单克隆抗体的应用前景PPT课件

单克隆抗体的 应用前景及进展 1 动物脾脏有上百万种不同的 B淋巴细胞系，具有 不同基因不同的 B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体 受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各 个具有不同基因的 B细胞。被激活的 B细胞分裂增殖形 成效应 B细胞（浆细胞）和记忆 B细胞，大量的浆细胞 克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液 中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行 培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群， 即单克隆。 单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的 抗体，称为单克隆抗体 。 概念？ 特定抗原 一种 B细胞 特异性抗体刺激 产生 2 杂交瘤细胞 挑选出一个产生特异性抗体的细胞在体外持久培 养进行克隆增殖，便可同时得到大量均一的单克隆抗体。 但是抗体形成细胞在体外持久培养困难，如脾细胞体外培 养一般一周内死亡。可是恶性肿瘤细胞的特点之一是在体 外培养中可无限期地增殖。用淋巴细胞杂交瘤技术，使抗 体形成细胞和骨髓瘤细胞杂交，得到的 杂交瘤细胞 。这种 细胞保持了亲代细胞双方的特性， 既具有肿瘤细胞在体外 培养中可以无限期地增殖的特性，又具有抗体形成细胞的 不断分泌特异性抗体的特性 。 3 典型例子 4 优点 和常规抗血清相比 1.特异性强：单克隆抗体是针对抗原分子表面抗原 决定簇的，有人陈为 “ 单特异性 ” 。它是研究生物大分 子和细胞表面细微结构以及诊断治疗疾病的有力工具。 2.可大量生产，容易标准化：一旦获得 1株杂交瘤 细胞株，就可以无限制地反复制备出相同特异性的单克 隆抗体。由于来自同一株细胞，很容易标准化。 3.用不纯的抗原，可以制备出纯的单克隆抗体。用 这种抗体又可以提纯抗原。 因为具有上述特点，单克隆抗体应用 范围很广，几 乎渗透到生物医学的每一个领域 ，在生物医学研究，临 床医学，军事医学和工业生产上都有重要的实用意义 。 5 单克隆抗体，简称单抗药 物，有 “ 生物导弹 ” 之称，目前 是生物制药产业中最大类别的产 品，也是生物制药产业中增长最 快的领域之一。全球领先的医药 健康咨询服务公司 IMSHealth数 据显示， 2009年全球 15大畅销药 品中，抗体药物占据了 1/3。业 内人士普遍认为，单克隆抗体药 物是中国生物医药产业发展潜力 最为巨大的新药方向。 前景 ： 6 7 应用前景 单克隆抗体能与其相应的抗原 特异性结合，因而能够从复杂系统 中识别出单个成分。只要得到针对 某一成分的单克隆抗体，利用它作 为配体，固定在层析柱上，通过亲 合层析，即可从复杂的混和物中分 离、纯化这一特定成分。 例子： 用抗人绒毛膜促性腺激 素 (hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿 中提取到纯的 hCG。与其它提取方法 (沉淀法、高效疏水色谱法等 )相比 ，具有简便、快速、经济、产品活 性高等优点。 1 作为亲合层析的配体 8 2 作为生物治疗的导向武器 包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞 。这种 “ 导向治疗 ” ，在动物试验与体外试验中已获得满意效 果。 例子：热敏免疫脂质体 ，由抗 人乳癌细胞抗体 经疏水长链 脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双 层膜中，抗体 Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。 热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞 (人乳癌细胞 )，并通过相变 温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。 常见抗肿瘤细胞毒剂： 化疗药物、细 菌毒素、植物毒素或放射性同位素等。 优点 :这不仅提高了抗体的疗效，也 可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。 瓶颈： 应用于临床，目前还存在不少 技术难关，包括 人体对鼠源单抗的排异问 题 等。 9 抗人 T淋巴细胞单抗 (McAb)作为一种新型免疫抑制剂 ，已广泛应用于 临床治疗自身免疫疾病 和 抗器官移植的 排斥反应 。其作用机理有赖于 McAb的种类及其免疫学特 性。 例 1： 注射抗小鼠 Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠 同种皮肤移植的排斥反应。 例 2： 对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗 T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。 3 作为免疫抑制剂 10 利用单克隆抗体的特性可把它作为研究工作中的探针。 此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物 质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。 例子： 用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与 其结合的相应生物大分子 (蛋白质、核酸、酶等 )在细胞中的 位置和分布。 制作生物芯片（即蛋白质芯片）以及用于 western杂交。 