GB 4789.38-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 肠埃希氏菌计数中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发 布2012本 标准 代替 食品 卫生 微生 物学 检验 大 肠杆 菌计 数 。本 标准 与 /， 主要 变化 如下 ：修 改了 标准 的中 文名 称； 修 改了 培养 基和 试剂 ；将 “ 第 二法 大 肠杆 菌 计 数法 ” 改 为 “ 大 肠埃 希氏 菌平 板计 数法 （第 二法 ） ” ；删 除了 “ 第 三法 大 肠杆 菌 片 计数 法 ” ；修 改了 附录 A。肠埃希氏菌计数1范 围本 标准 规定 了食 品中 大肠 埃希 氏菌 （ 计数 的方 法。本 标准 适用 于食 品中 大肠 埃希 氏菌 的计 数 ， 其 中 大 肠埃 希氏 菌平 板计 数法 （ 第 二法 ） 不 适 用于 贝类 产品 。 2术 语和 埃 希氏 菌 杆 菌 广 泛存 在于 人和 温血 动物 的肠 道中 ， 能 够在 发 酵乳 糖产 酸产 气 ， 靛 基质 、 甲 基红 、  、 柠 檬酸 盐 ） 生 化试 验为 或 的 革兰 氏阴 性杆 菌 。 以 此作 为粪 便污 染指 标来 评价 食品的 卫生 状况 ，推 断食 品中 肠道 致病 菌污 染的 可能 性。能 数 基 于泊 松分 布的 一种 间接 计数 方法 ， 简称 为 设 备和 材料 除 微生 物实 验室 常规 灭菌 及培 养设 备外 ，其 他设 备和 材料 如下 ：a） 恒 温培 养箱 ： 36 1 ；b） 冰 箱： 2 5 ；c） 恒 温水 浴箱 ： ；d） 天 平： 感量 为 c） 均 质器 ；d） 振 荡器 ；e） 无 菌吸 管： 1m L（ 具 刻 度 ） 、 10m L（ 具 刻 度） 或微 量移 液器 及吸 头；f） 无 菌锥 形瓶 ：容 量 50m ；g） 无 菌培 养皿 ：直 径 90m m ；h）  管 或精 密  ；i） 菌 落计 数器 ；j） 紫 外灯 ：波 长 360 36 功率 6W。4培 养基 和试 基 硫酸 盐胰 蛋白 胨（ 肉汤 ：见 附录 （ ： 见附 录 胨 水： 见附 录 葡 萄糖 蛋白 胨水 甲 基红 ( 用 ： 见附 录 氏 柠檬 酸盐 培养 基： 见附 录 盐 缓冲 液： 见附 录 美 蓝（ 琼脂 ：见 附录 琼 脂斜 面： 见附 录 紫 中性 红胆 盐琼 脂（ ： 见附 录 紫 中性 红胆 盐 伞 形酮 糖 苷 琼 脂（ ： 见附 录 氏 染色 液： 见附 录 质 试剂 ：见 附录  1m 见附 录  1m 见附 录 埃 希氏 菌 （ 第一 法）程 序大 肠埃 希氏 菌 的 检验 程序 见图 1。图 1大 肠埃 希氏 菌 法 检验 程序不产气36 1 18h 24 1 18h 241 48h48h2m L） 样品 +25m  均质10倍系列稀释选择适宜 3个连续稀释度的样品匀液，接种 不产气 产气兰氏染色阴性管 阳性管查 步 的 和 半固 体样 品： 称取 25， 放入 盛有 25m 盐 缓冲 液的 无菌 均质 杯内 ， 80r/m 100r/m  1m 2m 制 成 1:0样 品匀 液 ， 或 放入 盛有 25m 盐 缓冲 液的 无菌 均质袋 中， 用拍 击式 均质 器拍 打 1m 2m  1:0的 样品 匀液 。