第十七章pcr基因扩增仪

第十七章 PCR基因扩增仪(PCR Gene Amplifier)内容提要 PCR基因扩增仪的工作原理 PCR技术的原理及发展 PCR基因扩增仪的工作原理 PCR扩增仪的分类与结构 定性 PCR扩增仪 实时荧光定量 PCR扩增仪 内容提要3. PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 PCR扩增仪的性能指标 PCR扩增仪的操作规程 PCR扩增仪常见故障的排除 PCR扩增仪的应用教学基本要求1.掌握 PCR基因扩增仪的工作原理和主要性能指标。2.掌握梯度 PCR仪和原位 PCR仪的功能和特点。3.掌握实时荧光定量 PCR扩增仪的种类；金属板式实时定量 PCR仪和离心式实时定量 PCR仪的特点。4. 熟悉 PCR技术的原理； PCR扩增仪的种类；荧光实时定量 PCR（ RQ-PCR）技术原理。5.了解 PCR扩增仪的操作规程； PCR扩增仪常见故障的排除； PCR扩增仪的应用。第一节 PCR基因扩增仪的工作原理 一、 PCR技术的发展及原理 F1971年， Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述了 PCR方法。 F1985年，美国 PE-Cetus公司的 Kary Mullis等人发明 PCR技术。第一节 PCR基因扩增仪的工作原理FPCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链 DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板 DNA杂交，在 Taq DNA聚合酶， dNTPs， Mg2+和合适 pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性 退火 引物延伸 ”过程至 25-40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。第一节 PCR基因扩增仪的工作原理PCR的基本原理 第一节 PCR基因扩增仪的工作原理二、 PCR基因扩增仪的工作原理从 PCR反应基本原理可以看出，PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。 第一节 PCR基因扩增仪的工作原理PCR仪温度控制水浴锅控温 压缩机控温 半导体控温 离心式空气加热控温 第二节 PCR扩增仪的分类与结构PCR扩增仪的种类 普通 PCR扩增仪 实时荧光定量 PCR扩增仪 梯度 PCR仪 原位 PCR仪 第二节 PCR扩增仪的分类与结构F荧光实时定量 PCR（ real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个 PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 第二节 PCR扩增仪的分类与结构实时荧光定量 PCR仪 金属板式实时定量 PCR仪 离心式实时定量 PCR仪 各孔独立控温的定量 PCR仪 第二节 PCR扩增仪的分类与结构金属板式实时定量 PCR仪 F可作为普通 PCR仪使用F可带梯度功能F可容纳的样本量大，无需特殊耗材F温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致 第二节 PCR扩增仪的分类与结构ABI 7500荧光定量 PCR仪 MJ公司 Chromo 4荧光定量 PCR仪 Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪 第二节 PCR扩增仪的分类与结构离心式实时定量 PCR仪 F温度均一性较好F使用的是同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差F可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能 第二节 PCR扩增仪的分类与结构Rotor-Gene 3000荧光定量 PCR仪 Light CycleTM荧光定量 PCR仪 第二节 PCR扩增仪的分类与结构Light CycleTM荧光定量 PCR仪结构示意图 第二节 PCR扩增仪的分类与结构各孔独立控温的定量 PCR仪F不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，适合多指标快速检测。FSmartCycler 的软件允许一台仪器同时操作六个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯度反应。FSmartCycler 上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。第二节 PCR扩增仪的分类与结构SmartCycler 荧光定量 PCR仪 第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 一、 PCR扩增仪的性能指标 （一）温度控制 温度的准确性 温度的均一性 升降温的速度 不同模式下的相同温度特性 第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 （二）荧光检测系统 激发光源 检测器 发光二极管 卤钨灯光源 超低温 CCD 光电倍增管 第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 （三）软件J简便的人性化设计最能满足其需求。新型的 PCR仪很注重程序编写的简易性，易学易用，还具有实时信息显示、记忆存储多个程序、自动倒记时、自动断电保护等功能，很多还可以免费升级。 第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 （四）其他J多样化样品基座设计、热盖等都使 PCR仪越来越人性化。 第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 二、 PCR扩增仪的操作规程J普通 PCR扩增仪的操作非常简便，接通电源，仪器自检，设置温度程序或调出储存的程序运行即可。J定量 PCR扩增仪的操作和普通 PCR仪基本相同。 三、 PCR扩增仪常见故障的排除 第四节 PCR扩增仪的应用 一、感染性疾病的分子诊断和研究二、遗传性疾病的分子诊断和研究三、恶性肿瘤的分子诊断和研究四、 PCR扩增仪在移植配型上的应用五、 PCR扩增仪在法医学上的应用六、 PCR扩增仪在分子生物学其他领域的应用 第一节 PCR基因扩增仪的工作原理F以不同温度的 水浴锅 串联成一个控温体系。F样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均一性好，无边缘效应。F体积大，自动化程度不高，需人为干预，更换水浴锅时控温不稳定。 第一节 PCR基因扩增仪的工作原理F由 压缩机 自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便，一台机器便可完成整个 PCR流程。F压缩机故障率高，边缘效应及温度overshooting现象严重。F升温过程中，由于一些加热元件，比如半导体、金属块本身会积蓄能量，虽然温度探头探测温度到达了设定温度，但半导体、金属块上积蓄的能量仍然会传给 PCR体系，造成实际的温度高于设定的温度，即 overshooting。 第一节 PCR基因扩增仪的工作原理F由 半导体 自动控温，金属导热，控温方便，体积小，相对稳定性好。F仍