二、生物制品的制备

LOGO 生化制品技术 LOGO 二、 生物制品的制备 Preparation of biopreparate 生化制品技术 一、 一般 生物制品的制备方法 (Preparation of general bio-preparate ) 一、生物制品原料的选择、预处理与保存 方法 （ Selection、 pretreatment and preservation of raw material of biopreparate） （ 1）原料选择 u原料 的选择原则 ： u 有效成分含量高，新鲜； u 原料来源丰富，产地较近； u 原料中杂质含量少； u 原料成本低等。 原料的选择注意事项： 植物原料生长的季节性； (药 材 是宝， 过 期是草 ) 微生物原料的对数期； 动物原料的年龄与性别。 （ 2）原料的预处理与保存： 动物原料 ： 采集后要立即处理，去除结缔组 织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。 植物原料 ： 要择时采集并就地去除无用的部 分，保鲜处理； 微生物原料 ： 要及时将菌体细胞与培养液分 开，进行保鲜处理。 原料的保存方法主要有： 冷冻法。 该方法适用于所有生物原料。常 用 -40 速冻。 有机溶剂脱水法。 常用的有机溶剂是丙酮 。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对 活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等 。 防腐剂保鲜。 常用乙醇、苯酚等。该法适 用于液体原料，如发酵液、提取液等。 二、生物制品的提取（ extraction） (1)生物组织与细胞的破碎 （ smash of tissue and cell）：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中 ，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。常用的 破碎方法： 磨切法 ，该法属于机械破碎方法，设备有组织捣碎 机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。 压力法 ，有 加压与减压 两种，常用的法兰西压釜、 细菌压等使用效果良好。 反复冻融 (freeze thawing)法 ，设备简便 ，活性保持好，但用时较长。 超声波振荡破碎 (ultrasonic oscillation crash)法 ，该方法破碎效果 较好，但由于局部发热，对活性有损失。 自溶法 (autolyze method)或酶解法 (enzymolysis method)，用得较少。 （ 2）提取（ extraction） 生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取 时，首先要根据活性物质的性质， 选择提取试剂 。提取试剂主要有：水、缓冲溶液 、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等 ）。 考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。 注意提取的温度、 pH、变性剂等因素。 三、蛋白质类制品的分离纯化方法（ Separation and depuration of protein production） 包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有 ： (1)沉淀法（ precipitation）： 蛋白质、酶的初步纯化 往往用 沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从 而沉淀蛋白质。常用的有盐析法（ salting out）、有 机溶剂沉淀法（ organic solvent precipitation）、等 电点沉淀法（ isoelectric precipitation）、与靶物质 结合沉淀法（如抗体 抗原）（ target banding precipitation）等。 (2) 按分子大小分离的方法 ： 有 超滤法（ ultrafiltration） 透析法 （ dialysis）（即膜分离方法） 、 凝胶层析 法（ gel chromatography） 、 超速离心 法（ ultra centrifugation）等 。 其 中膜分离法可用于生物大分子物质的浓 缩、分级和脱盐。 (3)按分子所带电荷进行分离的 方法 氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质 。 离子交换柱 层析法 （ ion-exchange chromatography） 、 电泳 法 （ electrophoresis） 、 等电聚焦 法 （ isoelectric focusing）等。 