探讨PCR―RFLP检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与子痫前期发病机制的关系

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 探讨 PCRRFLP 检测亚甲基四氢叶 酸还原酶基因多态性与子痫前期发 病机制的关系 摘要目的 探讨限制性片段长度 多态性聚合酶链反应（cleaved amplification polymorphism sequence- tagged sites，PCR-RFLP）检测亚甲基 四氢叶酸还原酶基因多态性与子痫前期 发病机制的关系，为子痫前期的防治提 供依据。方法 选取 2016 年 5 月2017 年 6 月我院收治的子痫前期患者 100 例 （病例组） 、健康孕妇 500 例（对照组） 作为研究对象，进行亚甲基四氢叶酸还 原酶基因多态性分析、基因多态性检测， 并进行血液生化指标分析，调查基本资 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 料，进行因素分析。结果 病例组患者 所有测序都获得成功，对照组测序成功 498 例。两组患者的基因型频率、等位 基因频率比较，差异有统计学意义（P 中国论文网 /6/view-12939343.htm 关键词 子痫前期；GC 基因； 基因多态性；发病机制 中图分类号 R714.245 文献标 识码 A 文章编号 1674-4721（2017） 11（b）-0086-04 AbstractObjective To investigate the restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction （cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP） in testing the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism and the pathogenesis of pre eclampsia，provide the basis for the prevention and treatment of preeclampsia.Methods 100 preeclampsia （the case group） and 500 healthy -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 pregnant women （the control group） from May 2016 to June 2017 treated in our hospital were selected as subjects to conduct polymorphism analysis of methylenetetrahydrofolate reductase gene and detect of gene polymorphism.Blood biochemical indexes were analyzed，basic data was investigated and factors were analyzed.Results All cases were successfully sequenced in the case group， and 498 cases were successfully sequenced in the control group.The genotype frequency and allele frequency of the case group were compared，and the differences were statistically significant （P0.05） ，具有可比性。本研究经我院 医学伦理委员会审核及同意，患者均知 晓本研究情况并签署知情同意书。 1.2 方法 1.2.1 血样采集与其他指标分析 采血前夜 22：00 禁食，次日晨起 8：00 采血，采用真空采血法，采集肘部静脉 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 血 5 ml，平均分为 3 份。1 份不进行抗 凝，先进行血脂监检测，检测患者总胆 固醇（TC） 、三酰甘油（TG）等指标。 同时采用问卷调查方法，在产后调查孕 妇的孕期保健情况，包括增补叶酸情况、 维生素 D 补充情况、接触毒害物质情况 等。 1.2.2 基因多态性分析 提取 DNA：采用天根公司提供的 DNA，按 照说明书进行操作，监测 DNA 纯度， 取 1 l DNA 样本，采用紫外分光光度 计测定 DNA OD260 nm/280 nm 值，在 标准范围 1.72.0 内为合格的样本，可 进行 PCR 检查，否则需要重新提取。 PCR-RFLP 检测：通过 dbSNP 数据库 确定 MTHFR 多态位点相关信息，选择 内切酶在线分析软件，选择对应限制内 切酶，进行 PCR-RFLP 检测， MTHFR（rs4846049） ，引物序列 F：5- CCCCTTCAGTCACAAGTAGGTGG- 3，R： 5-CCTCC -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 AGAGCCAGCCTGAGAC-3，扩增片段 长度 177 bp。提取凝胶中的目的 DNA，进行 PCR 产物测序。PCR 扩增 条件：首先配置 Superminx，混匀到反 应管中，每管 24 l，加入 DNA 模版液 1 l。PCR 反应体系总量 50 l，内含 10PCR 缓冲液 2.5 l，10 mM dNTP 混 合液 0.5 l，50 mM MgCl2 0.8 l，PrimerF（5 uM）1 l，PrimerR（5 uM）=1 l， DNA 模板液 1 l，PlatinumR.Taq DNA 聚合酶 0.2 l， 灭菌蒸馏水补足至 25 l。PCR 反应条 件：94预变性 2 min，94变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 30 s，循环 30 次，72终末延伸 5 min，4保存。 PCR 产物鉴定以及测序，2%琼脂凝 胶鉴定，采用 DNA 测序仪进行测序。 1.3 观察指标 比较两组 GC 通路上不同位点的 多态性结果。分析多因素分析中有统计 学意义位点多态性是否起到独立作用， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 起到独立作用的位点多态性在纠正年龄 等因素后，是否与维生素 D 等指标存在 相关性6。 1.4 统计学方法 采用 SPSS 20.0 统计学软件进行 数据分析，计量资料用均数标准差 （xs）表示，两组间比较采用 t 检验； 计数资料采用率表示，组间比较采用 2 检验，多因素分析采用 Logistic 回归分 析，以 P50 kb，对照组测序成功 498 例。 两组的基因型频率、等位基因频率比较， 差异有统计学意义（P0.05） （表 1） 。 2.2 Logistic 回归多因素分析 2.2.1 两组单因素分析 两组的初中及以下文化水平、有 计划妊娠、有计划控制饮食与补充营养、 增补叶酸、补充过维生素 D、营养不良 等因素的例数比较，差异有统计学意义 （P0.05） （表 2） 。 2.2.2 两组患者各因素的比较 病例组 APPT 低于对照组、Hcy 高于对照组，差异有统计学意义 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 （P0.05） （表 3） 。 将以上因素作为自变量，是赋值 为 2，否赋值为 1，基因型频率赋值方 法 CC=1，CT=2，TT=3，APPT、叶酸 则采用原值赋值，以是否为子痫前期作 为因变量，是赋值为 2，否赋值为 1， 采用 Logistic 回归进行多因素分析。结 果提示，等位基因 TTOR=1.26，95%CI（1.541.46） ， P=0.014、增补叶酸 OR=0.67，95%CI（0.421.10），孕 期有计划的运动 OR=0.47，95%CI（0.481.37）成为 独立危险因素（P0.05） 。 2.3 TT 型与 Hcy、APPT 的相关性分析 经分析，TT 型与 Hcy、APPT 存 在显著相关性（P0.05） （表 4） 。 3 讨论 本研究结果提示，子痫前期是多 因素共同作用的结果，与基因多态性、 孕期保健情况等因素有关7。亚甲基四 氢叶酸还原酶基因多态性与子痫前期发 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 病存在显著相关性，且起到了独立的作 用，等位基因 TTOR=1.26，95%CI（1.541.46） ， P=0.014成为独立危险因素（P0.05） 。 TT 型与 Hcy、APPT 存在显著相关性 （P0.05） 。提示，亚甲基四氢叶酸还 原酶基因 TT 型可能对子痫前期起到促 进作用，且可能与其能够抬高 HCY、 诱导凝血功能紊乱有关8-10。有报道 显示，亚甲基四氢叶酸还原酶变异型会 导致相关通路的阻塞，使血液中的同型 半胱氨酸的浓度增加，从而引