4 作为研究工作中的探针 11 抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久， 60年代就 已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异 性抗体 IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免 疫应答。 1984年以来， Celis等发现，抗乙肝病毒 (HBs)IgG可增强 HBs抗原对特异性人 T细胞克隆的刺激增殖 ，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的 HBs抗原 不产生免疫反应时，加入抗 HBs抗体组成的复合物，则可 有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的 抗原 抗体复合物型治疗性疫苗。 5 增强抗原的免疫原性 注： 抗原的免疫原性，首先决定于其自身的 化学特性，但同一种抗原，对不同种动物或 同种动物不同个体间其免疫原性强弱，可表 现很大差异，因此一种抗原的免疫原性是由 其化学性质和宿主因素决定的。 12 单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优 势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原 抗体反应 的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使 试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性 ，使抗原 抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范 化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如 下 ： 6 作为医学检验试剂 (1)诊断各类病原体 这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品 供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、 巨细胞病毒、 EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂 等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在 鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生 活周期的抗原性等方面更具独特优势 13 用于肿瘤的 诊断、分型及定位 。 尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿 瘤相关抗原 (如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原 )的单 抗早就用于临床检验。 随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记 物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐 明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定 量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助 确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于 体内诊断，再结合 X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及 其转移灶作出定量诊断 。 (2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测 14 用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段 。 例如检测 CD系列标志，有利于了解细胞的分化和 T细胞 亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。 细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效 果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移 植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更 可信的结果。 (3)检测淋巴细胞表面标志 15 应用单抗结合其它技术，可对机体的多种 微量成分进 行测定 。 如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原 -抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至 10-9 10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除 了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物 质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临 床治疗均具有实际意义。 (4)机体微量成分的测定 16 单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和 医学等许多重大问题的重要手段。