《酶工程》 课后习题答案

第一章 酶工程基础 工程、 比活力、酶活力、酶活国际单位、酶反应动力学 酶工程 ：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是 工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或服务于其它目的地一门应用技术。 比活力 ：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或 酶活力 ： 也称为 酶活性 ，是指 酶催化 某一 化学反应的能力。 其 大小可用在一定条件下，酶催化 某一化学反应的速度来表示，酶催化 反应速度 愈大，酶活力愈高 。 酶活国际单位 : 1961 年国际 酶学 会议规定：在特定条件 (25 ，其它为最适条件 )下，每分钟 内能转化 1 物或 催化 1 物形成所需要的酶量 为 1 个酶活力单位，即 为国际单位 （ 。 酶反应动力学 :指 主要研究 酶 反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。 酶的研究简史如下： (1)不清楚的应用 ：酿酒、造酱、制饴、治病等。 (2)酶学的产生 ： 1777年，意大利物理学家 山鹰实验； 1822年，美国外科医生 究食物在胃里的消化； 19世纪 30 年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。 1684 年，比利时医生 出 引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）；1833 年，法国化学家 到淀粉酶； 1878年，德国科学家 出 从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。 (3)酶学的迅速发展 （理论研究）： 1926年 ,美国康乃尔大学的 ” 独臂学者 ” 萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质 ;1930 年，美国的生物化学家 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。 ： 1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化： 1908年，德国的 革软化及洗涤； 1911年， 于啤酒的澄清； 1949 年，用微生物液体深层培养法进行 淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕； 1960 年，法国科学家 出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量； 1971年各国科学家开始使用“酶工程”这一名词。 人们注 意到酶的一些不足之处，如：稳定性差，对强酸碱敏感，只能使用一次，分离纯化困难等，解决的方法之一是固定化。 固定化技术的发展经历如下历程： 1916年， 现蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性； 1969年，日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从 氨基酸； 1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会议的主题是固定化酶。 4. 酶的催化特点 酶催化作用特性有： 极 高的催化效率 ：在 37或更低的温度下，酶的催化速度是没有催化剂的化学反应速率的 1012 高度的专一性 ：一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物； 活性的不稳定性 ：酶的催化反应需要温和的条件，强酸、强碱、高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性，所以酶作用一般都要求比较温和的条件，如常温、常压、接近中性的酸碱度等； 活性的可调节性 ：酶的催化活性是受调节和控制的 酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包括三方面的调节， 影响酶催化作用的 因素有内因和外因，内因有：酶浓度、底物浓度和产物浓度； 外因有：温度、 活剂和抑制剂。 底物浓度 ：当底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急剧加快，两者呈正比关系，表现为一级反应；随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降；如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应，此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加。 