挂果后期南丰蜜桔园土壤固氮菌多样性的研究

本 科 生 毕 业 设 计（论 文） 论文题目 ： 挂果后期南丰蜜桔园土壤固氮菌多样性 的研究 姓名 ： 学号 ： 09055209 班级 ： 年级 ： 2009 级 专业 ： 生物技术 学院 ： 化学生物与材料科学学院 指导教师 ： 完成时间 ： 2013 年 6 月 10 日 作 者 声 明 本人以信誉郑重声明：所呈交的学位毕业设计（论文） ，是本人在 指导教师指导下由本人独立撰写完成的，没有剽窃、抄袭、造假等违反 道德、学术规范和其他侵权行为。文中引用他人的文献、数据、图件、 资料均已明确标注出，不包含他人成果及为获得东华理工大学或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。对本设计（论文）的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本毕业设计（论文） 引起的法律结果完全由本人承担。 本毕业设计（论文）成果归东华理工大学所有。 特此声明。 毕业设计（论文）作者（签字）： 签字日期： 年 月 日 本人声明：该学位论文是本人指导学生完成的研究成果，已经审阅 过论文的全部内容，并能够保证题目、关键词、摘要部分中英文内容的 一致性和准确性。 学位论文指导教师签名： 年 月 日 挂果后期南丰蜜桔园土壤固氮菌多样性的研究 A Study on Soil Azobacter Diversity of Nanfeng Orchard after Fruiting 2013 年 6 月 10 日 -1- 摘 要 南丰蜜桔是一种历史悠久的柑橘良种。本文通过对不同地点南丰蜜橘园土壤固氮 菌多样性进行研究，旨在探明不同品质南丰蜜桔形成的土壤原因。 通过对挂果后期莱溪 2 号土、军峰 3 号土、市山 5 号土、旴江 8 号土、军峰 1 号 土、县城 7 号土的土壤固氮菌种类数和个体数及对应关系计算出 Ni 和 Si，再运用 多 样性指数公式计算，结果表明 6 个生境的物种丰富度指数(d ma)的取值范围在 0.44890.9724 之间，Simpson 指数(D)的范围是 0.34820.7399 之间，多样性指数(H) 的范围是 0.87941.4729，均匀度指数 Jsw 为 0.65920.8221，距离系数 B-C 的范围是 0.200520.84053。 从实验结果来看：市山 5 号、旴江 8 号、县城 7 号土壤中固氮菌平均物种数最多； 平均个体数最高的是莱溪 2 号土；军峰 3 号土中固氮菌的平均物种数与个体数为最低。 关键词：南丰蜜橘；多样性指数；物种丰富度；土壤固氮菌 -2- Abstract Nanfeng orange is a long history of Citrus Varieties. In this paper, through the study of different locations in Nanfeng orange orchard soil nitrogen-fixing bacteria diversity, soil factors to the effects of different quality of Nanfeng orange formation. Through the after fruiting Laixi 2 soil,Junfeng 3 soil,Shishan 5 soil,Xujiang 8 soil,Junfeng 1 soil and Xiancheng 7 soil Azotobacter species number and individual number and the correspondence of the calculated Ni and Si,then use alpha diversity index formula the results show that the 6 habitats,species richness index (dma)values in the range of 0.44890.9724, Simpson index (D)is in the range between 0.34820.7399, the diversity index (H) of range of 0.87941.4729, evenness index Jsw is 0.65920.8221,distance coefficient B-C is in the range 0.200520 .84053. From the experimental results:Shishan 5,Xujiang 8 and Xiancheng 7 soils nitrogen- fixing bacteria species most;Laixi 2 soil get the highest average number of individuals;Junfeng 3 soil Azotobacter species and individual number of average minimum. Key words: