 需 做 质 控 的 试剂a) 奥普 托 欣 （ OP） 纸 片 （ 5 mg/片 ） ： 质 控 菌 株 为 肺 炎 链 球 菌 ATCC49619， 抑 菌 圈 14mm 为 合格。b) 杆菌 肽 纸 片 （ 0.04 U/片） ： 质 控 菌 株 为 化 脓 链 球 菌 ATCC19615， 形 成 抑 菌 圈 为 合格。c) PYR 试 验 ： 质 控 菌 株 为 化 脓链 球 菌 ATCC19615， 桃 红 色 为 合 格 。4.5.4.2 每批 号 、 每 次 试 验 需 做 质 控的 试 剂a) 3%过 氧 化 氢 （ 触 酶 试 验 ） ： 阳 性 对 照 菌株 为 金 黄色 葡萄 球 菌 ATCC25923， 产 剧 烈 气 泡 ； 阴 性 对 照菌 株 为 粪 肠 球 菌 ATCC29212， 不 产 气 泡 或 缓 慢 产 生 少量 气 泡。b) 兔血 浆 或 乳 胶 凝 集 试 剂 （ 凝集 因 子 试 验 、 玻 片 法 凝 固 酶 试 验 ） ： 阳 性 对 照 菌 株 为 金 黄 色葡萄 球 菌 ATCC25923， 呈 不 规 则 块 状 凝 集 ， 阴 性 对 照 菌 株 为 表 皮 葡 萄球 菌 ATCC12228， 不 凝 集 。c) 兔血 浆 或 乳 胶 凝 集 试 剂 （ 凝固 酶 试 验 、 试 管 法 凝 固 酶 试 验 ） ： 质 控 菌 株 同 b),经 4h 孵 育， 阳 性对 照 菌 呈 凝 胶 胨 状 ； 阴 性 对 照 菌 呈 液 状 。注 ： 常 规 做凝固 酶 试验时应 使用 EDTA抗凝兔血 浆 ， 当 玻片法 试验 为 阴性 结 果 时 ， 应 再做 试 管法确 认 ， 因有 10%15% 的金黄色葡萄球菌株的玻片法凝固 酶 试验 呈阴性。d) 1%盐 酸 四 甲 基 对 苯 二 胺 （ 氧化 酶 试 验 ） ： 阳 性 对 照 菌株 为 铜 绿 假 单 胞 菌 ATCC27853， 10 秒 钟 内 产蓝 紫 色 ； 阴 性 对 照 菌 株 为 大 肠 埃 希 菌 ATCC25922，不 变 色。e) 头孢 硝 噻 吩 （ nitrocefin)（ -内 酰 胺 酶 试 验 ）： 阳 性 对 照 菌 株 为 金 黄 色 葡 萄 球菌 ATCC29213， 产粉 红 色 ； 阴 性 对 照 菌 株 为 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ATCC25923， 不 变 颜 色 。5 分析 后 报 告 结 果5.1 革 兰 染 色 报 告5.1.1 痰 标 本 报 告 原 则 （ 见 表 1）a) 白 细 胞 和 优 势 菌 （ 不 粘 附 在 鳞 状 上 皮 细 胞 上 ） 有 助 于 预 测 肺 部 致 病 菌 ， 应 该 报 告；b) 每个 油 镜 视 野 可 见 大 于 10 个或 小 于 10 个 单 一 形 态细 菌并 与 白 细 胞 相 关 （ 在 白 细 胞 周 围 ， 特 别 是位 于 白 细 胞 内 的 细 菌 ） ， 有 助 于 预 测 肺 部 致 病菌 ， 应 该 报 告 ； 涂 片 中 少于 1 个 菌 /20 个 油 镜视 野 的 少 量 细 菌 不 必 报 告 ；13XX/T XXXXX XXXXd) 即使 涂 片 未 见 细 菌 时 仍 有 助于 评 价 患 者 状 况 ， 可 能 隐 藏着 某 些 特 殊 菌 ， 如 军 团 菌 、 内 源 性 真 菌 、 结核 分 枝 杆 菌 或 其 他 可 引 起非 典 型 肺 炎 的 致 病 菌；e) 质 量 合 格 的 标 本 中 ， 涂 片 有 正 常 菌 群 及 多 种 细 菌 （ 通常 白 细 胞 内 有 空 泡 或 液 泡 ） ， 提 示有吸 入 性肺炎 ， 应 该 报 告。表 1 痰 /气 管 吸 出 物 标 本 涂 片革 兰 染 色 结 果 解 释5.1.2 BAL 细 胞 离 心 涂 片 报 告若是 细 胞 离 心 机 制 作 的 BAL标 本 涂 片 革 兰 染 色 ， 检 测 敏感 度 为 105个 细 胞 /mL或 104个 细 胞 /mL,若 每 个 油镜 视 野 可 见 1个 或 多 个 细