产物浓度 ：生物代谢过程中产生的中间产物或终产物是酶的变构剂，使酶变构而影响酶的反应速度，即反馈调节作用。 酶浓度： 在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。 温度： 在一定温度范围内，反应速度随温度升高而加快，一般温度每升高 10， 反应速率大约增加一倍；超过一定范围，较高温度会引起酶三维结构变化，甚至变性，导致催化活性下降，反应速度反而随温度上升而减缓。 分子处于最适 ，催化反应速度达最大值；当反应介质 离酶最适 影响酶与底物结合，进而影响反应速度，故必须控制好 激活剂 ：凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂，大部分是离子或简单的有机化合物。 抑制剂： 凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂，通常抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。 6 说说米氏方程的意义 Vv 这个方程即为米氏方程，是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的。 其中： 酶促反应速度为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度； S为底物浓度。 米氏方程表示一个 酶促反应 的起始速度（ v）与底物浓度（ S）关系的速度方程。 其意义为： 方程反映了反应性质、反应条件、反应速度之间的关系； 反映了反映速度与底物浓度之间的关系，当 S远大于 反应速度与底物浓度无关 ; 反映了酶反应速度与酶浓度的关系 ,当 S远大于 v=0为线性关系，酶活正比于酶浓度。 第二章 酶的发酵工程 1. 名词解释： 诱导物、（诱导作用）、终产物阻遏、分解代谢产物阻遏、 葡萄糖效应 诱导物： 诱导酶起始合成的物质（通常是酶的底物），可以引起阻遏蛋白的构象变化，使之不利于与操纵基因结合，如乳糖；而能引起阻遏蛋白的构象变化从而有利于其与操纵基因结合，阻遏酶产生的物质称为辅助阻遏，如氨基酸和核苷酸等。 终产物阻遏 ：催化某一特异产物合成的酶，在培养基中有该产物存在的情况下常常是不合成的，即受阻遏的。 分解代谢产物阻遏： 大肠杆菌在含有能分解的两种底物（如葡萄糖和乳糖）的培养基中生长时，首先分解利用其中的一种底物（葡萄糖），而不分解另一种底物 (乳糖 )，这是因为葡萄糖的分解代谢产物阻遏了分解利用乳糖的有关酶合 成的结果，此作用即为分解代谢产物阻遏。 葡萄糖效应 ：由于葡萄糖常对分解利用其他底物的有关酶的合成有阻遏作用，故分解代谢产物阻遏又称为葡萄糖效应。 2. 举例说明酶生物合成调节机制在酶发酵过程优化中的指导意义 乳糖是大肠杆菌合成 只采用乳糖作为碳源，虽然提高了发酵单位却增加了成本。若采用葡萄糖和乳糖以适当比例组成的混合碳源，则在提高产量的同时又能降低发酵原料成本。在利用嗜热脂肪芽孢杆菌生产 用甘油替代果糖解除分解代谢阻遏，可以使产量提高约 25倍。在利用枯草芽孢杆菌活菌生产蛋白酶 时，若培养基中含有氨基酸，酶产量很低：如果除去培养基中的氨基酸，蛋白酶产量会大幅度提高。再如，枯草芽孢杆菌的鸟苷发酵是典型的代谢控制发酵，采用腺嘌呤营养缺陷型突变株。发酵过程中人为限制腺嘌呤的浓度，使细胞代谢途径中的腺嘌呤类核苷酸浓度保持在不致引起关键酶的反馈抑制和阻遏的水平，有利于鸟苷的积累。 3. 举例说明酶生物合成调节机制在产酶生物菌种改造中的指导意义 若通过基因工程手段和传统诱变的技术获得在抗代谢物存在时也能正常生长的突变株，有的突变株的相关酶系合成对这种抗代谢物不敏感，这也就解除了某些代谢物对有关酶系的 反馈阻遏。例如，异亮氨酸合成途径中的关键酶 高丝氨酸脱氢酶受蛋氨酸的反馈阻遏，通过选育蛋氨酸结构类似物抗性突变株或者蛋氨酸缺陷型菌株，可提高该酶量，从而提高异亮氨酸产量。此外，在育种工作中，还可以筛选组成型菌株以提高酶的产量。以 诱导型菌株培养在含有抑制物质邻硝基 D 岩藻糖苷和乳糖的培养基中时，由于诱导酶的合成被抑制，野生型因不能利用乳糖而不能生长，但组成型酶突变株对于乳糖的利用则不受限制，因而此环境中生长的突变株为组成型酶产生菌。 4. 在酶的发酵过程中，提高酶产量的措施有哪些 添加诱导物 ：对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。诱导物一般分为三类：酶的作用底物，如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物；酶的反应产物，如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生；酶的底物类似物，如异丙基 降低阻遏物浓度 ：微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法培养液中的碳源保持在不至于引起分解代谢物阻遏的浓度。 