样 品 ： 以 无菌 吸管 吸取 25m 置 盛有 25m 盐 缓冲 液的 无菌 锥形 瓶 （ 瓶 内预 置适当 数量 的无 菌玻 璃珠 ）中 ，充 分混 匀， 制成 1:0的 样品 匀液 。匀 液的 在 ， 必要 时分 别用 1m m 。m 吸 管或 微量 移液 器吸 取 1:0样 品匀 液 1m L， 沿管 壁缓 缓注 入 9m 磷 酸盐 缓冲 液的 无菌 试管 中 （ 注 意吸 管或 吸头 尖端 不要 触及 稀释 液面 ） ， 振 摇试 管或 换用 1支 1m 吸 管或 吸头 反复吹 打， 使其 混合 均匀 ，制 成 1:0的 样品 匀液 。对 样品 污染 状况 的估 计 ， 按 上述 操作 ， 依 次制 成 10倍 递增 系列 稀释 样品 匀液 。 每 递增 稀释 1次 ，换 用 1支 1m 吸 管或 吸头 。从 制备 样品 匀液 至样 品接 种完 毕， 全过 程不 得超 过 15m 酵 试验每 个样 品， 选择 3个 适宜 的连 续稀 释度 的样 品匀 液（ 液体 样品 可以 选择 原液 ） ， 每个 稀释 度接 种 3管月 桂基 硫酸 盐胰 蛋白 胨 （ 肉 汤 ， 每 管接 种 1m L（ 如 接种 量超 过 1m L， 则 用双 料  ） ， 36 1 培 养 24h2h， 观察 小倒 管内 是否 有气 泡产 生， 24h2者 进行 复发 酵试 验， 如未 产气 则继 续培 养48h2h。 产气 者进 行复 发酵 试验 。如 所有 管 均未 产气 ，即 可报 告大 肠埃 希氏 菌 。酵 试验用 接种 环从 产气 的 管 中分 别取 培养 物 1环 ，移 种于 已提 前预 温至 45 的 管 中， 放入 带盖 的 水 浴箱 内 。 水 浴的 水面 应高 于肉 汤培 养基 液面 ， 培 养 24h2h， 检 查小 倒管 内是 否有 气泡 产生 ，如 未有 产气 则继 续培 养至 48h2h。 记录 在 248气 的 管 数。 如所 有 管 均未 产气 ，即 可报 告大 肠埃 希氏 菌 ； 如有 产气 者， 则进 行 分 离培 养。美 蓝平 板分 离培 养轻 轻振 摇各 产气 管 ， 用 接种 环取 培养 物分 别划 线接 种于  ， 36 1 培 养 18h 24h。 观 察平 板上 有无 具黑 色中 心有 光泽 或无 光泽 的典 型菌 落。 琼 脂斜 面或 平板 培养从 每个 平板 上挑 5个 典型 菌落 ， 如 无典 型菌 落则 挑取 可疑 菌落 。 用 接种 针接 触菌 落中 心部 位 ， 移 种到营 养琼 脂斜 面或 平板 上， 36 1 ， 培养 18h 24h。 取培 养物 进行 革兰 氏染 色和 生化 试验 。取 培养 物进 行靛 基质 试验 、 和 柠檬 酸盐 利用 试验 。大 肠埃 希氏 菌与 非大 肠埃 希氏 菌的 生化 鉴别 见表 1。大 肠埃 希氏 菌与 非大 肠埃 希氏 菌的 生化 鉴别靛基质（ I） 甲基红（ 柠檬酸盐（ C） 鉴定（型别） 典型大肠埃希氏菌非典型大肠埃希氏菌 典型中间型非典型中间型 典型产气肠杆菌非典型产气肠杆菌注 1：如出现表 1以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。注 2：生化试验也可以 选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等方法 ，按照产品说明书进行操作。