单克隆抗体技术讲解PPT课件

抗体工程制药抗体工程制药 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 1 掌握：单克隆抗体的概念和特点、制备原理， 制备方法及基本过程 熟悉：单克隆抗体技术的应用 了解：单克隆抗体的发展 2 主要 内容 1.单克隆抗体的发展 2.单克隆抗体的概念和特点 3.单克隆抗体技术的应用 4.单克隆抗体的制备过程 3 银屑病 手口足病 癌症亚急性湿疹 没有单克隆抗体前人类所遇见的问题 4 用于诊断鉴定人的血型类别 用于寻常型银屑病亚急性湿疹 用于复发或耐药的滤泡性中 央型淋巴瘤 犬瘟热病毒单克隆抗体 单克隆抗体药物 5 Georges J.F. Kohler Cesar Milstein 1975年将产生抗体的淋巴细胞与肿瘤细胞融合 , 成功建立了单克隆抗体技术。 1984年获得诺贝尔医学和生理学奖 。 一、单克隆抗体技术发展 6 1.概念 （ 1）抗体： 是机体在抗原刺激下产生的能与该 抗原 特异性结合的免疫球蛋白 。 （ 2）单克隆抗体（ monoclonal antibody ）： (简 称单抗 )，由经过特定的抗原处理过的效应 B细 胞和 骨髓瘤细胞杂交 得到的 杂交瘤细胞 产生的具 有 特异性识别 某抗原上的某一个特定 抗原决定簇 的抗体。 二、单克隆抗体的概念及特点 7 2. 单克隆抗体的特点 优点 ： （ 1）理化性状高度均一、结构、氨基酸顺序、特异性等 一致 （ 2）生物活性单一、灵敏度高 （ 3）与抗原结合的特异性强， 适用于以标记抗体为特点 的免疫学分析方法 （ 4）便于人为处理和质量控制，来源容易，可以 在体外 “ 永久 ” 地存活并传代 （ 5） 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗 8 局限性 ： （ 1） 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范 围 （ 2） 反应强度不如多克隆抗体 （ 3） 制备技术复杂、费时费工、价格较高 9 三、单克隆抗体技术的应用 1.检验医学诊断 （ 1）病原微生物抗原抗体的检测： 乙肝表面抗原试纸 （ 2）肿瘤抗原的检测 （ 3）免疫细胞及其亚群的检测 （ 4）激素测定： 早孕检测试纸、女性排卵检测试纸 （ 5）细胞因子的测定 （ 6）其他： 吗啡类毒品检测试纸等 2.蛋白质的提纯 3.肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术 10 克隆化过程 单克隆抗体的制取 致敏淋巴细胞的准备 骨髓瘤细胞的准备 细胞融合 选择性培养 抗体分泌细胞的筛选 四、单克隆抗体制备过程 11 1.致敏淋巴细胞的准备 动物选择：品系、年龄、性别、健康状态 抗原接种：方式 体内、体外 剂量 0.5-100 g 次数 视抗原而定 间隔 视抗原而定 佐剂 视抗原而定 收集时间：末次接种后 72 h 2.骨髓瘤细胞的准备 细胞株处于良好的生长状态 细胞株保持 HGPRT缺陷状态 HGPRT： 次黄嘌呤 -鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 12 致敏淋巴细胞 骨髓瘤细胞 离心 1000rpm 10 min 50%PEG 1 mL 培养液 10 mL 离心 1000rpm 7min 37 C 摇动、由慢 渐快 1min、静止 1.5min 加入 HAT培养液悬 浮细胞，置于培养 孔内 3. 细胞融合 13 4. HAT选择性培养 HAT是 用于筛选具有 次黄嘌呤 磷酸核糖转移酶 (HPRT)或 胸苷激酶 (TK)活性缺陷细胞的培养基。含有次黄嘌呤 (H)、氨基蝶呤 (A)、胸 苷 (T)和 甘氨酸 。在氨基蝶呤 (二氢叶酸 类似物 )存在下，这种酶缺陷 的细胞不能通过 核苷酸 合成旁路合成次黄嘌呤和胸苷。 HPRT和 TK缺 陷细胞可以在此培养基中生存。是常用的 骨髓 杂交瘤细胞选择性培 养基。 14 5. 抗体分泌细胞的筛选 对筛选方法的要求： 多 大量样品一次检测； 快 迅速取得检测结果； 准 检测结果可靠性高； 灵 检测方法灵敏度高。 常用筛选方法： ELISA、 IFA等 15 6. 克隆化过程 方法： 有限稀释法 克隆建立的标准：连续两次以上 100%阳性孔 饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞 有限稀释法 计数 105/ml 104/ml 103/ml 5-20/孔 16 B淋巴细胞 注射特定 抗原蛋白 骨髓瘤细胞 培养骨髓瘤细胞 融合 多种 杂交细胞 专一抗体检验阳性 克隆上述杂交细胞 分开不同杂交细胞，克隆专 一抗体，检验阳性细胞 单克隆抗体 注射到小鼠体内 体