第十三章生物制品分析概论

第十三章 生物制品分析概论 第一节 概 述药物的三大类 :一、生化药物与基因工程药物的一、生化药物与基因工程药物的 定义定义生化药物 : 一般系指以下三种途径获得的药物：其一，从动物、植物及微生物分离纯化；其二、生物 化学半合成；其三，现代生物技术制取。该类药物 主要包括 ：生命基本物质及其衍生物、降解物、大分子结构修饰物等。例： 氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、核苷酸和脂等。续定义基因工程药物 : 在 确定 了对某种疾病具有预防和治疗作用的 蛋白质 的基础上 ,分离、纯化或人工合成 控制该蛋白质合成的 基因 ，并利用重组DNA技术进行改造，最后将该基因导入可以大量生产的 受体细胞中 进行 繁殖或表达，从而大规模生产出具有预防和治疗疾病作用的药用蛋白质。二、生化药物与基因工程药物的二、生化药物与基因工程药物的 种类种类（一）生化药物的种类种类（续）v氨基酸及其衍生物类药物1、单氨基酸例如：亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、色氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、苏氨酸等等。2、氨基酸衍生物例如： N-乙酰上 -L-半胱氨酸、 L-半胱氨酸乙酯盐酸盐、 S氨基甲酰半胱氨酸、 S-甲基半胱氨酸等等。3、复合氨基酸注射液例如： 3S、 6S、 9S、 11S、 13S、 14S、 15S、 17S、 18S复合氨基酸注射液。 S代表氨基酸的种类。 种类（续）v药用活性多肽药用活性多肽1、垂体多肽： 例如： 促胃液素 (5肽 )、催产素 (9肽 )等。2、消化道多肽： 例如：胃泌素 (14肽， 17肽和 34肽三种 )3、 下丘脑多肽： 例：促甲状腺素释放激素 (3肽 ) 。4、 脑多肽： 例：新啡肽 (25肽 )， -内啡肽 (3l肽 )等。5、 激肽类： 例：血管紧张肽 I(10肽 )、 (8肽 )、 (7肽)等活性肽。6、其它肽类： 例：谷胱甘肽 (3肽 )、 1胸腺素 (28肽 ) 。 种类（续）v药物蛋白质药物蛋白质1、蛋白激素类药物： 例如：胰岛素、生长激素、催产素。2、天然蛋白质类药物： 例如：血清白蛋白、干扰素。3、蛋白质类药物制剂： 例如：明胶海绵、氧化聚明胶。 种类（续）v酶与辅酶酶与辅酶 类药物类药物1、助消化酶类： 例：胃蛋白酶、胰酶、胰脂肪酶。2、蛋白水解酶类： 例：溶菌酶、胰 DNA酶、胶原蛋白酶。3、凝血酶及抗栓酶： 例：牛凝血酶、纤溶酶、尿激酶。4、抗肿瘤酶： 例： L-天门冬酰胺酶、组氨酸酶、精氨酸酶。5、其它酶类： 例：超氧化物歧化酶 (SOD)、 RNA酶、 DNA酶、青霉素酶。6、辅酶类药物： 辅酶对酶的催化反应起着促进作用。例：辅酶 、辅酶 、辅酶 A、 辅酶 Q10、 黄素单核苷酸。种类（续）v多糖类药物多糖类药物该类药物来源广泛，以黏多糖为主，其 特点 为：（ 1）、由糖苷键将单糖连接而成多糖。（ 2）、因单糖结构糖苷键位置不同，使多糖种类繁多，药理功能各异。如抗凝、降血脂、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫功能和抗衰老等多方面的生理活性。例如： 肝素、硫酸软骨素 A和 C、 刺参多糖、银耳多糖、人胎盘脂多糖、壳聚多糖。种类（续）v脂质类药物脂质类药物1、磷脂： 如脑磷脂、卵磷脂。2、降血脂： 如天然亚油酸、亚麻酸、多价不饱和脂肪酸（ PUFA）、 前列腺素 PGE1、 PGE2、 PGF2a、PGI2。3、 胆酸： 如去氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸。4、固醇： 如胆固醇、麦角固醇、 -谷固醇。5、 卟啉： 如血红素、胆红素、原卟啉。 种类（续）v核酸及其降解物和衍生物类药物1、核酸： 例如，从小牛胸腺或鱼精中提取的 DNA可用于治疗精神迟缓、虚弱和抗辐射。2、多聚核苷酸： 例如，多聚胞苷酸、聚肌苷酸等是干扰素的诱导剂，用于抗病毒、抗肿瘤。3、核苷、核苷酸及其衍生物： 例， ATP、 cAMP、 CDP-胆碱、 AMP、 肌苷等。也可将它们进行化学修饰后用于治疗肿瘤和病毒感染。治疗肿瘤的如 6-巯基嘌呤、 2-脱氧核苷。抗病毒的如，环胞苷、5-碘苷。 （二）、基因工程类药物的种类三、生化药物与基因工程药物的三、生化药物与基因工程药物的 特点特点1、共同特点：均来自生物体 ,是生物体的基本生化成分 ,具有生物活性或生理功能 ,对疾病具有针对性强、毒副作用小、易于人体吸收。2、分子量大且不是定值小部分药物（如：氨基酸、辅酶）属化学结构明确的小分子化合物，大部分为大分子的物质 (如蛋白质、多肽、核酸、多糖类等 )，其分子量一般几千至几十万。对大分子的生化药物而言，即使组分相同，往往由于分子量不同而产生不同的生理活性。所以，生化药物常需进行分子量的测定。 特点（续）特点（续）3结构确证难由于有效结构或分子量不确定，其结构的确证很难沿用元素分析、红外、紫外、核磁、质谱等方法加以证实，往往还要用生化法如氨基酸序列等法加以证实。 4、全过程质量控制该类药物对热、酸、碱、重金属等均较敏感，往往需要对原料药、生产过程和产品进行全过程质量控制，且要求比其它药物更为严格。5需检查生物活性在制备多肽或蛋白质类药物时，有时因工艺条件的变化，导致蛋白质失活。