色 谱 分离 图 示 （ 4）亲和层析法（ affinity chromatography） 大部分生物活性物 质 都有其作用的 靶物 质 ， 如 酶 与底物 (Substrate)（或抑制 剂 (inhabitor)） 、 抗原 与抗体、激素 (hormone)与受体 (receptor)等， 它 们 之 间 有特异的 亲 合作用 ， 利用 该 性 质设计 的特 异 层 析分离技 术 称 为亲 和 层 析 。 特点： 亲 和 层 析 分离 专 一性 强 ，操作 简 便，是当前 应 用很广泛的分离方法之一 。 亲 和 层 析 的基本原理 （ Mechanism of Affinity Chromatography） 亲 和的一 对 分子中的一方以共价 键 形式与不溶性 载 体相 连 作 为 固定相吸附 剂 。 当含有混合 组 份的 样 品（流 动 相）通 过 此固定相 时 ，只有和固定相分子有特异 亲 和力的物 质 ，才能被 固定相吸附 结 合，其它没有 亲 和力的无关 组 份就随流 动 相流出。 然后改 变 流 动 相成份，将 结 合的 亲 和物洗脱下 来。（ 见 Fig1、 Fig2）。 （ Fig1. Mechanism of AC） （ Fig2. Mechanism of AC） 四、核酸类制品的分离纯化 方法 （ Separation and purification of nucleic acid ） 核酸类药物生产方法主要有 提取法和发酵法 。 提取 法 生产 DNA和 RNA，先提取核酸和蛋白质复 合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离 RNA与 DNA。 发酵 法 主要用于生产 单 核苷酸。 五、糖 类 制品的分离 纯 化 方法 （ Separation and purification of glucide ） 由于各种糖 类 制品的性 质 和原料来源不同 ，没有 统 一 规 范的提取和 纯 化工 艺 。 这 里只介 绍 多糖和粘多糖 的一般分离 纯 化方法。 （ 1）提取方法 （ extraction） 非 降解法 (nondegradation)适用于从含一种粘多 糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水 或盐溶液 。 降解法（ degradation） 适用于从组织中提取结 合比较牢固的粘多糖（ mucoitin）。如从 软骨中分离 提取硫酸软骨素 （ chondroitin sulfate），就是用 碱处 理 进行降解。又如用 酶处理 法可提取与蛋白质结合 的多糖。 （ 2）分离方法 （ Separation） 常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。 乙醇沉淀法（ alcohol precipitation） ： 是 从提取 液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级分 离。 4-5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的 粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘多 糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性 剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵（ CTA）等。 离子交换层析法 （ ion exchange chromatagraphy)： 粘多糖 的聚阴离子能够很好地被阴离子交 换剂吸附和分离，如 Dowex I-X2（商品名）离 子交换树脂、 DEAE-离子交换纤维素（二乙胺 乙基）等。洗脱可用 NaC1溶液进行梯度洗 脱。 离子交换层析原理 Starting conditions Adsorptions on sample substances Start of desorption End of desorption regenerations 六、脂类制品的分离纯化方法 （ Separation and purification of lipid） （ 1）提取方法（ extraction ） 脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂 是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的。 提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键， 将脂质溶解出来。常用的溶剂有组合溶剂，醇是其中 的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等。 （ 2）纯化方法（ purification） 沉 淀 法 (precipitation) ： 由于不同脂质 在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。 