添加表面活性剂 ：在发酵生产中，非离子型的表面活性剂常被用作产酶促进剂，但它的作用机制尚未完全研究清楚。 添加产酶促进剂 ：产酶促进剂是指那些非微生物生长所必须，能提高酶产量但作用机制尚未阐明的物质，它可能是酶的激活剂或稳定剂 . 对于生产酶的菌种来说一般必须符合以下条件： 酶的产量高； 容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性较强，便于管理； 菌株遗传性要稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，保证生产的稳定性； 菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低； 发酵产物利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶； 菌株安全可靠，不是病原菌，不产毒素及其他有害物质，不影响生产人员的身体健康； 基因工程菌株必须符合安全性要求。 何进行筛选 1 材料和方法 验材料 发菌株： 黑曲霉 离及斜面培养基 ：斜面培养基为 分离培养基是在察氏培养基中加入 1%的酪蛋白。 （ 1） （ 2）查氏培养基 ： 硝酸钠 3g、 磷酸氢二钾 1g、硫酸镁 (H 2O) 化钾 酸亚铁 蔗糖 30g、琼脂 20g、蒸馏水 1L，加热溶解，自然 装后 121 灭菌20 培 养方法：按要求配制发酵基质，调节初始含水量和 150 L 三角瓶中，在 0 却接种，接种量为 于不同条件下发酵 84h，干燥后，进行酶活的测定。 2 实验方法 种的分离和纯化： 采用常规稀释分离法。 株的诱变处理 取 0.1 30 培养 4 h,紫外灯预热 30平皿置于距15W 紫外灯 30 距分别照射 0 s （对照用）、 4 6 81012做 2组）。随后在暗光条件下，用 5当稀释后，涂布于分离平皿，以黑布包裹 30 下避光培养 3长出菌落与其水解圈直径比的大小及菌落形态的变化，挑选所需菌种，编号并保存，同时根据平皿菌落数计算致死率 ,从而求得成活率。 致死率（ %） =（ 100 式中： A 为对照组平皿上的菌落数； B 为诱变处理后平皿上的菌落数。 活测定方法 酶活定义： 10 ， 1分钟水解酪素产生 1g 酪氨酸为一个酶活力单位（ U/g）。 3 结果与分析 株选育结果 为了筛选在固体培养条件下产酶高的菌株 , 经紫外线诱变处理后 , 得到 100余株突变株。这些菌株在形态上有一定的差异，依照其菌落的形态、菌落大小、孢子颜色和孢子丰满程度以及水解圈的大小，从中挑选出 20株先经三角瓶液体发酵产酶测定 ,获得 10个高产菌株再经三角瓶固体发酵培养复选 。 其中 284U/g（干基），比出发菌株(高了 外线诱变的机理是能作用于嘧啶，形成嘧啶二聚体（主要是 影响 常解链与碱基配对，从而引起基因突变，提高酶产量。 谈该如何提高酶的合成量 （ 1）遗传控制 诱变育种 a. 使诱导型变为组成型：选育组成型突变株 b. 使阻遏型变为去阻遏型 c. 解除反馈阻遏：选育营养缺陷型突变株、选育结构类似物抗性突变株 d. 解除分解代谢物阻遏：选育抗分解代谢阻遏突变株 基因工程育种：改变细胞调节基因，使菌种由诱导型变为组成型；增加结构基因的拷贝数，增加细胞专一性酶的生产。 （ 2）条件控制 添加诱导物酶的作用底物、作用底物的前体、反应产物、酶的底物类似物或底物修饰物 降低阻遏物浓度 : 产物阻遏：除去终产物；添加阻止产物形成的抑制剂 分解代谢物阻遏：避免使用葡萄糖、避免培养基过于丰富、添加一定量的 添加表面活性剂 : 离子型 ( 80),对细胞有毒害作用 ; 非离子型 ( 100),增加细胞通透性 . 添加产酶促进剂：酶促进剂对不同细胞、不同酶的效果各不相同，需通过试验选用适当的产酶促进剂并确定最适浓度 ,其作用机制并未阐明清楚。如添加植酸钙镁可使桔青霉素生产磷酸二酯酶的量提高 10 20倍。 第三章 酶的分离工程 2 原理是什么 ? 细胞破碎按照处理方法一般分为机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶促破碎法等。 机械破碎法：通过机械运动产生压缩力和剪切力，将组织细胞打碎，具有处理量大、破碎效率高、速度快等优点。细胞的机械破碎主要有捣碎法、研磨法和匀浆法等。 物理破碎法：利用温度、压力、声波等物理因素，使细胞破碎的方法，多用于微生物细胞的破碎。常用的破碎方法有温度差法、压差法和超声波法等。 化学破碎法：利用各种化学试剂作用于细胞膜，从而使细胞破碎的方法。常用的化学试剂有甲苯、丙醇、丁醇、氯仿等有机溶剂，曲拉通和吐温等表面活性剂。 酶促破碎法：根据细胞壁结构特点，选用适当的酶、破坏细胞壁，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂的方法称为酶促破碎法。