Nanfeng Orange; diversity index; species richness; soil nitrogen-fixing bacteria -1- 目 录 一、 绪论 .1 （一） 柑橘发展现状 .1 （二）南丰蜜桔及研究现状 .3 （三）土壤微生物多样性的研究现状 .4 （四）土壤微生物多样性研究意义 .9 二、材料及方法 13 （一） 实验材料 13 （二） 实验方法与步骤 15 三、结果与分析 .18 （一）土壤固氮菌形态及生物学特征 .18 （二）土壤固氮菌多样性指数计算与聚类分析 .20 四、讨论与小结 .28 （一） 讨论 .28 （二） 小结 .28 主要参考文献 30 致谢 32 东华理工大学 2013 届 本科生毕业设计（论文） 绪 论 - -1- 一、绪 论 柑橘属于芸香科Rutaceae柑橘亚科Aurantioideae 柑橘属Oryza ，柑橘是世界第一 大果树品种。在世界百果中，其种植面积和产量均居首位。全球有135个国家和地区 生产柑橘，有40多个国家主产柑橘。我国是柑橘的主要原产国之一，有文字记载的 栽培历史达4000多年，经过长期栽培、选择，柑桔成了人类的珍贵果品。据考证， 直到公元1471年，桔、柑、橙等柑橘类果树才从中国传入葡萄牙的里斯本，公元 1665年才传入美国的佛罗里达。在中国，浙江省台州市黄岩是个蜜桔之乡。2008年 我国柑橘的种植面积为2030.8千公顷，产量达2331.26万吨，均位居世界第一位。其 他柑橘的主要产国有巴西、美国、墨西哥、西班牙、伊朗、印度、意大利等。柑橘 是世界上的主要农产品之一。 中国柑橘主要分布在北纬 1637 之间，海拔最高达 2600 米（四川巴塘） ，南 起海南省三亚市，北至陕、甘、豫，东起台湾省，西至西藏的雅鲁藏布江河谷。但 中国柑橘的经济栽培区主要集中在北纬 2033 之间，海拔 7001000 米以下地区。 全国生产柑橘包括台湾省在内有 19 个省（市、自治区） 。其中主产柑橘的有浙江、 福建、湖南、四川、广西、湖北、广东、江西、重庆和台湾等 10 个省（市、区） ， 其次是上海、贵州、云南、江苏等省（市） ，陕西、河南、海南、安徽和甘肃等省也 有种植。全国种植柑橘的县（市、区）有 985 个。根据气候特点,可分为北热带、南 亚热带、中亚热带和北亚热带等 4 个柑橘产区。 （一）柑橘发展现状 1 1.世界柑橘业概况 目前全世界有 135 个国家和地区生产柑橘。自 20 世纪 80 年代中期以来，世界 柑橘生产和消费经历了一个强劲的增长时期，甜橙类、宽皮柑橘类、柠檬和酸莱姆 类柑橘均得到了快速发展，产量水平的提高使柑橘的总消费量和人均消费量均达到 了更高的水平。 2.世界主要柑橘类型 甜橙由于适合榨汁和鲜食且耐贮运，是世界柑橘的主要种类，主要的柑橘产区 都生产甜橙。 宽皮柑橘作为世界上生产量仅次于甜橙的柑橘类果品，以其品种多样、品质优 良、剥皮容易、食用方便而受到消费者的欢迎。我国是世界上最大的宽皮柑橘生产 国，宽皮柑橘生产国还有巴西、日本、美国、韩国、西班牙和意大利等国。 东华理工大学 2013 届 本科生毕业设计（论文） 绪 论 - -2- 葡萄柚的果肉多汁、味酸，略带苦味，风味佳美，鲜食与加工制汁皆宜，不少 品种长时间留树贮藏而能保持风味和品质不变。葡萄柚主产于美国、巴西、古巴、 以色、列、墨西哥、阿根廷以及南非。 3.我国柑橘品种 真正柑橘类果树包括 6 个属， 其中具有商品价值的是其中 3 个属，即：枳属 Poncirus、金柑属 Fortunella 和柑橘属 Citrus，柑橘属植物的经济栽培价值最大， 其 中有重要商品价值的种为： 甜橙、宽皮柑橘、葡萄柚、柚、柠檬、酸橙、枸橼、酸 莱姆。我国当前的主要栽种品种是柑、橘、橙、柚。由柑橘种间产生的大量杂交类 型， 统称为杂柑 Citrus hybrids 这些品种近年来数量不断增加， 生产上趋于逐渐扩 大之中。我国柑橘种类繁多，品种间的变异，使我国柑橘可利用品种也在不断增加。 4.我国柑橘生产现状 从解放初期到 1978 年，中国柑橘产量一直在 30 万 t 上下徘徊。1978 年，我国 大陆柑橘总产量为 38.3 万 t ，居世界第十三位，约相当于我国台湾的产量。改革开 放以后，尤其是 1984 年国家对水果实行了“市场放开、价格随行就市和渠道流通” 的改革政策，国产生产热情高涨，果园面积迅速扩张，产量也大幅度增长。1980 年， 栽培面积 26.9 万公顷，总产量 111.1 万 t；到 2000 年，栽培面积己达 130 万公顷， 居世界首位，产量 1079 万 t，占世界柑橘总产量的 10.5%，居世界第三位；2004 年， 我国柑橘的生产又上了一个新台阶，面积达到 146.5 万公顷，分别是居第二位的巴 西和美国的 1.6 倍和 3.4 倍，而产量也提高到 1448.2 万 t，接近排名第二位的美国的 水平，为 1980 年产量的 13 倍。2011 年，全国柑橘栽培面积 228.8 万公顷（3432 万 亩） ，总产量 2944.04 万吨，与 2010 年面积 221.11 万公顷（3316.65 万亩）相比，净 增面积 7.69 万公顷（115.35 万亩） ，增长 3.48%；总产量由 2010 年的 2645.24 万吨 上升到 2944.04 万吨，净增 796.60 万吨，增长 11.3%。