吸附层析法 (adsorption chromatography)： 常 用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极性 和离子力等把各种化合物结合到固体吸附剂 上。洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液 来进行，非极性的先流出，极性的后流出 。 离子交换层析法 (Ion exchange chromatography) : 脂质分子的存在有非解 离、两性离子和酸式解离三种状态 。 根据 它们在一定 pH条件下的解离情况，选择 适当的 离子交换剂 可将它们提纯。如 TEAE 纤维素 (Triethylaminoethyl cellulose)对 分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。 七、氨基酸类制品的分离纯化 方法 （ Separation and purification of Aa） （ 1）氨基酸的生产方法 (production of Aa) 蛋白质 水解法 (protein hydrolysis)：水解法 有酸水解 (acid hydrolysis )、碱水解 (base hydrolysis)和酶水解 (enzyme hydrolysis)三 种。 用盐酸水解 (HCl hydrolysis)为常用方法，其 优点是水解迅速、完全，产物全部是 L 型氨 基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等 部分被破坏。 碱水解法 (alkali hydrolysis)易产生消旋作 用，较少应用。 酶水解法 (enzyme hydrolysis)水解不够完全 。 发酵法 (fermentation)： 菌株经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸 。 化学合成 (chemosynthesis)与酶促合成法 (enzyme catalyzed synthesis) 化学合成法 一般得到的是 DL 型氨基酸，尚 需要对异构体拆分 ； 酶 促合成法 也是酶工程在医药工业上的应用 ， 优点： 是 技术工艺简单，转化率高，副产物 少和易提纯等。 （ 2）氨基酸的分离方法 (Separation of Aa ) 有 沉淀法 (precipitation) 、吸附法 (adsorption)和 离子交换法（ ion-exchange ) 。 沉淀法 (precipitation)： 根据形成沉淀的原理不 同分为两种： 是依据不同氨基酸在水中或其他 溶剂中的溶解度差异进行沉淀分离 。 是用特殊 试剂沉淀某种氨基酸 ， 如 用邻二甲苯 -4-磺酸与亮氨酸形成不溶性盐沉 淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离出来 。 吸附法 (adsorption)： 这是利用吸附剂根据氨基 酸吸附力的差异进行氨基酸分离的方法。苯丙氨 酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利用活性炭对其 吸附的原理。 离子交换法（ ion-exchange )： 氨基酸是两性电 解质，在一定 pH条件下，不同氨基酸带电性质及 解离状态是不相同的，因此在离子交换剂上被吸 附的强度不同。常用的离子交换剂为强酸型阳离 子交换树脂，洗脱主要用 pH梯度洗脱。 二、尿激 酶 （ urokinase）的制 备 （ 1）天然尿激 酶 是由两条 肽链 通 过 二硫 键连 接而 成。是 丝 氨酸蛋白 酶 ， 丝 氨酸、 组 氨酸是活 性中心必需的氨基酸。 该 酶 底物 专 一性很 强 ，血 纤维 蛋白溶 酶 原是唯一的天然蛋白 质 底 物，作用于 Arg-Val键 上，使 纤 溶 酶 原 转为纤 溶 酶 。 （ 2）尿激 酶 的 pI为 8-9。溶液状 态 不 稳 定。 用于治 疗 各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。 （ 3）工艺流程（图 3-2） 男性尿 沉淀10 下 ,pH8.5上清尿液 酸 化 pH5.0-5.5 酸化尿 吸 附 硅藻土， 5 硅藻土吸附物 洗涤5 ，水 硅藻土柱 洗 脱0.02%氨水， 0.1mol/L NaCl 饱和 NaH2PO4 ,调 pH8.0 洗脱液 去 热 源、色素DEAE-SephadexA50柱， pH8.0, （二乙氨乙基葡聚糖） 流出液 （活性部分 ） 浓 缩 羧 甲基 纤维 素（ CMC柱， pH4.2) CMC柱 洗脱（ HAC-NaAC)氨水 +NaCl,pH11.5-11.8 洗脱液 透 析 H2O,4 透析液 冻 干 成品 图 3-2 尿激 酶 生 产 工 艺 路 线 （ 4）工艺要点 收尿：男性尿， 8h内 处 理。 调 尿液 pH6.5以下。 硅藻土吸附：加入 1%的硅藻土， 5 下 搅 拌吸附 1h 。 洗脱：硅藻土吸附物用 5 冷水洗 涤 后装柱，当洗脱 液由清 变浑时 开始收集。 除 热 原、色素：收集液用 饱 和 NaH2PO4， 调 pH8.0 ，加 NaCl调电导 至 22M/， 过 DEAE-Sephadex A50 层 析柱，收集流出活性部分。 