目的基因的克隆— pcr法扩增目的基因片断

目的基因的克隆 PCR法扩增目的基因片断PCR(Polymerase Chain Reaction)，聚合酶链式反应 ,模拟了发生在细胞内的 DNA复制的过程DNA的结构（ 1）三磷酸核糖核苷 NTP三磷酸脱氧核糖核苷 dNTP三磷酸双脱氧核糖核苷 ddNTPDNA的 结构（ 2）A腺嘌呤G鸟嘌呤C胞嘧啶U尿嘧啶T胸腺嘧啶 五种碱基A-T C-GDNA的结构（ 3） 氢键维持了 DNA的双螺旋结构DNA的 复制（ 1）3-OH进攻 5- PiDNA聚合酶催化DNA的延伸方向 :5-3DNA的复制（ 2）DNA复制相关蛋白在复制起始点打开双链 DNA然后 DNA解链酶结合到单链 DNA上进一步解开双链 DNA DNA的复制（ 3）DNA的复制 和 体外的模拟模板（母链） 细胞内源 外源加入打开双链 解链酶 加热变性维持单链 单链结合蛋白 高温引物 引物合成酶 外源加入底物 dNTP 细胞内源 外源加入聚合酶 细胞内源 外源加入反应环境 细胞内环境 缓冲液PCR循环 -变性PCR循环 -变性PCR循环 -变性PCR循环 退火PCR循环 延伸PCR循环 延伸PCR循环 延伸PCR循环 延伸PCR整个过程讨论 1：为何酶促反应需要那么高的温度v为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板v防止非特异性的引物退火v延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度 vDNA聚合酶 不能热变性，所以选用 耐高温的聚合酶 常规用的 PCR DNA聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的 DNA聚合酶。酶活性在 100 0C条件下，能保持几个小时。而其最适合酶促温度在 72 0C左右。 讨论 2：影响 PCR质量的一些因素模板 :选用纯度较高的 DNA作 模板，杂质蛋白和 RNA的存在都会影响到 DNA聚合酶与引物和模板的结合。目的片断：目的片断或者目的片断相邻的 DNA含 GC量较高，或者有重复序列存在，都会导致二级结构的存在。可在反应体系里加入 DMSO，破坏模板的二级结构。引物的设计： 引物太短，要求退火的温度就低，错配的可能性就大，再者，两条引物不能存在较长的互补片断 。酶：纯度、可信度，碱基错配率 1/10000。 讨论 3： PCR的应用q从蓝藻里面克隆 SOD(超氧化物歧化酶 )清除人体内细胞中自由基抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰食品、保健品、药品、化妆品基因库检索 SOD的序列 设计引物 以蓝藻总 DNA位模板做 PCR获得的基因片断连接在表达载体 原核 表达蛋白讨论 3： PCR的应用q检测粉末样品是否含有炭疽杆菌 炭疽菌恐慌，降临美国， 席卷全球生命力强、传染快、发作快、死亡率高。有两对引物是根据编码 炭疽杆菌 EF因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的 EF因子同源。 PCR产物是 1247bp和208bp的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。用营养肉汤培养 2小时 取培养液直接作 PCR讨论 3： PCR的应用q基因测序基因组计划 首要任务就是测序Sanger双脱氧法ddATP-绿色荧光ddTTP-红色荧光ddCTP-蓝色荧光ddGTP-橙色荧光讨论 3： PCR的应用q基因测序实验步骤：1.取一个干净 PCR专用小管2.往 PCR管 里面加入各种试剂3.设定好机器各种参数4.开始 PCR5.电泳检测 PCR结果无菌去离子水 34ul1