柑橘的平均亩产由 2010 年的 796.60 千克上升到 857.82 千克，净增 61.22 千克，增长 7.7%。我国不论是柑橘栽培 面积还是总产量均居世界首位，栽培面积占全球的 30%左右，产量占全球的 26%左 右。平均亩产与世界平均亩产 1000 千克比较差距也不断缩小。柑橘已成为仅次于苹 果的第二大水果产业，柑橘产业正在由生产大国向生产强国迈进。 5.柑橘种植与销售存在的问题 近年来我国柑橘销售总会遇到滞销的问题，很多柑橘不能及时销售出去，给橘 农带来不小的损失，供大于求的局面容易造成“卖橘难” ，柑橘供给结构过剩导致柑 东华理工大学 2013 届 本科生毕业设计（论文） 绪 论 - -3- 橘鲜果供应竞争激烈。柑橘销售难主要有一下几方面的原因：一是我国柑橘种植品 种不是很合理，目前我国柑橘主要的品种还是宽皮柑橘，如蜜橘等为主。这些品种 只能用于鲜食和加工罐头，而罐头市场已经饱和，很难再扩大产量，所以大量宽皮 柑橘都被推到鲜食市场上进行销售，销售压力较大；二是我国柑橘成熟期以中晚期 为主，柑橘上市都集中在 9 月12 月，销售期非常集中，在短期内形成柑橘供给的 恶性竞争；三是我国橙汁加工能力还不足，不能及时完成鲜果的加工。 （二）南丰蜜桔及研究现状 2 南丰蜜桔是独具特色的地方品种，距今已有 1300 多年栽培历史，以皮薄核少、 汁多化渣、甜酸适口、风味独特而享誉中外，被斯大林誉为“桔中之王” 。2003 年， 南丰蜜桔被国家质量监督检验检疫总局批准为原产地域保护产品，这是我国最早获 原产地域保护的柑桔品种，同年 11 月，南丰县蜜桔果业有限公司注册的“南丰蜜桔 牌”南丰蜜桔被中国绿色食品发展中心认定为绿色食品 A 级产品。 1.南丰蜜桔栽培及生产情况 南丰蜜桔自 1991 年遭遇毁灭性的冻害至今，种植面积已由当时仅存的 2.04 万 亩发展到 2005 年底的 35 万亩，产量从 1992 年的 72 吨发展到 2005 年的 25 万吨。 2002 年我县南丰蜜桔产值首次超过全县粮食总产值，成为南丰县县域经济的支柱产 业之一。2004 年， 我县农民人均纯收入 3645 元中有近 1/3 来自蜜桔产业, 达 1170 元，其中农民增收的 803.8 元中有 467 元来自南丰蜜桔产业;2005 年农民人 均纯收入增收的 701 元几乎都来自南丰蜜桔产业。 2.南丰蜜桔产业发展情况 近年来，南丰蜜桔采后商品化处理、保鲜、贮藏、深加工和市场营销及市场监 管日益受到县委、县政府和政府相关部门的重视，采后商品化处理从无到有。2000 年，飞环酒业股份有限公司（现煌佳酒业科技股份有限公司）初步建成投产，该企 业设计生产能力为年产干黄果酒 0.5 万吨，年消耗南丰蜜桔鲜果近 1.5 万吨；2004 年， “超大”屯光分选、 “梦龙”机械分选等 2 条设计日加工能力 100 吨和 40 吨的南 丰蜜桔产后处理生产线初步建成试产， “超大” 、 “桔都丰盛果业”等 2 家设计年贮藏 能力为 1000 吨和 600 吨的保鲜冷库建成投产；目前，南丰县还建成了南丰蜜桔专业 批发市场（桔都大市场） ，用油南丰蜜桔出口自主权的企业 2 家（梦龙果业、南丰微 红果业有限公司） ，2005 年，南丰县销往东南亚、俄罗斯、加拿大、欧盟及北美等 国际市场的南丰蜜桔达 4 万吨。此外，南丰蜜桔产业的发展还带动了多家塑料和纸 箱包装企业的发展，其中上规模企业就有 4 家，有机肥生产企业 1 家（兰鑫有机肥 东华理工大学 2013 届 本科生毕业设计（论文） 绪 论 - -4- 厂） ，在建的深加工企业 1 家（江西安发达酒业有限公司） 。随着南丰蜜橘种植面积 和果品资源的不断发展，南丰蜜橘产业链条也在不断延伸，正涌现出一大批实力较 强的企业落户我县，如福建超大集团、福建神龙集团等正在介入有机肥等生产资料 和蜜橘果汁的开发。 3.南丰蜜桔发展潜力和前景 中国加入 WTO 后,随着国内市场与国际市场接轨,市场自由化进程加快，21 世 纪的南丰蜜桔发展前景将更加阔广。在柑桔市场竞争中，蜜桔品种的优势显得越来 越重要。一个好的柑桔品种，不仅其果形均匀、内质优良，而且丰产、稳产，无大 小年区别，其优良的外形和内质具有明显的市场竞争优势。据县政协有关调查数据 显示：品系、苗木质量对果实品质的影响甚大。南丰蜜桔小果系及中、大果系，其 果实大小和果实风味有较大差异，一般小果系南丰蜜桔最能体现出南丰蜜桔的优良 特性。因此，只有不断地选育出南丰蜜桔优良品种，提纯复壮后进行试验示范，随 时准备更换淘汰那些产量相对较低，外观和内质相对较差的劣势品种，从品种上保 证南丰蜜桔的市场竞争优势，才能确保南丰蜜桔产业的长盛不衰。 （三）土壤微生物多样性的研究现状 1.土壤概况 土壤位于地球陆地表面，具有一定肥力，能够生长植物的疏松层。土壤是在特 定成土条件下，经过漫长的成土过程逐渐发育和形成的历史自然体。土壤是固态地 球表面具有生命活动，处于生物与环境间进行物质循环和能量交换的疏松表层。土 壤是发育于地球陆地表面具有生物活性和孔隙结构的介质，是地球陆地表面的脆弱 薄层土壤是各种陆地地形条件下的岩石风化物经过生物、气候诸自然要素的综合作 用以及人类生产活动的影响而发生发展起来的。