正交试验对密蒙花总黄酮分离纯化工艺的优化

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 正交试验对密蒙花总黄酮分离纯化 工艺的优化 摘要：优选密蒙花（Buddleja officinalis Maxim）总黄酮的分离纯化工 艺条件。以总黄酮含量为指标，通过静 态和动态试验确定较佳树脂，并通过单 因素试验和正交试验优化密蒙花中总黄 酮的分离纯化工艺。结果表明，采用 AB-8 型吸附树脂纯化效果较佳，其优 化的密蒙花总黄酮分离纯化工艺为上样 浓度 2.24 mg/mL，用 3 BV 50%乙醇洗 脱，洗脱流速为 1.5 mL/min；处理后所 得干膏中总黄酮的纯度为 71.31%。其 优选的工艺条件简单可行，可为工业化 纯化密蒙花总黄酮提供参考。 中国论文网 /8/view-12895560.htm -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 关键词：密蒙花（Buddleja officinalis Maxim） ；总黄酮；正交验； 分离纯化 中图分类号：R284.2 文献标识 码：A 文章编号：0439-8114（2016） 22-5894-03 DOI：10.14088/ki.issn0439- 8114.2016.22.042 The Technology of Separation and Purification of Total Flavones from Buddleja officinalis Maxim by Orthogonal Experiment PAN Qiao-dan， WEI Pei-qi， HUANG Yuan-he， LU Hai-feng， WEI Zhong-guang， LI Si-min， HUANG Suo-yi （Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi ，China ） Abstract： To optimize the technology of separation and purification of total flavones from Buddleja officinalis -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 Maxim. With the content of flavones as index， the optimum resin was determined by static experiments and dynamic experiments， and the technology of separation and purification of total flavones from Buddleja officinalis Maxim was investigated by single factors test and orthogonal test. The results showed that AB-8 macroporous adsorption resin had better purification effect than others. The optimized technology of separation and purification of total flavones from Buddleja officinalis Maxim were found to be a sample concentration of 2.24 mg/mL， elution with 3BV 50% ethanol， and flow rate of 1.5 mL/min. After purification， the total flavones of extractum was up to 71.31%. The optimal technology was simple and practicable， which would provide reference for the industrial separation and purification of total flavones from Buddleja officinalis -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 Maxim. Key words： Buddleja officinalis Maxim； total flavones； orthogonal experiment； separation and purification； optimization 密蒙花（Buddleja officinalis Maxim）又名小锦花、蒙花、黄饭花等， 为马钱科植物密蒙花的干燥花蕾及花序。 