其中在一定条件下，利用细胞自身酶系的催化作用使细胞破碎的方法称为自溶法，自溶法的作用效果受温度、 子强度等因素的制约。必要时需加入适量的甲苯、氯仿等防腐剂，以防止其他微生物在自溶体系中的生长。 3. 酶的提取方法有哪些 ?影响酶提取的主要因素有哪些 ? 根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。 盐溶液提取法：蛋白质在低浓度盐溶液 中，其溶解度会随着盐溶液浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶这是因为蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高。 酸溶液提取法：有些酶在酸性溶液中的溶解度比较大，且比较稳定，这类酶宜采用酸溶液提取， 6，针对酶的性质选择合适的 免 碱溶液提取法：有些酶在碱性溶液中的溶解度比较大，且比较稳定，这类酶宜采用碱溶液提取， 12，针对酶的性质选择合适的 免 有机溶 剂提取法：一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶蛋白难溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，则常用能够与水混溶的有机溶剂提取，如乙醇、丙酮、丁醇等。 酶主要是蛋白质，影响蛋白质提纯的因素同样会影响酶的提纯，而在酶提取过程中最重要的就是要防止酶的变性失活。影响酶提取的最主要因素是酶在所用溶剂中的溶解度及酶向溶剂中扩散的难易。此外，在提取过程中还要注意一下因素的影响： 1) 温度：为防止酶的变性失活，提取时温度不宜过高。特别是采用有机溶剂提取时，整个提取操作应尽可能在低温下进行。 2) 提取液的 先应保证蛋白质 稳定，为了增加酶的溶解度，提取时溶液的 远离酶的等电点。 3) 搅拌：搅拌能促进酶在提取液中的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快易产生大量气泡，增大了与空气的接触面，会引起酶蛋白的变性失活。 4) 污染：酶液是微生物生长的良好培养基，在提纯过程中应尽可能防止微生物对酶的破坏。 5) 提取液的体积：提取液的用量增加可提高提取率。但过量的提取液，使酶浓度降低，对进一步分离纯化不利。所以提取液的用量一般为含酶原料体积的 3 5 倍，少量多次，以得到较好的提取效果。 4. 差速离心和密度梯度离心分离酶的原理及各自特点是什么 ? 差速离心 原理 ： 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法称为差速离心。操作时，采用均匀的悬浮液进行离心，选择好离心力和离心时间，使大颗粒先沉降，取出上清液，在加大离心力的条件下再进行离心，分离较小的颗粒。如此多次离心，使不同大小的颗粒分批分离。 特点 ： 差速离心所得到的沉降物含有较多杂质，需经过重新悬浮和再离心若干次，才能获得较纯的分离产物。差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。操作简单方便，但分离效果较差。 密度梯度离心原理 ： 密度梯度离心又称速度区带离心。密度梯度离心是指样品在密度梯度介质中进行的一种沉降速度离心。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的梯度介质制成的。梯度介质应有足够大的溶解度，以形成所需的密度，不与分离组分反应，不会引起分离组分的凝聚、变性或失活，常用的有蔗糖、甘油等。等密度梯度离心又称平衡密度梯度离心。等密度梯度离心虽然也是在密度梯度介质中进行的离心，但被分离的物质是依靠他们的密度不同进行分离的。此种离心常用无机盐类制作密度梯度。 特点 ： 离心后，不同大小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干 条界面清晰的不连续区带如 左 图。各区带内的颗粒较均一，分离效果较好。在密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的不同而改变。随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当增大离心力而缩短离心时间，可减少区带扩宽。 5. 双水相萃取和反胶束萃取的原理 ?各自如何在酶的分离纯化中应有 ? 双水相萃取原理 ：是依据样品中目标组分在两相间的分配系数不同来进行选择性分离，当样品加入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种作用力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境条件的影响，各组分在两相中的浓度不同。