土壤是一个复杂而多相的物质系统。 它由各种不同大小的矿物颗粒、各种不同分解程度的有机残体、腐殖质及生物活体、 各种养分、水分和空气等组成。 2.土壤微生物研究 土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的 转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。根 际微生物与植物的关系特别密切，不同的土壤和植物对根际微生物产生显著影响， 而不同的根际微生物由于其生理活性和代谢产物的不同，也将对土壤肥力和植物营 养产生积极或消极的作用。土壤微生物不仅对土壤的肥力和土壤营养元素的转化起 东华理工大学 2013 届 本科生毕业设计（论文） 绪 论 - -5- 着重要作用，而且对于进入土壤中的农药及其他有机污染物的自净、有毒金属及其 化合物在土壤环境中的迁移转化等都起着极为重要的作用 3。 土壤中的微生物种类繁多，数量极大，一克肥沃土壤中通常含有几亿到几十亿 个微生物，贫瘠土壤每克也含有几百万至几千万个微生物，一般说来，土壤越肥沃， 微生物种类和数量越多。另外，土壤表层或耕作层中及植物根附近微生物数量也较 多。土壤中的渐生物主要有细菌、真菌、放线菌、藻类和原生动物。土壤中的微生 物以细菌数量最多，细菌占土壤微生物总量的 70%90%，而且种类多，它们多数 是异养菌，少数是自养菌。放线菌的数量仅次于细菌，多存在于偏碱性的土壤中， 主要是链霉菌属、诺卡菌属和小单孢菌属等。放线菌虽然数量比细菌少，但由于其 菌丝体的体积比单个细菌大几十倍甚至几百倍，所以在土壤中的生物量也相近于细 菌。土壤中的真菌各种类型都有，但以半知菌类为最多，主要分布于土壤表层中。 土壤中的藻类数量远远少于上述各类，主要有绿藻、硅藻等。土壤中的原生动物都 是单细胞异养型的，主要是纤毛虫、鞭毛虫、根足虫等。上要是纤毛虫、鞭毛虫、 根足虫等。 19 世纪后期，农业化学和细菌学的形成和发展为研究土壤中物质转化的微生物 学过程开辟了道路。1877 年，施勒辛和明茨证实了土壤中的硝化作用是通过微生物 进行的。 18851888 年间，维诺格拉茨基用他首创的无机选择性和富集培养法分 离得到能使铵氧化为亚硝酸和使亚硝酸氧化为硝酸的两种细菌。同时，他还发现了 硫细菌并研究了土壤中的硫化作用。他的研究不仅论证了土壤中氮和磕的还原性化 合物的微生物学氧化作用，也揭示了土壤中化能无机营养型细菌。1888 年，黑尔里 格尔和维尔法特证实了豌豆只有在未灭菌的土壤中或在加有土壤浸出液的灭菌砂土 中才能在根部结瘤，从而利用空气中的氮素为营养。同年，拜耶林克从根瘤中分离 并获得根瘤菌的纯培养。1891 年，韦林顿又证实了硝化作用不仅在土壤中发生，也 可以在含有铵盐的液体中用土壤接种产生。1889 年，普拉兹莫夫斯基确认了根瘤菌 与豆科植物的共生固氮作用。1899 年维诺格拉茨基发现厌气性的固氮梭菌，1901 年， 拜耶林克发现好气性的固氮菌，开辟了探讨微生物固氮作用的研究领域。1904 年， 奥梅良斯基分离得到纤维分解细菌，开创了土壤有机物质分解的微生物过程的研究。 这些先驱者们从不同方面奠定了土壤微生物学在 20 世纪迅速发展的基础。瓦克斯曼 的土壤微生物学原理 、弗雷德等人的根瘤菌和豆科植物以及维诺格拉茨基 18911925 年间的论文集土壤微生物学问题与方法 ，是土壤微生物学早期 研究中的丰硕成果。 在 20 世纪 50 年代，土壤微生物学已经得到迅速的发展。人们对土壤中诸营养 元素循环的各个环节的微生物学过程，包括起作用的微生物种类和作用条件进行了 深入的研究，既阐明了土壤腐殖质形成和分解的微生物学过程，也论证了土壤微生 物对增强土壤肥力的作用。瓦克斯曼对土壤微生物间拮抗关系的研究，特别是对拮 东华理工大学 2013 届 本科生毕业设计（论文） 绪 论 - -6- 抗性放线菌所产生的各种抗菌性物质的研究成果，为抗生素发酵工业的兴起作出了 巨大贡献。 3.土壤固氮菌的研究 近几十年来，微生物固氮作用的研究已是当前在理论和实践中的重大课题。氮 15 示踪法和乙炔还原法有力地促进了对固氮微生物和固氮作用的研究与应用。 1970 年巴西的多布雷娜报道雀稗根系有专性共栖的固氮菌，接着又在马唐和玉 米根际发现有共栖的固氮螺菌，提出了介于共生固氮和自生固氮之间的联合固氮作 用。另外，由于固氮酶的提取成功，使固氮酶的结构、性质以及固氮机理得到了阐 明，目前正在通过人工诱变和基因转移，向培育高效固氮微生物新种的方向努力。 研究发现，与根际固氮菌相比，植物内生固氮细菌占据更加有利的生态位，因为它 能定殖于植物内部，更便于利用植物提供的碳源和发挥固氮酶的作用 4。 土壤中的氮素损失一直是土壤微生物学家重视的问题。目前正在研究以抑制硝 化细菌活动的方式，减少土壤中的硝化作用和反硝化作用，防止氮肥的损失和避免 因形成亚硝酸而污染水域 5。 陈晶等的研究表明，不同农药及其不同浓度对自生固氮菌生长及固氮量的影响 有所不同。为添加固氮菌以提高农作物产量,监测固氮菌含量来评估作物产量，以及 田间正确使用农药提供了理论依据 6。另外目前利用固氮菌开发的生物型肥料也日 益应用在了绿色农业生产中。 4.