红景天苷对胶质瘤u87―mg细胞增殖和侵袭能力的影响

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 红景天苷对胶质瘤 U87MG 细胞增 殖和侵袭能力的影响 摘要：目的 观察红景天苷对胶 质瘤 U87-MG 细胞增殖和侵袭能力的影 响，探讨其诱导 U87-MG 细胞凋亡机制。 方法 不同浓度红景天苷和喜树碱加入 U87-MG 细胞中，作用 24 h 后，MTT 法测定 U87-MG 细胞增殖，流式细胞术 检测 U87-MG 细胞凋亡率，Transwell 法检测 U87-MG 细胞侵袭能力，间接荧 光标记法测定细胞内活性氧（ROS）水 平，Western blot 检测 U87-MG 细胞 Caspase-3、Bcl-2、Bax、E- cadherin、N-cadherin 和基质金属蛋白酶 -9（MMP-9 ）的表达。结果 与空白对 照组比较，各给药组 U87-MG 细胞生长 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 抑制作用明显，10、50、100 ?g/mL 红 景天苷作用 U87-MG 细胞后，细胞侵袭 能力显著下降，10、50、100 ?g/mL 红 景天苷作用 U87-MG 细胞 48 h 后均能 诱导 U87-MG 细胞凋亡；ROS 水平与 红景天苷浓度呈正相关；10、50、100 ?g/mL 红景天苷上调 Caspase-3、Bax 和 E-cadherin 的表 _，下调 Bcl-2 和 N-cadherin 和 MMP-9 的表达。结论 红 景天苷可诱导 U87-MG 细胞凋亡、抑制 U87-MG 细胞的侵袭能力。 中国论文网 /6/view-12944145.htm 关键词：红景天苷；胶质瘤 U87-MG 细胞；细胞增殖；活性氧； Caspase-3；基质金属蛋白酶-9 DOI：10.3969/j.issn.1005- 5304.2017.06.016 中图分类号：R285.5 文献标识 码：A 文章编号：1005-5304（2017） 06-0064-04 Abstract： Objective To investigate the effects of salidroside on -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 proliferation and invasive ability of glioma U87-MG cells； To discuss the its mechanism to induce apoptosis of U87- MG cells. Methods U87-MG cells were cultured in vitro for 24 h under different concentrations of salidroside and camptothecin. The proliferation of U87- MG cells was detected by MTT assay. The apoptosis rate of U87-MG cells was detected by flow cytometry. Transwell assay was used to detect the invasive ability of U87-MG cells. ROS was detected by indirect fluorescent labeling. The expressions of Caspase-3， Bcl-2， Bax， E-cadherin， N-cadherin and matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） in U87-MG cells were detected by Western blot. Results Compared with the blank control group， U87-MG cells had significant inhibitory effect on the growth of U87-MG cells in each administration group， and the invasive ability of U87- -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 MG cells was significantly reduced after 10， 50， 100 g/mL salidroside was intervened， and 10， 50， 100 g/mL salidroside for 48 h for U87-MG cells could induce apoptosis of the cells； the level of ROS was positively correlated with the concentration of salidroside； 10， 50， 100 g/mL salidroside up- regulated the expressions of Caspase-3， Bax and E-cadherin， and down- regulated the expressions of Bcl-2， N- cadherin and MMP-9. Conclusion Salidroside can induce apoptosis of U87- MG cells and inhibit the invasive ability of U87-MG cells. Key words： salidroside； glioma U87-MG cells； proliferation； ROS； Caspase-3； MMP-9 脑胶质瘤在临床上多呈恶性，其 容易局部扩散，治疗比较困难且易复发， 大多数患者预后不良1。近年来，随着 医学的进步及学科间的不同领域交叉融 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 合，特别是转化医学理念的不断深入， 胶质瘤治疗手段取得极大的进步，逐渐 形成了一套比较完整的治疗体系2-3。 临床上普遍采用以手术切除为基础，结 合放疗、化疗、免疫、分子靶向等综合 治疗策略，这其中包括临床常用的化疗 药物替莫唑胺，但其存在一定的毒副作 用和耐药性，所以，在低毒性的前提下 提高化疗药物的药效显得尤为重要。 