由 于分配系数等于系统平衡时两相中目标组分的浓度比，因此，在双水相萃取体系中可以利用各组分 应用： 双水相萃取已经用于多种生物酶的分离，如利用 酸盐双水相体系提取发酵液中的碱性木聚糖酶，利用 丙基淀粉体系从黄豆中分离磷酸甘油酸和磷酸甘油醛脱氢酶，利用 3用 外， 固醇氧化酶、脂肪酶、纤维素酶、 反胶束萃取的原理： 当蛋白质样品与反胶束溶液表面和蛋白质表面的相互作用，在两相界面形成了包含蛋白质的反胶束团，此时蛋白质以最大限度扩散进入反胶束中，从而实现蛋白质的正萃取。然后，含有蛋白质的反胶束与另一水相接触，通过改变水相条件（如 子强度等 ），可以调节蛋白质反萃取回水相，从而实现正萃取或反萃取过程，回收目的蛋白质。 应用： 反胶束萃取已经用于多种酶蛋白的分离，如利用十六烷甲基三甲基溴化铵（ 异辛烷 /正辛醇反胶束溶液萃取纤维素酶，利用二烷基磷酸盐 /异辛烷反胶束溶液萃取溶菌酶，利用琥珀酸二酯磺酸钠 /异辛烷反胶束溶液提取发酵液中的碱性蛋白酶和 外，胰蛋白酶、碱性蛋白酶、异柠檬酸脱氢酶、 肪酶等也可以利用反胶束萃取进行分离。 6. 如何理解灌注色谱是生物大分子分离纯化技术的一个重大突破 ?以酶为例加以说明。 灌注色谱的建立是近年色谱技术发展的一个重大突破，它打破了传统的流速与分辨率、容量间的三角关系，即在流速增加的情况下，柱容量和分辨率不会降低，柱压力也不会升高，使得生物大分子的快速分离纯化成为可能。 灌注色谱法利用流动相和溶质的对流作用，降低了溶质 在介质内滞留的限制，明显地缩短了蛋白质的分离时间。因此，它能以比 0 100 倍的速度在较短的循环时间内进行生物大分子的分离。同时，该方法得到的蛋白质质量、产量和产率都有所提高，具有高流速下谱带不会因传质而展宽的特点，分离度基本不受影响，室温下操作，生物活性物质活性损失少，回收率高，可同时进行分析和制备等特点。 灌注层析技术代表了一种解决液相色谱传质问题的先进技术，已经开始用于酶等蛋白质、多肽、核酸、激素等生物大分子的分析和制备，如超氧化物歧化酶、核糖核酸酶、溶菌酶等。 7. 酶结晶的原理是什么 ?影响酶结晶的主要因素 ? 酶结晶的原理：通过 缓慢地改变母液中酶蛋白溶解度，使酶略处于过饱和状态，再配合适当结晶条件，从而得到酶的晶体。 影响酶蛋白结晶的因素众多，具体可分为物理因素、化学因素、和生物化学因素。 物理因素：达到平衡的方法、温度、重力、压力、介质的电解质性质和黏度、均相或非均相成核等。 化学因素： 淀剂类型和浓度、离子种类和强度、过饱和度、氧化 /还原环境、酶浓度、交联体、去垢剂和杂质的存在等。 生物化学因素：酶纯度、抑制剂、酶蛋白的聚集状态、酶水解、化学和遗传修饰、蛋白质自身的对称性、稳定性和等电点等。 第四章 固定化酶与固定化细胞 定化酶和固定化细胞作为催化剂的优缺点。 （ 1）酶作为生物催化剂的优缺点 优点 ：专一性强；催化效率高；催化反应的条件温和；活性可以调节。 缺点 ：稳定性差；分离纯化困难，因此一般成本都比较高；使用后回收困难，不能重复使用，同时也为产物的纯化带来困难。 （ 2） 固定化酶的优 缺 点 优点 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化。 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。 较能适应于多酶反应。 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。 缺点 酶固定化过程中发生的物理化学变化会使酶的活性中心受损，可能导致酶活性降低。 酶连接于固相载体后，酶蛋白的构象和活性中心都可能发生改变，而且载体骨架和侧链可能造成空间位阻，从而影响底物与酶分子接近，进而降 低酶分子的实际催化活力。 只适用于催化可溶性和较小分子的底物，对大分子底物不适宜。 与完整细胞相比，其不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。 （ 3）固定化细胞的优缺点 固定化细胞的优势 固定化细胞与固定化酶比较，其优越性在于： 固定化细胞保留了胞内原有的多酶系统。使得它既可以作为单一的酶发挥作用，又可利用它所包含的复合酶系完成一部分代谢乃至整个发酵过程，特别是那些需要辅助因子参与的合成代谢过程，如乙醇发酵、合成干扰素等。 固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更稳定。由于固定化细胞兼具游离细胞完整的酶系统和酶的固定化技术二者的优点，因而它可以省去酶的分离纯化工作，大大降低成本，并减少酶的活性损失，这一点对于细胞内酶与不稳定的酶来说特别有意义，加上固定化细胞的制备与使用都比固定化酶更简便，所以固定化细胞在工业生产和科学研究中都得到了广泛的应用。 固定化生长细胞与游离细胞相比，其优越性表现为： 固定化生长细胞可以增殖，提高细胞的密度，因此可以获得高度密集而体积缩小的基因工程菌集会体，不需要经历普通发酵的多次培养、 放大，从而可以缩短发酵周期，提高生产能力。 可以提高基因工程菌的遗传稳定性，发酵性能较稳定，可以较长时间反复使用或连续使用，有利于生产自动化。 用固定化细胞发酵时，发酵液中基本不含（或含有很少）菌体，有利于产品的分离纯化和提高产品质量。