因此，对这些生化药物，除了用通常采用的理化法检验外。尚需用生物检定法进行检定，以证实其生物活性。 特点（续）特点（续）6需做安全性检查由于生化药物的性质特殊。生产工艺复杂，易引入特殊杂质。故生化药物常需做安全性检查，如热原检查、过敏试验、异常毒性试验等。 7需做效价测定该类药物多数可通过含量测定，以表明其主药的含量。但对酶类药物需进行效价测定或酶活力测定，以表明其有效成分含量的高低。 第二节 质量检验的基本程序与方法 一、鉴别试验 真伪鉴别方法 化学药物 :化学方法、物理学方法生化药物与基因工程药物 :化学方法、物理学方法、生物学方法。且需要标准品或对照品进行对照实验。 （一）、（一）、 理化 鉴别 1、 化学鉴别法 利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。 例如，溶菌酶的鉴别采用呈色法：溶茵酶分子中的四个肽键上的氮原子能与铜离子 (Cu2+)络合，生成有颜色的络合物，肽键越多，产生的颜色越深。理化 鉴别 (续) 2、 紫外分光光度法由于很多生物大分子均有共轭系统 ,可产生特征可见紫外吸收，使较多药物能够用紫外分光光度法的特征吸收进行鉴别。 例如， 0.0lmol/L的三磷酸腺苷二钠的盐酸水溶液在257nm的波长处有最大吸收。用 A250nm/A260nm的值 0.17-0.27进行鉴别。 理化 鉴别 (续) 3、 高效液相色谱法利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。 例如， 重组人生长激素的鉴别：1）供试品与对照品的主峰保留时间一致。2）供试品与对照品的肽图谱保持一致性。 （二）、（二）、 生化 鉴别 1、 酶法由于酶催化化学反应的高度专一性，利用特定的酶仅能催化特定的化学反应，可以有效地鉴别该药物。 例如， 尿激酶 是专属性较强的蛋白水解酶，根据尿激酶能 激活 牛纤维蛋白溶酶原 而具有相同作用的链激酶 不能激活 牛纤维蛋白溶酶原而加以区别，并用直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上升法作为判断指标。 生化 鉴别 (续) 2、 电泳法基于生物大分子分子量的较大差异和荷电的差异，在电泳法中具有不同的迁移距离，从而鉴别生化药物。例如， 肝素 的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝素是由 D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘多糖，其水溶液带强负电荷，于 琼脂凝胶板 上，在电场作用下，向正极方向移动，与肝素 国家标准品对照 ，其移动位置应对应。生化 鉴别 (续) 3、 样品脱盐后用等电点聚焦法测定基因工程药物往往有多个等电点，利用等电点 聚焦 从而形成多个区带，基于该区带的一致性鉴别药物。（三） 生物鉴别法利用生物体进行试验来鉴别药物。例如，用家兔 惊厥试验 来鉴别 胰岛素 ，它是通过胰岛素的降血糖作用进行鉴别的。当剂量过大，血糖降低至一定水平 (约 30 )，家兔即发生惊厥，迅速静注 50葡萄糖注射液，补充血糖、惊厥停止，说明惊厥是胰岛素所致低血糖而引起的。 生物药物鉴别应该注意以下三点： （ 1） 药物的取样 ：由于生物药物多数为大分子药物，有的化学结构不明确，有的分子量不是定值，使质量控制较为困难。在大量的样品中取少量供试品进行分析，应考虑取样的科学性、真实性和代表性，其基本原则是 均匀、合理 。 （ 2） 鉴别结果评价 ：由于生化药物的复杂性和不确定性，通常鉴别不是由一项试验完成，而是采用一组试验项目 综合评价 一种药物。 （ 3）目前仍存在相当一部分生化药物 没有 找到有效的 鉴别方法 。 二、二、 杂质检查 1、 一般杂质检查生化药物的一般杂质检查项目包括氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等。其检查的原理及方法与化学药物中的一般杂质检查相同。 杂质检查（续） 2特殊杂质检查特殊杂质主要是指从生产工艺中引入或原料中带入的杂质。许多生化药物是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得，药物中易残存一些杂质或其他成分。 例如， 胰蛋白酶 是从动物胰中提取制得的一种蛋白水解酶，在制备过程中，易带入 杂质 糜蛋白酶 ，根据糜蛋白酶的特性可以 选用 N-乙酰 -L-酪氨酸乙酯为底物作糜蛋白酶的限度检查 。 三、三、 安全性检查 （一） 、热原检查和细菌内毒素检查 详见第十二章药物制剂分析（ P302-303） （二）、 异常毒性试验异常毒性试验 是用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其急性毒性反应。 反应的判断以试验动物死亡与否为终点 。 安全性检查（续） 中国药典规定的异常毒性试验，实际上 是一个限度试验。在此剂量条件下，一般供试品不应使试验动物中毒致死；如果 出现 试验动物急性 中毒而死亡 ，则反映该供试品中含有的 急性毒性物质超过了正常水平 ，因此，本试验又称异常毒性检查法。 试验动物 ： 小白鼠 。试验方法 ：尾静脉注射法、皮下注射法、腹腔注射法及口服给药法 。 安全性检查（续） 例如， 玻璃酸酶 的异常毒性检查方法如：取体重 1722g的健康小白鼠 5只，分别由皮下注射每 1ml中含玻璃酸酶 10000单位的氯化钠注射液 0.25ml