土壤微生物多样性的概念 7 土壤微生物多样性指生命体在遗传、种类和生态系统层次上的变化。它代表着 微生物群落的稳定性，也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。土壤微生物 多样性还可以定义为微生物生命的丰富性，通常以土壤生物区系的变化和生物化学 过程间的相互关系来反映。多样性包括二部分内容：种类数量和它们的分布。 5.土壤微生物多样性影响因素 8 影响土壤微生物群落的结构组成和多样性，尤其是其功能多样性的因素有很多 种，可大体分成自然因素和人为因素两大类。自然因素包括植被、土壤类型、温度、 水分以及pH等；人为因素包括农药、施肥以及土壤耕作方式等人类对土壤的管理方 式。 东华理工大学 2013 届 本科生毕业设计（论文） 绪 论 - -7- 6.土壤微生物多样性研究方法 9, 10 生态学意义上的“生物多样性”，一般包括遗传多样性、物质多样性和生态系 统多样性3个方面。从国内外对这3方面的研究来看，对土壤微生物多样性的研究方 法大致包含以下几类： （1）微生物平板计数法 微生物平板计数法是一种传统的方法，它采用特有的培养基对土壤中可培养的 微生物进行培养分离，然后根据微生物的菌落形态和菌落数来测定微生物的类型和 数量。由于所用的培养基有一定的针对性，且能够纯培养的土壤微生物的菌株的数 量只占微生物综述的0.1%1% ，因此很难提供有关微生物群落结构的信息。 （2）Biolog微平板法 Biolog微平板法是测定土壤微生物对95种不同碳源的利用能力及其代谢差异， 今儿用以表征土壤微生物代谢功能多样性或结构多样性的一种方法。该方法利用由 95孔不同单一碳源和1个对照孔组成的Biolog微平板系统，除对照孔外，其余孔内分 别含有不同的有机碳源和一种指示剂，通过接种菌悬液，根据微生物对碳源利用时 指示剂颜色变化差异来鉴定为生物群落功能多样性。Biolog已被证明可以用于鉴定 不同土壤系统中的土壤微生物群落结构，但目前的数据库中菌种资料不完善，有些 只能得到相似的类群。因此该方法虽相对简单，但对于微生物的分类鉴定来说还远 远不够。 （3）脂肪酸分析法 磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acid，PLFA ）是所有微生物细胞膜磷脂的成分， 具有结构多样性和较高的生物学特异性，成为微生物分类的主要依据。依据这个特 性，磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acid，PLFA）图谱分析法、脂肪酸（Fatty Acid）和脂肪酸甲酯（ Fatty Acid Methyl Ester，FAME）图谱分析法等已应用于对感 染致病微生物以及人类和动物体内微生物卫生的研究方面。由于所生成的这些脂肪 酸对于不同生物在组成成分上可显示出极大的差异，因此许多研究者用包括土壤在 内的环境样中可提取磷脂嘞化合物中的脂肪酸（PLFA）组成来直接估价微生物的群 落结构。另外，PLFA的组成和浓度可能受土壤微生物生长发育及外界环境的影响， 难以区别死与活的微生物，因此在操作过程中需要严格把握质量保证和质量控制， 排除各种可能发生的误差干扰。 （4）分子生物学方法 随着现代分子生物学技术的发展使生物领域的研究更加深入，以核酸分析技术 为主的分子生物学技术（如PCR、RFLP 、RAPD、PCR-DGGE/TGGE、AFLP、SSR 等）的广泛应用，从分子水平揭示生物多样性提供了新的方法论，开拓了分子生物 学与生态学的交叉领域，分子生物学技术也逐渐被应用到土壤微生物多样性的研究 中来。PCR技术即聚合酶链式反应，是通过体外扩增核酸序列从而得到多个核酸拷 东华理工大学 2013 届 本科生毕业设计（论文） 绪 论 - -8- 贝的一种技术，可用来对土壤微生物DNA扩增，并对扩增的产物进行定量或定性分 析。使用PCR技术分析基因多态性，可以表征土壤环境微生物遗传多样性的动态变 化。 7.土壤微生物多样性的研究状况 土壤生物是重要的基因库，土壤生物多样性是全球生物多样性的重要组成部分。 土壤是一个固、液、气三相组成的高度异质环境，发育着丰富的微生物类群（主要 有细菌、放线菌和真菌三大类) 11。土壤生物是地下生态系统的重要组份之一，几 乎所有的土壤过程都与土壤生物有关。土壤微生物种类繁多、数量巨大，加上其微 小的个体，给土壤微生物的研究带来很大的困难。土壤微生物的多样性及变异性， 反映了他们对环境的适应性。植被通过影响土壤环境，从而影响到土壤微生物的结 构和多样性，所以研究植被多样性和土壤微生物群落多样性之间的相互关系，对于 促进林区土壤生态、微环境气候等有积极作用 12。夏北成等 1998 年利用限制性内 切 DNA 片段多态性进行分析，研究植被对土壤微生物多样性的影响，结果表明土 壤环境在植被的影响下更有利于微生物的生长与繁殖,生物与具繁殖活动的生物种群， 其生命代谢过程更旺盛，反之亦然 13。 近年来，随着从环境中提取微生物群落 DNA 方法的改进,按样品中 DNA 来计 算微生物数目和种类的技术得到了较大发展，这为微生物多样性的研究提供了一些 有益的思路。 DNA 的多样性是生物多样性的本质内容。