由于固定化细胞既利用了固定化酶所具有的一些优点，如产物易分离、生产易连续化和自动化，又利用了细胞所具有的完整酶系统和细胞膜的选择通透性，同时固定化细胞的制备又比固定化酶容易，因此目前认为固定化细胞的应用前景可能会更好一些。 固定化细胞的局限性 这种技术仅能用于产生胞内 酶的菌体。 细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物。因此有时需要采取加热、加酸、加碱或表面活性剂等预处理措施。例如，用固定化产氨短杆菌把延胡索酸转化为苹果酸，为了阻止琥珀酸的同时生成，可先用胆酸盐进行抽提处理；解决副反应问题的另一办法则是采用不同菌株。 固定化细胞不仅有固定化带来的扩散限制，比如载体形成的孔隙大小会影响高分子底物的通透性等，而且还增添了细胞膜、细 胞壁的扩散限制作用。 由于微生物本身的复杂性，形成的固定化细胞一般在稳定性和酶活力水平上都比较低。 使用初期往往会有一些细胞组分渗出，影 响产品质量。 如果底物（或产物）为高分子物质或不溶性物质，使用时就十分麻烦。 定化的基本原理以及各自的优缺点。 （ 1） 载体结合法 就是把酶结合到一种水不溶的固体载体上，根据结合的方式不同又可分为下列几种方法。 1 物理吸附法 无机载体，如高岭土、硅胶、氧化铝、活性炭、羟基磷灰石等。 有机载体，如纤维素、合成树脂、骨胶原、淀粉等。吸附容量比无机载体高。 2 离子结合法 离子结合法是指在适宜的 通过离子键结合到具有离子交换基的水不溶性载体中的固定化方法，因而也称离子交换吸附法。 物理吸附法的优点是：利用此法进行固定化，酶的活性中心不易被破坏，且酶的高级结构变化少，因而酶活力损失很少。但是物理吸附法固定的酶与载体相互作用力弱、酶容易从载体上脱落下来。与物理吸附法相似，离子结合法的优点是：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率高的固定化酶。缺点是：载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或 离子强 度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。但是与物理吸附剂相比，离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂，约 50 150 3 共价结合法 共价结合法是指借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联的固定化方法。 （ 2） 无固体载体交联法 交联法是指利用双功能或多功能试剂（ 酶分子间、酶分子与惰性蛋白间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法。它与共价结合法的不同之处是 它不使用载体。 交联法的优点是操作简便。其缺陷则是交联反应的过程往往比较激烈，因为交联反应可能发生在酶分子间，也可能发生于分子内，分子间交联和分子内交联的比例在一定程度上和酶的浓度与交联试剂的浓度有关，也与 子强度有关，如果交联条件控制不合适，许多酶易在固定化过程中失效，酶回收率不高。 （ 3） 包埋法 包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合促进剂（包括交联剂）的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。 包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。 1 凝胶包埋 凝胶包埋法是将酶分子包埋在多孔凝胶中。 2 微囊化 微囊型包埋是指将一定量的酶溶液包在半透性的高分子微孔膜内。 与凝胶包埋法相比，微囊法包埋的优点是：固定化酶颗粒比前者要小得多，比较有利于底物和产物扩散，能容许小分子底物和产物自由出入膜内外，由于囊的表面积与相对体积的比值大，故物质交换可以进行得十分迅速。另一方面半透膜还能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注人体内时既可避免引起免疫过敏反应，同时也可免遭蛋白水解酶的降解，因此其具有较大的医学价值。缺点是反应条件要求高，制备成本也较高。 （ 4）不同固定化方法的联用 不同的固定化方法有各自的优缺点，在实际的固定化操作中，经常把各种固定化方法联用，以获得最佳效果。通常的联用有吸附加 交联和包埋加交联。 由于选用的固定化方法不同，固定化酶的活力和性质也有所不同，因此需要对不同的固定化方法进行评价。评价的指标主要有： （ 1）固定化酶的比活 每克（毫克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（ 酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。 （ 2）操作半衰期 是衡量稳定性的指标。