埃 希氏 菌 的 报告大 肠埃 希氏 菌为 革兰 氏阴 性无 芽胞 杆菌 ， 发 酵乳 糖 、 产 酸 、 产 气 ， 试 验为 或 。 只要 有 1个 菌落 鉴定 为大 肠埃 希氏 菌， 其所 代表 的 管 即为 大肠 埃希 氏菌 阳性 。依 据 阳 性管 数查 见 附录 B） ， 报告 每 g（ m L） 样品 中大 肠埃 希氏 菌 6大 肠埃 希氏 菌平 板计 数法 （第 二法 ）程 序大 肠埃 希氏 菌平 板计 数法 的检 验程 序见 图 2。图 2大 肠埃 希氏 菌平 板计 数法 检验 步 的 稀释按 。计 数检样25g（ m l）样品 +25m 质选择 2个 3个适宜连续稀释度的样品匀液，接种 数发荧光菌落报告结果36 1 18h  2个 3个 适 宜的 连续 稀释 度的 样品 匀液 ， 每 个稀 释度 接种 2个 无菌 平皿 ， 每 皿 1m L。 同 时取 1m 液 加入 无菌 平皿 做空 白对 照。0m L 15m  45 的 结晶 紫中 性红 胆盐 琼脂 （ 倾 注于 每个 平皿 中 。 小 心旋 转平 皿， 将培 养基 与样 品匀 液充 分混 匀。 待琼 脂凝 固后 ，再 加 3m L 4m 平 板表 层 。凝 固后 翻转 平板 ， 36 1 培 养 18h 24h。菌 落数 的选 择 选 择菌 落数 在 1010的 平板 ，暗 室中 360 36 长紫 外灯 照射 下， 计数 平板上 发浅 蓝色 荧光 的菌 落。 检 验时 用已 知 菌 株 （ 如 大肠 埃希 氏菌 和 产气 肠杆 菌 （ 如 做 阳性和 阴性 对照 。埃 希氏 菌平 板计 数的 报告两 个平 板上 发荧 光菌 落数 的平 均数 乘以 稀释 倍数 ， 报 告每 g（ m L） 样 品中 大肠 埃希 氏菌 数 ， 以 g(m L)表 示。 若所 有稀 释度 （包 括液 体样 品原 液） 平板 均无 菌落 生长 ，则 以小 于 1乘 以最 低稀 释倍 数报 告。 基 和试 基 硫酸 盐胰 蛋白 胨 （ 肉  胰 蛋白 胨或 胰酪 胨 钠  氢 二钾 （ 二 氢钾 （ 24） 基 硫酸 钠 水 2制 法将 上述 成分 溶解 于蒸 馏水 中 ， 调 节 分 装到 有玻 璃小 倒管 的试 管中 ， 每 管 10m L。 12 高 压灭 菌 15m 制 备双 料 时 ，除 蒸馏 水外 其他 成分 加倍 。 （  胰 蛋白 胨或 胰酪 胨 盐 或混 合胆 盐  氢 二钾 （ 二 氢钾 （ 24） 钠 水 制 法将 上述 成分 溶解 于蒸 馏水 中 ， 调 节 分 装到 有玻 璃小 倒管 的试 管中 ， 每 管 8m L。 12 高 压灭 菌 15m 胨 胰 胨或 胰酪 胨 水 2制 法加 热搅 拌溶 解胰 胨或 胰酪 胨于 蒸馏 水中 。分 装试 管， 每管 5m L。 12 高 压灭 菌 15m 葡 萄糖 蛋白 胨水 甲 基红 ( 用 多 胨 糖 氢 二钾 （ 水 将 上述 成分 溶解 于蒸 馏水 中， 调节 分装 试管 ，每 管 1m L， 12 高 压灭 菌 15m 备用 。红 （ 试 红 试  甲 基红 10m  醇 蒸 馏水 10m 红 溶于 30m  醇中 ，然 后加 入 20m 水 。方 法取 适量 琼脂 培养 物接 种于 缓冲 葡萄 糖蛋 白胨 水， 36 1 培 养 2d 5d。 