现代分子生物学技术在微生物多样 性研究上的应用克服了微生物培养技术的限制，能对样品进行较客观的分析，较精 确地揭示了微生物种类和遗传的多样性。目前分子生物学在微生物多样性的应用研 究有很多。如：向万胜综合评述了土壤微生物提取与纯化研究的最新进展及存在的 主要问题。土壤微生物的分离提取过程一般分为土壤分散、提取与纯化 3 个步骤。 采用过滤、离心和淘选 3 种方法可以成功地分离提取大部分土壤细菌；但土壤真菌 的提取则相对较为困难，目前可采用的方法有旋转框技术、液相提取与滤膜检测、 以及低速离心技术这些方法可提取出部分真菌菌丝。两相分离技术可用以对提取的 土壤微生物进行纯化 14。 董慧明等认为土壤中的微生物多样性是十分丰富的，传统培养方法对土壤微生 物多样性的研究有很大局限性。近年来，各种基于 16SrDNA 基因的指纹图谱分析技 术取得了长足的进步，并广泛应用于土壤微生物多样性的研究。这些技术主要有变 性梯度凝胶电泳（DGGE）温度梯度凝胶电泳（TGGE） 、单链构象多态性 （SSCP ） 、随机引物扩增多态性 DNA（RAPD ） 、限制性片段长度多态性（ RFLP） 和扩增核糖体 DNA 限制性分析（ARDRA）等 15。采用分子生态学的方法研究土 壤微生物多样性,尤其以分子生物学技术以及随机扩增的多态性分析方法更为精确和 东华理工大学 2013 届 本科生毕业设计（论文） 绪 论 - -9- 快速，为土壤微生物多样性研究提供了一个更加广阔的前景。 张微等认为土壤中存在丰富的微生物资源，不同土壤系统具有不同的微生物群 落，微生物多样性既依赖于生态系统又服务于生态系统。他们从物种多样性、遗传 多样性、生态类型多样性、功能多样性四个方面对土壤微生物多样性进行了新的诠 释，总结论述了土壤微生物多样性与环境因子如土壤、植物群落和气候条件之间的 关系，并对目前存在的问题和今后面临的挑战提出几点看法 16。 罗海峰等运用分子生物学技术，以澳大利亚两种主要森林类型的土壤微生物多 样性研究为实例，介绍了从土壤中直接提取土壤微生物 DNA 的方法以及末端限制 性酶切片段长度多态性(T-RFLP)分析的基本原理和方法。作者认为，用该方法提取 的土壤真菌 DNA 的纯度高，完全适合 PCR 扩增和 T-RFLP 分析的要求。T-RFLP 已 成为国外深入研究土壤微生物多样性的理想方法之一 17。 土壤微生物在其生命活动过程中需要能量和养分，并对温度、通气性等有一定 要求。许多对植物或动物有害的物质如酸害、杀虫剂、重金属等超过一定限度同样 会影响或危及土壤微生物。鉴此，有人提出借助土壤微生物对重金属的效应来进行 土壤污染诊断和确定土壤环境容量标准。如：姚健等利用 RAPD 分子遗传标记法研 究农用化学品污染对土壤微生物群落 DNA 序列多样性的影响，结果表明 4 种不同 污染程度的土壤微生物群落序列在其均匀度指数、丰富度指数等方面均存在差异； 杨永华等利用 BIOLOGN 微平板法研究了农药污染对土壤微生物群落功能多样性的 影响,结果表明土壤微生物的群落功能多样性指数差异显著，农药严重污染土壤微生 物群落功能多样性比无污染土壤群落要低 18；有些学者利用 PCR-DGGE 方法分析 了不同污染程度土壤细菌的群落结构，结果表明，在微生物群落结构上显示出了极 大的差异性 19。另外，利用病毒作为转基因的载体，可以将一些抗病或高产的目的 基因转入植物细胞中使之表达，提高植物的抗病虫害能力。 （四）土壤微生物多样性研究意义 土壤是由不同理化梯度和间续环境条件下的各种微域构成的复杂体系。土壤微 生物适宜群居在具有一定界限的微域环境里，与其他土壤生物既彼此依赖又相互作 用。基于微域水平的空间分异研究显示，土壤80%以上细菌栖息在土壤稳定团聚体 的微孔内，因为微孔提供了最为有利的水分与养分生长条件。而土壤团聚体粒级大 小可以显著影响土壤pH及有机质的种类和数量等，进而也会影响微生物的群落结构 20。土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压 和温度等条件，所以土壤是微生物生活的良好环境。土壤中的微生物不仅种类繁多， 而且数量也是惊人的。据估计，每亩耕作层土壤中，以土壤有机质含量为2计算， 细菌湿重约有90-225kg，则所含细菌干重约为土壤有机质的1左右。通过土壤微生 物的代谢活动可以改变土壤的理化性质，促进土壤的形成和发育，进行氮、磷、钾 东华理工大学 2013 届 本科生毕业设计（论文） 绪 论 - -10- 等物质和能量的转化，因此土壤微生物是构成土壤肥力的重要因素 21。 正是由于微生物具有多种代谢方式和生理功能，因此能适应各种不同的生态环 境，并能以不同的方式和其他生物相互作用，进而构成了地球上丰富多彩的生态体 系。土壤微生物多样性影响土壤生态系统的结构和功能，是维持土壤生产力的重要 组分 22。 微生物多样性的研究，对于人类在缓解粮食、能源、资源和环境方面的危机， 均有着全方位的重大意义：（1）微生物在生物圈的维持中起中枢作用，是地球生化 循环的主要推动者，可用于监控环境变化，治理环境污染；（2）极端环境微生物的 研究可为人类探索生命的极限、为超常物质的开发提供资源，在生物技术领域亦具 有价值；（3）微生物在高等生物的保护和生态恢复中起重要作用，如菌根真菌可以 帮助植物成功定植在土壤中，实现目标地区的森林再造；（4）微生物在地球的起源 早，具有独特的交叉反应且容易操作，可作为阐明生态演化和生物进化原理的模式 种群。 