红景天苷（salidroside）提取自 红景天全草或根茎，是红景天的主要生 物活性成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、 抗病毒等多种生物活性4-6。但目前尚 未见文献对红景天苷的抗胶质瘤机制进 行探讨。因此，本实验以红景天苷为活 性物质，通过体外和细胞实验初步观察 红景天苷对胶质瘤系 U87-MG 细胞增殖 和侵袭能力的影响，并探讨红景天苷抗 血管生成信号通路的机制。 1 材料与方法 1.1 细胞系 正常脑细胞和脑胶质瘤细胞系 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 U87-MG，基尔顿生物科技（上海）有 限公司，本实验室进行培养。 1.2 药物及制备 红景天苷、喜树碱（20 mg，分 析标准品） ，阿拉丁试剂（上海）有限 公司，药物用 pH 6.8 PBS 配制浓度为 1000 ?g/mL 药液。 1.3 主要试剂与仪器 Caspase-GlooR3 试剂盒、非放射 性 NF-B EMSA 试剂盒，Sigma- aldrich（上海）贸易有限公司；MTT， 上海生工生物工程有限公司；小牛血清， 杭州四季青生物试剂公司；胰蛋白酶、 RPMI-1640 培养基，美国 GIBCO 公司； FITC/PI 双染试剂盒，碧云天生物试剂 公司。酸度计（上海雷磁仪器厂） ， CO2 培养箱（美国 REVCO 公司） ，流 式细胞仪（美国 BectonDikinson 公司） ， 酶联免疫检测仪（芬兰 Labsystems 公司） ，酶联检测仪（美国 Bio-Rad 公司） 。 1.4 U87-MG 细胞增殖检测 取 200 ?L/孔对数生长期 U87-MG -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 细胞（1105/孔）接种于 96 孔板中， 进行培养。培养 24 h 后，分别加入红景 天苷和喜树碱（10、50、100 ?g/mL） 培养基，设空白对照组，每个药物 3 个 平行孔。分别培养 24 h，每孔加 5 mg/mL MTT 试剂 20 ?L，继续培养 4 h。将培养基吸出，加 150 ?L DMSO 试 剂，充分振荡后，充分溶解结晶，于 570 nm 处测定各孔吸光度（OD） ，计算 细胞活力。细胞活力（%）=实验组 OD 值空白对照组 OD 值100%。 1.5 U87-MG 细胞侵袭能力测定 Transwell 小室滤膜内表面涂细胞 外基质胶，小室干燥后重新加入含有 0.1%胎牛血清的细胞培养基水化。 4.0105/mL 重悬浮细胞在 Transwell 小 室下室中加入新鲜 10%胎牛血清培养基， 上室中加入红景天苷和喜树碱 （10、50、100 ?g/mL）培养基，设定 空白对照组，每个药物设 3 个平行孔， 培养 24 h，每孔中加 100 ?L 细胞悬浮 液。常规细胞培养 24 h。取出小室后， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 PBS 溶液冲洗滤膜，PBS 棉棒吸除和擦 除上室的细胞，再根据 Transwell 小室 使用说明进行染色观察，计算穿膜细胞 数，从而反映各组细胞的侵袭能力。实 验重复 3 次。 1.6 U87-MG 细胞凋亡检测 将对数生长期 U87-MG 细胞以 1105/孔接种于 96 孔板中，置于恒温 恒湿培养箱培养。培养 24 h 后，分别加 入 0、10、50、100 g/mL 红景天苷培 养基，培养 48 h 后，收集细胞 PBS 重 新悬浮细胞，先加 5 ?L FITC-Annexin V 避光染色 5 min，再加 10 ?L PI 避光 染色 15 min，室温避光孵育 15 min。流 式细胞仪检测。 1.7 U87-MG 细胞活性氧检测 U87-MG 细胞接种后，恒温、恒 湿培养 24 h 后，分别加入红景天苷 （10、50、100 ?g/mL）的培B 基，设 3 个平行组。加入 400 ?L DCFH-DA 10 ?g/mL，充分混匀后，避光孵育 15 min。PBS 冲洗去除细胞外荧光剂。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 PBS 重悬细胞 10 min 后对荧光强度进 行检测。 1.8 U87-MG 细胞 Caspase- 3、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin 和基质金属蛋白酶-9 表达检测 收集对数生长期 U87-MG 细胞进 行相应的空白对照组和红景天苷组处理 24 h，进行各组细胞总蛋白的提取，通 过 Bradford 方法调整相同的蛋白浓度后 进行电泳，获得根据分子量分离的蛋白 条带，按照 Western blot 显像试剂盒指 导说明进行，蛋白 NC 膜电转，进行蛋 白封闭和一抗结合，一抗结合后洗脱， 再行二抗孵育标记兔抗大鼠的多克隆抗 体。ECL 试剂盒显色后，暗室发光拍照， 以 GAPDH 为内参进行分析。 1.9 统计学方法 采用 SPSS17.0 统计软件进行分 析。实验结果以xs 表示，多组间比 较采用方差分析和两样本 q 检验。 P0.05 表示差异有统计学意义。 2 结果 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 2.1 红景天苷对 U87-MG 细胞增 殖和侵袭能力的影响 与空白对照组比较，各给药组细 胞活力和侵袭能力下降 （P0.05，P0.01） ，且呈浓度依赖性。 结果见表 1、图 1。 2.2 红景天苷对 U87-MG 细胞凋 亡的影响 随红景天苷组浓度的增加 （10、50、100 ?g/mL） ， U87-MG 细胞 凋亡率不断增加，且呈剂量依赖性，当 红景天苷浓度增加到 100 ?g/mL 时，细 胞凋亡率为（58.402.33）%，诱导 U87-MG 细胞凋亡的作用增强。结果见 图 2。 2.3 红景天苷对 U87-MG 细胞活 性氧水平的影响 与空白对照组比较，细胞内 ROS 水平随喜树碱浓度的增加变化不明显， 而随红景天苷浓度的增加而增加，当红 景天苷浓度增加至 100 ?g/mL 时 ROS 水平最高（P0.05，P0.01） 。结果见表 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 2。 2.4 红景天苷对 U87-MG 细胞凋 亡相关蛋白表达的影响 与空白对照组比较，随着红