其味甘，性微寒，有清热养肝、明目退 翳之功，用于治疗目赤肿痛、肝虚目昏、 视物昏花等病症1。密蒙花中含有的黄 酮类化合物主要有刺槐素、木犀草素、 芹菜素、蒙花甙、密蒙花新甙、木犀草 素-7-O-葡萄糖甙、木犀草素-7-O- 芸香 糖甙、秋英甙、芹菜素-7-O-芦丁糖甙等 2，3。具有类雄激素作用、抗炎、降 血糖、免疫调节、抗菌、抗氧化和抗肿 瘤等作用，目前主要运用于干眼症、糖 尿病和糖尿病视网膜病变以及肿瘤等疾 病4。本试验采用静态吸附和动态吸附 方法优选出较佳树脂，并通过单因素试 验和正交试验优化密蒙花总黄酮的分离 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 纯化工艺，为开发密蒙花资源及其总黄 酮制剂奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 密蒙花采于广西百色，干燥粉碎 后备用；芦丁标准品由中国药品生物制 品检定所提供，批号为 100080- 200707；AB-8 和 D-101 大孔树脂由河 北沧州宝恩化工有限公司提供，聚酰胺 树脂由上海润捷化工公司出品提供；其 他试剂均为分析纯。 1.2 仪器 TU-1800 型紫外可见分光光度计 （北京普析通用仪器有限责任公司） ； FA1004 型电子天平（上海舜宇恒平科 学仪器有限公司） ；RE-52AA 型旋转蒸 发仪（上海亚荣仪器厂） ；HH-4 型数显 恒温水浴锅（江苏荣华仪器制造有限公 司） ；DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥 箱，KQ5200DB 型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司） 。 1.3 方法 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 1.3.1 芦丁标准曲线的绘制 将芦 丁标准品配制成不同的浓度，采用硝酸 铝显色法5 ，6 显色后于分光光度计的 510 nm 波长处测吸光度，以吸光度 A 与浓度 C 进行直线回归，得回归方程为 A=9.158 1C+0.0031 2，r=0.999 6。 1.3.2 密蒙花总黄酮的提取 称取 密蒙花粉末 200 g，用石油醚（6090 ）回流去脂 2 次，每次 1 h，加 75% 乙醇回流提取 2 次，每次 1 h，合并提 取液，滤过，滤液减压回收乙醇至无液 滴出现，制得密蒙花总黄酮提取液，冷 藏备用。 1.3.3 密蒙花总黄酮含量测定 取 样品液稀释到一定质量浓度，于 510 nm测定吸光度，按回归曲线方程计算 得样品液中总黄酮的质量浓度为 22.38 mg/mL（原药材含量为 476.19 mg/mL） 。 1.3.4 大孔树脂的预处理7 称取 AB-8、D-101 和聚酰胺树脂各 200 g， 用 95%乙醇浸泡 24 h，湿法装柱，用 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 95%乙醇冲洗至流出液不浑浊为止，再 用蒸馏水冲洗至无醇味，用体积分数 5%HCI 溶液浸泡 24 h，然后用蒸馏水 冲洗至 pH 为中性，接着用体积分数 5%的 NaOH 溶液浸泡 24 h，最后用蒸馏水冲 洗至 pH 为中性，晾干，备用。 2 结果与分析 2.1 静态吸附行为的考察8，9 取已处理好的吸附树脂各 5 g（湿质量） ，置 100 mL 具塞锥形瓶中， 分别精密加入上样液 10 mL，振荡 24 h，滤过，滤液适当稀释后测定吸光度， 计算静态吸附量和吸附率。在吸附饱和 的树脂中分别加入 95%乙醇 10 mL 于锥 形瓶中，振摇 24 h，滤过，同法测定吸 光度，计算滤液中总黄酮的质量浓度， 并得到解吸量和解吸率，结果见表 1。 从表 1 可以看出，AB-8 吸附树脂的吸 附率和解吸率均为最高，其静态吸附密 蒙花总黄酮为 1.665 mg/g 树脂（湿质量） 。 吸附量=（上样液总黄酮质量-水 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 洗液总黄酮质量）/树脂质量 吸附率=（上样液总黄酮质量-水 洗液总黄酮质量）/上样液总黄酮质量 100% 解吸量=醇洗液总黄酮质量/树脂 质量100% 解吸率=醇洗液总黄酮质量/（上 样液总黄酮质量-水洗液总黄酮质量） 100%。 