CMC浓缩 ：流出液用 1 mol/L HAc调 至 pH4.2， 用蒸 馏 水 调电导 至 16-17M/，通 过 CM-C层 析 柱。用 10倍体 积 的 pH4.2的 HAC-NaAc缓 冲液洗 涤 柱床。洗后用 0.1%氨水 0.1mol/L NaCl溶液洗脱 尿激 酶 。收集活性 组 分， 杂质 被吸附。 产 品 质 量：无色澄清液或白色 冻 干粉末。 酶 活 力 15,000 IU/mg蛋白 质 。 第二 节 生物制品的 质 量控制 （ quality controlling of biopreparate） 38 生物制品 的基本属性和特点（一） u其起始材料均为生物活性物质； u生物制品生产加工全过程是生物学过程，是 无菌操作过程； u有些生物制品的生产过程是有毒或有菌的过 程 ; u生物制品多为蛋白质或多肽类物质，分子量 较大，并具有复杂的分子结构 , 较不稳定， 易失活，易被微生物污染，易被酶解破坏。 39 生物制品 的基本属性和 特点（二） u其质量控制和质量检定是采用生物学分析方 法，其效价或生物活性检定有其变异性； u生物制品原材料、中间品、成品、运输、贮 存、甚至使用保持在 “冷链 ”系统中； u特别是预防制品使用对象不是病人，而是健 康人群； u生物制品的质量控制实行生产全过程监控 ; u 生产现场检查时要充分考虑这些特点 山西疫苗 百名儿童受害 2010年 03月 17日，据有关媒体 报 道， 山西近百名儿 童不明病因致死、致残或引 发 各种后 遗 病症 。家 长 伤 心欲 绝 、四 处 求治、 负 担沉重。 导 致如此惨 剧 的 病源何在？ 锲 而不舍的患儿家 长纷纷质 疑 :“接种了 乙 脑 疫苗 怎么又会得 乙 脑 ？ ”“急性播散性 脑 脊髓炎 难 道不是接种疫苗所致？ ”接种疫苗 违规 操作， 还 是 “高温暴露 ”疫苗失效？ 矛 头 直指用来保障人 民生命健康的疫苗！ 一 、原材料的 质 量控制（ quality controlling of material ） 原材料的 质 量控制是要确保 编码 生物制品的 DNA序列的正确性，重 组 微生物来自 单 一克 隆，所用 质 粒 纯 而 稳 定，以保 证产 品 质 量的 安全性和一致性。 二、培养 过 程的 质 量控制（ quality controlling of culture process ） 在工程菌 菌种 贮 存中 ，要求种子克隆 纯 而 稳 定； 在 培养 过 程中 ，要求工程菌所含的重 组质 粒 稳 定， 始 终 无突 变 ； 在 重复生 产发 酵中 ，工程菌表达 稳 定；始 终 能排除 外源微生物 污 染。 产 品 应 有种子批系 统 ， 并 证 明种子批不含致癌因子，无 细 菌、病毒、真菌 和支原体等 污 染，并由原始种子批建立生 产 用工作 细 胞 库 。 原始种子批 须 确 证 克隆基因 DNA序列， 详细 叙述种 子批来源、方式、保存及 预计 使用期，保存与复 苏 时 宿主 载 体表达系 统 的 稳 定性。 三、 纯 化工 艺过 程的 质 量控制（ quality controlling of depuration process ） 产 品要有足 够 的生理和生物学 试验 数据，确 证 提 纯 物 分子批 间 保持一致性；外源蛋白 质 、 DNA与 热 原 质 都控制在 规 定限度以下。 四、目 标产 品的 质 量控制（ quality controlling of the end product ） 基因工程 药 物 质 量控制主要包括： 产 品的 鉴别 、 纯 度、活性、安全性、 稳 定性和一致性。 1、 产 品的 鉴别 （ discrimination of production ） n有 许 多方法可用于全面 鉴 定，如下表： 重组蛋白质药物产品常用的鉴定方法 电 泳方法： SDS-PAGE，等 电 点聚焦 (isoelectric focusing )， 免疫 电 泳 (immunoelectrophoresis ) 免疫学分析方法：放免法（ RIA），放射性免疫 扩 散法（ RID） 酶 联 免疫吸附法（ ELISA），免疫印 渍 （ immunoblotting） 受体 结 合 试验 （ receptor binding） 各种高效液相分析法（ HPLC） 肽图 分析法 (Peptide chart analysis) Edman N末端序列分析法 圆 二色 谱 （ CD） 核磁共振（ NMR, nuclear magnetic resonance） 2、 纯 度分析（ analysis of purity ） 它包括目的蛋白 质 含量 测 定和 杂质 限量分析两个方 面的内容。 （ 1）目的蛋白 质 含量 测 定 通常采用的方法有 还 原性及非 还 原性 SDS-PAGE 、等 电 点聚焦、各种 HPLC、毛 细 管 电 泳（ CE） 等。 （ 2） 杂质 蛋白 类杂质 非蛋白 类杂质 ：主要有病毒和 细 菌等微生物、 热 原 质 、内毒素、致敏原及 DNA。 3、生物活性 测 定（ measurement of bio- activity ） 是保 证 基因工程 药 物 产 品有效性的重要手段，需要 进 行