但是，上述应用的单抗 属于 鼠源性 ，鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性， 主要缺陷是诱发 人抗鼠抗体 （ Human anti-mouse antibody,HAMA）反应，大大 限制了其临床应用价值 。而 且，鼠源性抗体在人体内 半衰期缩短，生物活性降低 。 因此， 人们一直致力于人源性抗体的研究 。 瓶颈 17 以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体的 DNA，构建质粒，建立组合抗体文库，再利用供 者文库建立针对某一特定抗原的子文库。 以该技术制备的 抗体片段 (Fab)是人源抗体 ，具有建库简单、抗体表达稳定等特点。迄今已 有多种抗体产生。可以预见，该技术具有良好的 发展和应用前景。 解决方案： （ 1）如用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交； （ 2）用 EB病毒转化人的 B淋巴细胞； （ 3）用基因工程法制备嵌合抗体等。 困难 （ 4）最新方法： 噬菌体技术和转基因鼠技术 18 人源化治疗性单克隆抗体的研究进展 构建的基本思路 鼠抗体人源化就是通过 基 因改造 ，使其和人体内的抗体 分子具有极其相似的轮廓，从 而逃避人免疫系统的识别，避 免诱导 HAMA（人抗鼠抗体）反 应。对鼠源抗体 进行人源化改造时要 遵守两个 原则 ，首先要保持抗体的亲和 力和特异性，其次要降低或消 除抗体的免疫原性。 19 单克隆抗体的发展史 第一代：鼠源性单抗 药物特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。 不过由于其代谢比较快，目前在放射性元素标记的单克隆 抗体药物中使用。 第二代：人鼠嵌合性单抗 进行人源化改造，使其人源化程度达到 70%左右。 第三代： CDR移植抗体和 SDR移植抗体 人源化程度达到 95%左右，大大降低了毒副作用。 第四代：全人源化单抗 2002年，的世界首个药物 阿达木单抗上市。人源 化及全人源单克隆抗体由于副作用小，在体内停留时间长 ，更有利于治疗 。 20 人源化程度 21 1.嵌合抗体（ Chimeric antibody) 用人源基因代替鼠源单抗的恒定区，即该单抗由鼠的可 变区和人的恒定区组成的嵌合抗体。 由于嵌合抗体可变区（ V）约占整个抗体的 30%，鼠源 性抗体 V区中的框架区（ FR)仍残留一定的免疫原性，可 诱导 HAMA反应。 灵长目源抗体也是 一类嵌合抗体，通过免 疫短尾猿猴产生。由于 其抗体的可变区与人可 变区无差异，不至于发 生抗体反应。 缺点 解决方案 22 2.CDR移植抗体（ CDR grafted antibody) 真正意义上的抗体人源化。抗体中除了 3个互补决定区 （ CDR）是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可 达到 95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。 不足 有时异基因的 CDR人源化抗体可能引起抗个体基因型 反应。 改良方案 进行 SDR移植改良 23 3.SDR移植抗体 (SDR grafted antibody) 在 CDR移植抗体的基础上，将异源抗体中与抗原结 合密切相关的 SDR等少数残基移植到人抗体相应位置上 ，进一步降低了抗体的异源性。通过这种方法，使人源 化的抗体潜在的免疫原性降至最低。 24 4.全人单克隆抗体（ Fully humaneantibody) 它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转 染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单 克隆噬菌体抗体。 在 HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的 优越性。 4.1.抗体库筛选技术 4.1.1.噬菌体表面展示技术 25 用 PCR技术从人免疫细胞中扩增 出整套的抗体重链可变区（ VH） 和轻链可变区（ VL）基因，克隆 到噬菌体载体上并以融合蛋白的 形式表达在其外壳表面。这样一 来噬菌体 DNA中有抗体基因的存 在，同时在其表面又有抗体分子 的表达，就可以方便地利用抗原 -抗体特异性结合而筛选出所需 要的抗体，并进行克隆扩增。使 抗体基因以分泌的方式表达，则 可获得可溶性的抗体片段。 基本原理和程序 26 4.1.2.核糖体展示技术 它将正确折叠的蛋白及其 mRNA同时结合在核糖 体上， 形成 mRNA-核糖体 -蛋白质三聚体，使目的蛋 白的基因型和表型联系起来，构成核糖体展示的蛋 白文库， 然后用相应的抗原从翻译混合物中进行筛 选， 以乙二胺四乙酸 （ EDTA） 解离结合的核糖体 复合物或以特异抗原洗脱整个复合物，并从中分离 mRNA。通过反转录聚合酶链反应（ RT- PCR） 提供 下一轮展示的模板， 所得 DNA进入下一轮富集，部 分 DNA可通过克隆进行测序分析等。 利用此技术可 以获得特异性的、高亲和力的抗体。 27 4.2.转基因小鼠 通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并导 入新基因，创造出携带人抗体重轻基因簇的转基因小 鼠。这种人抗体基因小鼠所携带的人 DNA片段具有完善 的功能，可以有效地进行同型转换和亲和力成熟。任 何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力 的人抗体。 案例 ： 日本麒麟公司用基因工程技术，使小鼠携带完整的 人 14号染色体，该染色体包含全部人抗体产生基因。 但迄今尚无该技术生产的制品问世。 28 4.3.微胞杂交干细胞技术 日本学者 Ishida等首先提出 技术要点： 首先将抗 G418的人成纤维细胞与小鼠的 A9细胞融 合，通过