转染hbx诱导肝癌细胞株bel―7404多药耐药的初步研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 转染 HBx 诱导肝癌细胞株 Bel7404 多药耐药的初步研究 摘要 目的 研究 HBxD 染对 肝癌细胞株 Bel-7404 增殖、细胞周期以 及多药耐药的影响，并探讨 HBx 转染 诱导肝癌多药耐药发生的可能机制。 方法 选用人肝癌 Bel-7404 细胞株进行 转染，根据 HBx 转染情况将细胞分为 三组，分别为转染 HBx 细胞组（Bel- 7404-HBx 组） 、转染空载体细胞组 （Bel-7404-con 组）和空白细胞组 （Bel-7404 组） ；实时定量 PCR 检测各 组细胞中 HBx RNA 的表达。 Western blot 法检测各组细胞中 HBx、Notch-1 和多药耐药蛋白（MRP）的表达， CCK-8 法检测各组细胞增殖活性和多药 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 耐性，流式分析仪检测各组细胞生长周 期。 结果 PCR 扩增凝胶电泳显示 Bel- 7404-HBx 组有 HBx 片段出现，而其他 两组未见 HBx mRNA 的表达； Western bolt 结果显示在 Bel-7404-HBx 组处有蛋 白条带（即 HBx 蛋白） ，而 Bel-7404 组 和 Bel-7404-con 组未见表达。与 Bel- 7404 组和 Bel-7404-con 组比较，Bel- 7404-HBx 组细胞增殖显著加快（P 0.05） ；多药耐药实验显示，与 Bel-7404 组和 Bel-7404-con 组比较，丝裂霉素、 阿霉素、5- 氟尿嘧啶、顺铂和奥沙利铂 在 Bel-7404-HBx 组中耐药指数明显增 加（P 中国论文网 /6/view- 12955456.htm 关键词 HBx；肝癌细胞株； Bel-7404；Notch 信号通路；多药耐药 蛋白；多药耐药 中图分类号 R735.7 文献标识 码 A 文章编号 1673-7210（2017） 09（c）-0016-05 Abstract Objective To study the -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 effects of HBx transfection on proliferation， cell cycle， and multidrug resistance of hepatocellular carcinoma cell line Bel-7404， and to investigate the possible mechanism of HBx transfection in inducing the multidrug resistance of liver cancer. Methods Human hepatocellular carcinoma cell line Bel- 7404 was transfected， and the cells were divided into three groups according to the transfection conditions， which were transfected HBx cell group （Bel-7404- HBx group） ， transfected cell group with empty vector （Bel-7404-con group） and blank cells group （Bel-7404 group） . The expression of HBx RNA in all groups was detected by real-time PCR. The expression of HBx， Notch-1 and multi-drug resistance protein （MRP） in all groups was detected by Western blot， the cell proliferation activity and multidrug resistance in all groups were -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 determined by CCK-8， and the cell growth cycle was analyzed by flow cytometer. Results PCR amplified gel electrophoresis showed that HBx fragments were detected in Bel-7404-HBx group， while no HBx mRNA expression could be found in the other two groups； Western blot indicated that the protein band （HBx protein） was detected in the Bel-7404-HBx group， while no expression was found in Bel-7404 group and Bel-7404-con group. Furthermore， compared with Bel-7404 group and Bel- 7404-con group， the cell proliferation in Bel-7404-HBx group was increased significantly （P 0.05） ； multidrug resistance experiments showed that， compared with Bel-7404 group and Bel- 7404-con group， the resistance index of Mitomycin， Adriamycin， 5- Fluorouracil， Cisplatin and Oxaliplatin in the Bel-7404-HBx group was increased -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 significantly （P 0.05） 。见表 1。 2.5 耐药性比较 与 Bel-7404 组和 Bel-7404-con 组 比较，5 种药物在 Bel-7404-HBx 组中耐 药指数增加明显（P 0.05 或 P 0.01） ， 意味着 Bel-7404-HBx 组耐药性增强， 对且多种化疗药物产生耐药。见表 2。 3 讨论 HBV 慢性感染是世界范围内原 发性肝细胞癌的主要发病原因之一10， HBx 基因致肝细胞癌发生的机制是目前 研究的热点。HBx 基因存在于 HBV 基 因的第 4 个阅读框，具有强大的生物学 功能，包括转录反式激活病毒基因组和 宿主细胞基因、增强转录因子 DNA 结 合特性、抑制 p53 蛋白活性、参与细胞 信号传导途径和细胞凋亡的调节等。这 些功能可能与肝细胞癌的发生具有密切 的关系11。研究发现肝癌细胞组织中 HBx 呈弥漫性表达。一些体内及体外研 究也发现 HBx 可诱导细胞的恶性转化 甚至参与癌变发生12-13。因此，观察 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 HBx 对体外细胞增殖的影响，可为进一 步研究 HBx 致肝细胞癌的发生机制提 供依据和线索。 Notch 信号在肿瘤的发生和演进 过程中有重要作用，紊乱的 Notch 信号 不仅能够直接引起肿瘤的发生，而且可 通过与其他多条信号通路的交互作用， 以间接的方式最终诱导肿瘤的形成14， 在很多组织肿瘤的发生过程中均出现了 Notch 信号通路的异常，Notch 信号的 激活可通过促进细胞增殖和抑肝癌细胞 凋亡活化的 Notch-1，通过增强 CDK2 和 CycIinD 的活性而促进细胞周期的进 程15。本研究中利用 qPCR 检测结果 显示，转染的 Bel-7404 细胞内 HBx 的 RNA 和蛋白表达明显，这意味着转染 Bel-7404 细胞后构建过表达 HBx 的肝 癌细胞成功。本研究还发现，转染 HBx 的人肝癌 Bel-7404 细胞中的 Notch-1 蛋 白表达明显高于 Bel-7404 组和 Bel- 7404-con 组，提示 Bel-7404 细胞中 HBx 的过表达诱导了细胞内 Notch-1 表 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 达水平的增加，造成细胞内 Notch 信号 通路的紊y 。同时细胞增殖和周期检 测结果显示，转染 HBx 后细胞增殖能 力显著提高，细胞生长周期 S 期增加， 提示 Notch-1 的活化诱导了 Bel-7404 细 胞增殖的发生。 肿瘤细胞的多药耐药是导致肿瘤 细胞治疗失败和疾病复发的主要原因之 一16。有报道指出，检测患者体内 MRP 的表达可以作为监测恶性肿瘤细 胞原发性耐药的主要指标17-18。肿瘤 细胞产生 MRP 与药物外排泵 ABC 转运 蛋白的过度表达与细胞凋亡水平异常改 变、DNA 修复活性增强、细胞内酶异 常改变和器官微环境改变有密切关系 19，此外 Notch-1 信号与肿瘤细胞多 药耐药的形成有重要的联系，过表达的 Notch-1 能够增加与多药耐药相关的 ABBCC1 基因的表达，诱导多药耐药现 象的形成20 。本研究发现，转染 HBx 的 Bel-7404 细胞多药耐药明显增强，这 意味着转染 HBx 的 Bel-7404 细胞可能 -精选财经经济类资料- -最新