指在连续使用的条件下，固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（ ）。固定化酶的操作半衰期是影响其实际应用的重要因素。 (3)偶联效率 （ 加入的蛋白量溶液中残留的蛋白量 ） /加入的总蛋白量 100 (4)活力回收 (固定化酶活力 /投入的总酶活力 ) 100 (5)相对酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值。 (6)酶载量 单位载体所固定的酶活力（或酶蛋白量）。 固定化酶的性质） 。 （ 1）稳定性 大多数酶固定化后，稳定性都增强，操作寿命和保存寿命也 延长。 （ 2）固定化酶的最适温度和最适 固定化后，大多数酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高。酶固定化后，对底物作用的最适 负电荷的载体固定化的酶的最适 正电荷的载体固定化的酶的最适 （ 3）固定化酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数 （ 4）固定化酶的专一性 酶固定化后，一般不会改变其专一性。但也有少数情况酶固定化后专一性会发生改变。 固定化细胞的优势 和局限性 （第 1题第（ 3）项） 第五章 化学酶工程 酶的化学修饰主要是对一些活泼性比较强的氨基酸侧链基团进行修饰。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团在酶蛋白分子中可以形成各种次级键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。这些侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象及微环境的改变，从而改变酶的特性和功能。对这些基团进行修饰后，对酶的性质影响大，修饰效果明显。 首先要强调的是，我们对酶进行修饰的目的就是要改变酶的结构和特性，而且要使这种改变朝着对人类有用的方向进行。不管 是从理论上分析还是从实际修饰的结果来看，酶经修饰之后，性质朝任何方向改变的可能性都存在，而且多数改变都是不利的。酶修饰之后，性质的变化因酶、修饰剂和修饰方法的不同而出现很大的差异。 （ 1） 热稳定性 用前面介绍的一些修饰剂对酶进行修饰，在多数情况下可以提高酶的稳定性。但 有明显的提高。 （ 2） 抗原性 抗原性是药物用酶必须解决的问题。在前面介绍过的修饰剂中，被认为可以消除酶的抗原性的修饰剂只有 （ 3） 对各类失活因子的抵抗力 由于酶修饰之后，表面会带上修饰剂而受到保护，因此，酶修饰之后，抵抗蛋白酶水解和其它失活因子的能力普遍增强。 （ 4） 在生物体内的半衰期 由于修饰之后，稳定性和对抗各种失活因子的能力增强，因此，半衰期也普遍延长。 羧基可用碳二亚胺、硼氟化三甲烊盐和甲醇修饰 氨基可用酸酐、卤代乙酸、芳基卤和芳香族磺酸等修饰 巯基包括形成二硫键、有机汞、取代、氧化等几种方式。 咪唑基 （酚）羟基 胍基 色氨酸吲哚基 模型与大 型环冠醚模拟酶模型有何区别？ 氨基转移酶 生物体内蛋白质的合成是一个非常复杂过程。氨基酸在掺入肽链之前必需进行活化以获得额外能量，这活化过程即酰基转移反应，又称氨酰基化反应。 重排反应 排是有机化合物异构化的一种重要形式，生物体由一些化合物在光照下会发生排。 氧化还原反应 氧化还原反应在生物体内十分广泛，主要是呼吸链的一系列反应。 金属螯合反应 金属螯合反应对于辅酶、辅因子和酶的结合来说意义重大。 磷酸酯水解反应 磷酸二酯键是自然界最稳定的键之一，因此，它的水解对抗体酶来说是个挑战。 其它反应 抗体酶还可催化磺酸酯水解反应和光诱导反应等反应类型，随着抗体酶的研究与开发的深入，抗体酶催化的反应类型也将越来越多，并为人们所用。 能催化一些天然酶不能催化的反应 抗体酶的多样性决定了抗体酶的催化反应类型多样性；催化抗体的构建，表明可通过免疫学技术，为人工酶的设计和制备开辟一条新的、实用化的途径。这种利用抗原 催化活性引入免疫球蛋白结合位点的技术，或许可能发展成为构建某种具有定向特异性和催化活性的生物催化剂的一般方法。 有更强的专一性和稳定性 抗体酶作为一种具酶和抗体双重功能的新型大分子用作分子识别元件，具有优于酶和抗体的突出特点。因为配体底物与抗体酶的活性部位结合后，会立即发生催化反应，释放产物，所以每一次分子反应之后，抗体的分子识别位点都可以 再生，这就使催化抗体能够作为一种可以连续反复使用的可逆性分子。 催化作用机制不同 酶催化机制是“锁钥学说”（ “诱导契合学说”（ 而抗体酶的催化剂至目前还没有完全搞清楚。 提出“识别开关”或“诱饵开关”（ 制，即抗体将底物“钓进”抗体结合部位，然后使其与抗体结合，打开底物转化为反应过渡态的“开关”，导致共价键断裂，形成产物，还有待研究。 所谓分子印迹（ 制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。