2.2 动态吸附行为的考察10 称取吸附树脂各 5 g（湿质量） 并湿法装柱，加入已知浓度的上样液， 用蒸馏水洗至水洗液呈无色，再用 95% 的乙醇洗脱，收集洗脱液，分别测定水 洗液和洗脱液中总黄酮的含量，计算树 脂吸附量、吸附率、解吸量及解吸率， 结果见表 2。结果表明，AB-8 吸附树脂 对密蒙花总黄酮的吸附能力及洗脱能力 均为最强，综合静态和动态的吸附、洗 脱，AB-8 吸附树脂更适合分离纯化密 蒙花的总黄酮。 2.3 AB-8 树脂纯化工艺条件的优 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 化 2.3.1 上样液浓度的考察 将不同 浓度的上样液以相同体积分别通过 6 根 AB-8 吸附树脂柱，用水洗至流出液近 无色，收集流出液和水洗液，测定总黄 酮含量，计算树脂吸附率，考察上样液 对吸附效果的影响，结果见图 1。由图 1 可知，随着上样液浓度的增加，总黄 酮的吸附率逐渐增加，当上样液浓度超 过 2.24 mg/mL 后，AB-8 吸附树脂的吸 附率变化不大，因此选择 2.24 mg/mL 上样液浓度进行优化试验。 2.3.2 洗脱速率的考察 称取已处 理好的树脂 6 份装柱，取一定的上样量 和上样体积，考察洗脱液流速对解吸效 果的影响，结果见图 2。由图 2 可知， 随着洗脱液流速的增加，其解吸率先增 加后下降，当洗脱液流速为 2.0 mL/min 时解吸率达到最大，因此选择洗脱速率 为 2.0 mL/min 左右进行优化试验。 2.3.3 洗脱剂浓度的选择 称取已 处理好的树脂 5 份，取一定体积的已知 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 浓度的上样液进行动态吸附。吸附完成 后，先用水洗脱至流出液为无色，再依 次用 10%、30%、50%、70% 、95%乙 醇洗脱至流出液为无色。结果密蒙花总 黄酮的洗脱量分别为 0.273、3.073、3.580、3.696 和 3.797 mg/g，洗脱率分别为 6.23%、 70.34%、81.59% 、84.57% 和 86.33%。从经济和安全方面考虑，取 50%左右的乙醇为洗脱剂进行优化试验。 2.3.4 上样量的考察 称取已处理 好的树脂 5.0 g，上样液质量浓度为 2.238 mg/mL，分段收集流出液共 30 份， 每份 5 mL，以总黄酮浓度为考察指标， 绘制泄漏曲线（图 3） 。当流出液中总黄 酮浓度达到上样液浓度的 10%（0.223 8 mg/mL）时，称为泄漏点。当上样量为 20 mL 时，密蒙花总黄酮就已经明显泄 漏了，因此确定最大上样量为 20 mL。 2.3.5 洗脱剂用量的选择 将已处 理好的树脂 5.0 g 装柱，上样液质量浓 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 度为 2.24 mg/mL 上样液 20 mL，用蒸 馏水洗至无色，然后用 30%乙醇洗脱， 洗脱剂速率为 2.0 mL/min，每份收集 5 mL，共收集 10 份，以测定密蒙花总黄 酮质量浓度为考察指标，绘制曲线，结 果见图 4。由图 4 可以看出，到第 8 份 后，洗脱液中的总黄酮质量浓度已降得 很低，说明总黄酮的洗脱已基本完全， 此时洗脱剂用量为 40 mL（约为 5 BV） ， 因而应取 4 BV 左右的洗脱剂用量进行 优化试验。 2.4 正交试验对 AB-8 树脂纯化 工艺11的优化 根据总黄酮的理化性质与大孔树 脂的吸附特点，再结合上述单因素的试 验结果，选取上样浓度、洗脱剂浓度、 洗脱剂用量、流速为因素，以干膏中的 总黄酮含量为指标，设计 L9（34）正 交试验，结果见表 3。由表 3 可知，影 响 AB-8 吸附树脂纯化密蒙花总黄酮工 艺的因素依次为 CADB。方差分析 结果（表 4）显示，A（上样浓度） 、 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 C（洗脱剂用量）和 D（洗脱速率）对 干膏中总黄酮含量影响极显著 （P0.01） 。其纯化的最佳提取条件为 A3B2C1D1，即上样浓度为 2.24 mg/mL，用 3 BV 50%乙醇洗脱，洗脱 流速为 1.5 mL/min。按此最佳纯化工艺 条件重复操作 3 次，减压浓缩后真空干 燥，测得浸膏中总黄酮纯度 71.31%。 3 结论 密蒙花黄酮类化合物为密蒙花的 主要有效成分，而用大孔吸附树脂在分 离