滴加 甲基 红试 剂一 滴， 立即 观察 结 果 。鲜 红色 为阳 性， 黄色 为阴 性。  溶 液成 分及 制法 ：取 加无 水乙 醇溶 解， 定容 至 10m L。 氧化 钾溶 液成 分及 制法 ：取 氢氧 化钾 40g， 加蒸 馏水 溶解 ，定 容至 10m L。方 法取 适量 琼脂 培养 物接 种于 缓冲 葡萄 糖蛋 白胨 水 ， 36 1 培 养 2d 4d。 加 入 6% 溶 液 和 40%氢 氧化 钾溶 液 ， 充 分振 摇试 管 ， 观 察结 果 。 阳 性反 应立 刻或 于数 分钟 内出 现红 色 ， 如 为阴性 ，应 放在 36 1 继 续培 养 4行 观察 。氏 柠檬 酸盐 培养  柠 檬酸 钠 钠 氢 二钾 二 氢铵 镁 里 香酚 蓝  水 2制 法将 各成 分加 热溶 解， 必要 时调 节 每管 分装 10m L， 12 高 压 15m 制成 斜面 。方 法挑 取培 养物 接种 于整 个培 养基 斜面 ， 36 1 培 养 24h2h， 观察 结果 。阳 性者 培养 基变 为蓝 色。盐 缓冲 二 氢钾 （ 水 贮 存液 ：称 取 酸 二氢 钾溶 于 50m 水 中， 用大 约 175m m 氢 氧化 钠 调 节 用蒸 馏水 稀释 至 10m 存 于冰 箱。稀 释液 ：取 贮存 液 ， 用蒸 馏水 稀释 至 10m L， 分装 于适 宜容 器中 ， 12 高 压灭 菌 15m 美 蓝（  蛋 白胨  氢 二钾 （   （ 水溶 液） %水 溶液 美 蓝  液 水 2制 法在 10m 水 中煮 沸溶 解蛋 白胨 、 磷 酸盐 和琼 脂 ， 加 水补 足 。 分 装于 三角 烧瓶 中 。 每 瓶 10m ， 调 节 12 高 压灭 菌 15m 使 用前 将琼 脂融 化 ， 于 每 10m 中 加 5m 的 20%乳 糖溶 液， 2m %的 伊红 水 溶液 和 的美 蓝水 溶液 ，摇 匀， 冷至 45 50 倾 注平 皿。琼 脂斜  牛 肉膏 胨  水 2制 法将 上述 成分 加于 蒸馏 水中 ， 煮 沸溶 解 ， 调 节 分 装合 适的 试管 ， 12 高 压灭 菌 15m 灭 菌后 摆成 斜面 备用 。紫 中性 红胆 盐琼 脂（  蛋 白胨 膏  钠 或 3号 胆盐 红 紫  15g 18水 2制 法将 上述 成分 溶于 蒸馏 水中 ， 静 置几 分钟 ， 充 分搅 拌 ， 调 节 煮 沸 2m 将 培养 基冷 至 45 50倾 注平 板。 使用 前临 时制 备， 不得 超过 3h。紫 中性 红胆 盐 伞 形酮 糖 苷 琼 脂（ 成 分 蛋 白胨 膏  钠 或 3号 胆盐 红 紫  15g 18水 4伞 形酮 糖 苷（ 将 上述 成分 溶于 蒸馏 水中 ， 静 置几 分钟 ， 充 分搅 拌 ， 调 节 煮 沸 2m 将 培养 基冷 至 45 50使 用。 氏 染色 紫 染色  结 晶紫 乙醇 1 草酸 铵水 溶液 将 结晶 紫完 全溶 解于 乙醇 中， 然后 与草 酸铵 溶液 混合 。氏  碘 钾 水 将 碘与 碘化 钾先 行混 合， 加入 少许 蒸馏 水充 分振 摇， 待完 全溶 解后 ，再 加蒸 馏水 至 30m L。复  沙 黄 乙醇 蒸 馏水 将 沙黄 溶解 于乙 醇中 ，然 后用 蒸馏 水稀 释。在 火焰 上固 定， 滴加 结晶 紫染 液， 染 1m 水洗 。革 兰氏 碘液 ，作 用 1m 水洗 。