这个化合物叫印迹分子（ P）或叫模板分子（ T）。印迹技术包括下列内容： 选定印迹分子和功能单体，使两者发生互补反应。 与印迹分子发生互补作用的单体与其它单体共同发生聚合反应。 将印迹分子从聚合物中去除。这样形成的聚合物内就保留有和印迹分子的形状、大小完全一样的空穴，印迹的聚合物能维持相对于印迹分子的互补性，因此，该聚合物能以高选择性重新结合印迹分子。 第六章 生物酶工程 基本步骤有哪些？ 指在体外将各种来源的目的酶基因与载体连接形成具有自我复制能力的 子，即重组载体，然后通过转化或转染将重组载体导入宿主细胞并培养，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取，从而获得大量所需酶基因。 步骤： 1）目的酶基因的获取 2）克隆载体的选择 3）目的基因与载体的连接 4）带有目的基因的重组载体转化宿主 5）正确重组子的筛选与鉴定 1）根据已知 序列来扩增目的基因 2）根据已知探针从基因文库中钓取目的基因 3）未知序列基因的打靶 在原核生物中表达具有其自身的特点：表达效率高，多数选用 大肠杆菌为表达宿主。 由于原核生物缺少翻译后的加工系统，所以在很多情况下，人 们不得不采用真核细胞表达系统，最常用的真核表达宿主是酵 母菌。有时由于被表达基因的特殊性，也可用植物细胞、动物 细胞和昆虫细胞作为真核表达系统。 目前酶的异源表达已经得到广泛应用，已经应用到工业、农业、 医药、环境和能源等各个领域。 1）易错 可以用 替代 使 2） 组） (重组可以在同一基因的不同突变体之间进行，也可以在不 同物种的同源基因间进行。因此， 源的同源基因断裂成不同大小的片段，然后对这些片段进 行重新组合。 3）随机引物体外重组 4）交错延伸法（ 1）提高酶分子的催化活力 提高酶分子的催化能力是对酶分子进行定向进化的最重要目标之一。目前已获成功的例子比较多。 2）提高酶的稳定性 酶作为生物催化剂，一个最典型的缺点是不稳定，因此，提高酶的稳定性是酶分子定向进化改造的另个重要目标。 3）提高底物专一性 通过定向进化改变酶的专一性的例子有：半乳糖苷酶。腺苷环化酶，经突变后使酶对鸟苷酸和腺苷酸的相对亲和力发生了明显的变化。 4）改善酶的其它性能 如提高酶在有机 相中催化活性和稳定性，提高酶的耐酸性和耐碱性，改变酶的最适 融合酶又叫杂合酶（ 杂合酶的概念比较模糊，一般认为，杂合酶是指由来自两种以上不同酶分子中的结构单元（单个功能基团、二级结构、结构域或功能域）或是整个酶分子进行组合或交换，而产生的具有明显优良特性的酶杂合体。 产生融合酶的方法有两种：一种是通过随机重组的方法，即把来自不同酶的基因片段进行随机组合，从这些随机组合中筛选出具有明显优良特性的酶杂合体。 另一种方法是在对要进行融合的酶的结构与催化功能有比较全面的了解的时候，对酶的融合提出合理的设计方案，进行有一定目标的融合。 （ 1） 二级结构融合 通过对酶的某些特定功能的二级结构（如底物识别位点螺旋结构）进行替换可以明显改变酶的某些特性。 （ 2） 功能域的融合 功能域融合成功的例子比较多。如将一个限制酶的催化中心与一个特异 合结构域融合在一起可构建具有新的特异性的限制性酶。 （ 3） 整个蛋白的融合 现在能够大量表达的各种带专一性标签的融合蛋白，如 合蛋白， 融合酶是人们改进现有酶的特性和创造新酶的最重要方法之一。杂合酶的构建和研究不仅对酶学理论的研究具重要意义，也有重要的实际应用价值。 （ 1） 基础理论研究方面的应用 确定酶的结构与功能之间的关系 研究蛋白质之间的相互作用 研究酶及其它蛋白在细胞或生物体内的定位 （ 2） 实际应用 酶的非催化特性的优化（如稳定性） 创造新催化活性的酶 构建具双功能或多功能的酶 在酶内部创建别构作用 第七章 核酶 为揭开生命起源的奥秘提供了有利的证据。具多种催化功能的核酶的发现及人工筛选的成功，支持了在蛋白质产生以前核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设想。 （以下答案来自网上：打破了酶是蛋白质的传统观念；在生命起源问题上，为先有核酸提供了依据；为治疗破坏有害基因，肿瘤等疾病提供手段。） 行的？ 见酶工程 陈守文 膜虫 26 内含子得到剪切和外显子得到连接。 *用底物是什么？ 根据催化反应的种类分 为 剪接型 核酶（包括 和 剪切型 核酶（包括自身剪切型 和 异体剪切型 ），作用底物为 们有着什么样的关系？ 属离子在 发挥的作用是什么？ 镁离子等二价金属离子是核酶催化核心的组分之一，核酶通过碱基配对与其底物接触并发生相互作用，二价阳离子的存在可与底物的活性部位直接作用，参与过渡态的中间复合物的形成，形成类似于酶的活性中心。 型内含子 和 结构特点。 40 4200个核苷酸，一级结构的保守性较低 ，二级结构呈现出很高的保守性，含有 9个配对螺旋结构的结构特征。 级结构基本相似。 六个螺旋组成，构成六个结构域，这六个结构域可形成发夹环。 肝炎 病毒（ 酶（又称斧头状核酶） 大小为 一种缺陷型单链环状 状折叠的立体构型，对其催化活性必不可