土壤微生物的多样性远远超过其他媒介，如水体，因此是挖掘微生物资源的重 要基地 23。 1.橘园土壤微生物多样性研究意义 南丰蜜桔以及其他植被与土壤微生物多样性关系很密切，土壤微生物的多样性 及变异性，反映了它们对环境的高度适应性。植被通过影响土壤环境，从而影响到 土壤微生物的结构和多样性，而微生物则作为土壤中植物有效养分的储备库，促进 植物对养分的吸收，从而对植物生长具有促进作用，所以研究植被多样性和土壤微 生物群落多样性之间的相互关系，对于促进林区土壤生态、微环境气候等有积极作 用。 鉴于生物多样性在维持土壤质量、维护陆地生态系统的稳定和健康方面的重要 作用，种植出的蜜桔品质相比正宗的南丰蜜桔要差，因此南丰土壤微生物多样性的 研究对南丰蜜桔优良品质的保护具有重要意义。 （1） 土壤微生物多样性在蜜桔品质中的作用 土壤形成过程中微生物腐解等作用，不断地促进土壤肥质的积累和循环，释放 出能够被植物利用的营养元素,提供作物以速效性养分。所以微生物种类越丰富，则 土壤肥力越高，蜜桔的品质也更高。对土壤微生物多样性的研究，便于进一步控制 它们的活动规律，扩大它们在蜜桔品质中的作用 24。 （2） 土壤微生物多样性与植物抗病虫害能力 根际微生态环境中，大量土壤微生物在植物根冠周围的分泌物形成一个粘质层， 进而构成一个相对稳定的微生态环境。这对保护植物根系、提供营养物质、减少病 原菌和虫害入侵具有重要作用。土壤微生物多样性指标与生态系统抵御外界干扰的 东华理工大学 2013 届 本科生毕业设计（论文） 绪 论 - -11- 能力密切相关。从植物病害发生的理论来说，土壤生态环境的恶化，土壤微生物区 系的破坏，更易使植物发生病害。 （3） 土壤微生物多样性与土壤污染 土壤微生物在其生命活动过程中需要能量和，并对温度、通气性等有一定要求。 许多对植物或动物有害的物质如农药、杀虫剂、重金属等超过一定限度同样会影响 土壤微生物分布，土壤具有分解对生物有毒的化合物的作用，这种作用是靠土壤中 的微生物，主要是细菌来完成的 25。 有人提出借助土壤微生物对重金属的效应来 进行土壤污染诊断和确定土壤环境容量标准，如：姚健等利用 RAPD 分子遗传标记 法研究农用化学品污染对土壤微生物群落 DNA 序列多样性的影响，结果表明 4 种 不同污染程度的土壤微生物群落序列在其均匀度指数、丰富度指数等方面均存在差 异；杨永华等利用 BIOLOGGN 微平板法研究了农药污染对土壤微生物群落功能多 样性的影响，结果表明土壤微生物的群落功能多样性指数差异显著，农药严重污染 土壤微生物群落功能多样性比无污染土壤群落要低。另外，还利用 PCRDGGE 方 法分析了不同污染程度土壤细菌的群落结构，结果表明，在微生物群落结构上显示 出了极大的差异性 26。 （4） 土壤微生物多样性研究的环境意义 土壤微生物多样性与土壤生态稳定性密切相关，因此，研究土壤微生物群落结 构及功能多样性，特别是应用分子生物学技术、在基因水平上来研究土壤微生物多 样性，已成为当今世界上土壤学科及环境科学学科研究的前沿领域之一。近年来， 人们借助 BIOL(X)微量板分析技术、细胞壁磷脂酸分析技术和分子生物学方法等对 污染土壤微生物群落变化也进行了一些研究，结果表明土壤中残留的有毒有机污染 物不仅能改变土壤微生物生理生化特征，而且也能显著影响土壤微生物群落的结构 和功能多样性。如通过 BIOLOG 微量板分析技术研究发现，农药污染将导致土壤微 生物群落功能多样性的下降，减少了能利用有关碳底物的微生物数量，降低了微生 物对单一碳底物的利用能力。而采用随机扩增的多态性 DNA(Random Ampled Polymorphic DNA，RAPD)分子遗传标记技术的研究表明，农药厂附近农田土壤微生 物群落 DNA 序列的相似程度不高、均匀度下降，但其 DNA 序列丰富度和多样性指 数却有所增大，也即表明农药污染很可能会引起土壤微生物群落 DNA 序列本身发 生变化，如 DNA 变异、断裂等 27。 （5） 土壤微生物多样性与植物多样性保护 土壤中丰富的微生物类群是土壤中的主要分解者，对环境起着天然的“过滤” 和“净化”作用，在自然生态系统的功能发挥和维持能力方面极其重要。植物，土 壤和微生物相互作用，构成了一个植物土壤微生物的有机整体，而有的植物与 微生物更是紧密的共生关系。土壤微生物多样性代表着微生物群落的稳定性，指生 命体在遗传、种类和生态系统层次上的变化。植被的破坏可直接导致土壤微生物多 东华理工大学 2013 届 本科生毕业设计（论文） 绪 论 - -12- 样性的丧失，而土壤微生物对植物物种多样性的维持又具有重要作用。因此，加强 土壤微生物多样性研究对植物多样性保护具有重要意义。 2.南丰蜜橘挂果后期橘园土壤微生物多样性研究意义 氮素是蛋白质的主要成分，因此是植物生长所必须的首要营养元素。植物需要 氮肥，犹如人体需要蛋白质一样。但是世界上大多数地区的土壤都缺乏氮素养分， 为了获取农作物高产，需要施用大量氮肥。据计算，生产 1 吨小麦要吸收氮素 23 公 斤。我国每年生产用作氮肥的合成氨约 2000 万吨，仍远远不能满足农业生产的需要。 更值得注意的是人工合成氮素肥料要耗费大量能源，不仅成本高，而且污染水源和 空气，破坏生态环境，危害人类健康，进口化肥需要巨额资金；长期使用化肥还会 破坏土壤结构，使土壤扳结。而这些橘园土壤固氮菌能够直接吸收空气中的氮素作 为养料，通过植物共生，将空气中的分子态氮先还原成植物可以利用的氨，从而解 决了这些农作物的氮的供应，以获取农作物高产（据推算，全世界每年施用的氮素 化肥中的氮素大约有 8107t，而自然界每年通过生物固氮所提供的氮素，则高达 4108t。 ） 。最可贵的是固氮菌的这种生物固氮方式既环保又高效，所以对不同品质 南丰蜜橘挂果后期橘园土壤微生物多样性研究能为合理的利用这一环保高效的的资 源做出重要的理论依据，对提高南丰蜜桔的产量品质，减少致癌物对人类的危害有 着积极的作用。 固氮菌除能固氮之外，还能形成维生素和异生长素。不仅能刺激农作物生长发 育，提高产量，也能加强其他根际微生物的生命活动，促进土壤有机物质的矿化作， 改良土壤结构，改善农作物品质。这也是橘园土壤固氮菌研究重要性另一个方面的 体现。 由于人类对自然环境、自然资源的过度开发和强烈干预，使得地球上数以万计 的物种消失或濒临灭绝，生境遭受严重破坏，生物多样性丧失，生态系统稳定性减 弱，资源日益枯竭。土壤微生物是陆地生态系统中重要的生命体，对所生存的微环 境十分敏感。目前土壤微生物指标已被公认为土壤生态系统变化的预警及敏感指标， 因此橘园土壤微生物多样性的研究对橘园的保护具有重要意义。 3.南丰蜜橘挂果后期橘园土壤微生物多样性比较研究意义 江西南丰蜜橘因其地理位置的独特性和其口味的甘甜而为生物学家所重视。土 壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在土壤有机物质分解和养分释放、能量 转移等生物地化循环中起着重要作用。随着人们对生物多样性重要性认识的不断深 入及研究方法的不断改进，土壤微生物多样性，尤其是功能多样性的研究工作逐渐 受到生态学家的重视。所以我们通过南丰蜜橘挂果后期橘园土壤微生物多样性比较 研究进一步了解和利用土壤微生物的多样性对植物的影响。 东华理工大学 2013 届本科生毕业设计（论文） 材料与方法 - -13- 二、材料及方法 （一）实验材料 1.实验材料来源 本试验所选用的材料是采自莱溪 2 号土壤，军峰 3 号土壤，市山 5 号土壤，旴 江 8 号土壤，军峰 1 号土壤，县城 7 号土壤，详见图 1图 6。土样采集时间为 2011 年 12 月 3 日，采集地温度为 68，湿度为 70%。 采集人：由陈连水老师与东华理工大学生物系同学，每批材料都在实验室-60 超低温冰柜保藏。取样地环境如下图所示： 图 1 莱溪 2 号土壤 图 2 军峰 3 号土壤 图 3 市山 5 号土壤 图 4 旴江 8 号土壤 东华理工大学 2013 届本科生毕业设计（论文） 材料与方法 - -14- 图 5 军峰 1 号土壤 图 6 县城 7 号土壤 表 1 实验材料来源情况表 区域 地势 温湿度 采集时间 莱溪 2 号土壤 平坦 68 70% 2011 年 12 月 3 日 军峰 3 号土壤 平坦 68 70% 2011 年 12 月 3 日 市山 5 号土壤 平坦 68 70% 2011 年 12 月 3 日 旴江 8 号土壤 平坦 68 70% 2011 年 12 月 3 日 军峰 1 号土壤 平坦 68 70% 2011 年 12 月 3 日 县城 7 号土壤 平坦 68 70% 2011 年 12 月 3 日 2.实验仪器 DHG-9003BS-型 电热恒温鼓风干燥箱，1 台，上海新苗医疗器械制造有限公 司； DNP-9002BC-型 电热恒温培养箱，1 台，上海新苗医疗器械制造有限公司； BD-156CT 型 超低温冰柜，1 台， 海尔公司； CJ-2FD 型 超净工作台，1 台，苏州百神科技有限公司； B203LED 生物显微镜，1 台，重庆奥特光学仪器有限公司； YX280A 手提式不锈钢蒸气消毒器，1 台，上海三医疗器械有限公司； BCD-193A 冰箱，1 台，RONGSHENG； BS223S 电子天平， 1 台，北京赛多利斯仪器系统有限公司； 微波炉，1 台，格兰氏 锥形瓶， 四川蜀玻集团崇州市蜀玻化工有限公司； 试管、无菌培养皿、无菌玻璃棒、烧杯、接种环、无菌水、移液管、棉花、报 纸、吸水纸、擦镜纸、量筒、试管架、刷子、载玻片、显微镜、滴管、锥形瓶、移 液枪、接种针、涂棒。 东华理工大学 2013 届本科生毕业设计（论文） 材料与方法 - -15- 3.实验试剂 （1）改良的 Ashby 培养基 甘露醇 100g，CaCO 3 5g，MgSO 47H2O 0.2g，CaSO 42H2O 0.1g，KH 2PO4 0.2g， Ca SO42H2O 0.1g， NaCl 0.2g，琼脂 20g，蒸馏水 1000ml。 （2）革兰氏染色剂 95%乙醇溶液、0.85 生理盐水、番红溶液、碘液、结晶紫染液、无菌水 1500ml。 （二）实验方法与步骤 1.土壤固氮菌培养基的配制 制备培养基的基本过程如下： （1）称量 按照上面改良的 Ashby 培养基的配方，正确称取各种原料放