艾滋病梅毒和乙肝检测方法介绍及选择ppt课件

艾滋病、梅毒、乙肝检测方法 介绍及选择 1 艾滋病、梅毒、乙肝 -概况 艾滋病 梅毒 乙肝 病原体 HIV病毒 梅毒螺旋体 HBV病毒 传 染源 HIV感染者 /AIDS 梅毒患者 急慢性乙肝患者和携 带 者 传 播途径 血液 /性 /母 婴传 播 性 /母 婴传 播 /接触 /血液 血液 /母 婴传 播 /性 预 防 献血 员筛查 /高危行 为改 变 /孕 妇筛查 献血 员筛查 /高危 行 为 改 变 /孕 妇筛查 主 动 免疫与被 动 免疫 /孕 妇筛查 2 母婴传播 n 艾滋病：约 15 35% HIV阳性孕妇会发生母婴传播 。 90%以上儿童 HIV感染者是由母亲垂直传播而感 染 。 n 梅毒：流产、早产、死胎或马鞍鼻、先天性耳聋 等。 n 乙肝：在我国，人群中 40-50%是由母婴传播积累 而成。 3 主 要 内 容 一 .艾滋病实验室检测技术 n HIV抗体检测 n 核酸检测 n CD4+T淋巴细胞检测 二 .梅毒检测技术 n 显微镜检查法 n 血清学检查法 三 .乙肝检测技术 n HBV免疫标志物检测 n HBV-DNA 4 5 一、艾滋病检测技术 n HIV抗体检测 n 核酸检测 n CD4+T淋巴细胞检测 6 HIV抗体检测 n 筛查试验（包括初筛和复检） n 确证试验（ WB） 7 HIV抗体筛查样品 n 血清 /血浆 /全血 n 滤纸干血斑 n 唾液 n 尿液 8 筛查试剂 n 国家食品药品监督管理局注册批准 n 有效期内 n 酶联免疫试剂应批批检合格 n 选择敏感性和特异性高的试剂 9 筛查方法 n 酶联免疫吸附试验 （ ELISA） n 化学发光或免疫荧光试验： 采用发光或 荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。 n 快速检测 （ RT） 及其它检测试验 (1)明胶颗粒凝集试验 (PA) (2)免疫渗滤试验 (3)免疫层析试验 10 (1)酶联免疫吸附试验（ ELISA） n HIV抗体检测试剂： 检测 HIV-1/2抗体 n HIV抗原抗体联合检测试剂： 可同时检测血液中 HIV-1P24抗原和 HIV-1/2抗体 n 用 酶标仪 测定结果 11 四代艾滋病酶联免疫试剂比较 solid phase specific detection of conjugate 第一代 病毒裂解液HIV-1 IgG 抗体HIV-1 -IgG抗体 第二代 病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 IgG 抗体 HIV-1 / -2 IgG抗体 第三代 病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O IgM / IgG 抗体 HIV-1 / -2 / -O 病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O 第四代 病毒裂解液重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 Ab IgM / IgG 抗体 HIV-1 / -2 / -O p24 抗原 病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 抗体 12 ELISA酶联免疫吸附实验 ELISA Enzyme linked immuno sorbent assay HIV 抗原包被平板 病 人抗体 酶 显色剂 + ve - ve13 阴性对照 阳性对 照 阴性 阳性 质控 14 酶联免疫吸附试验（ ELISA） n 优点：准确性高、价格低廉、判断结果标 准客观、结果便于记录和保存 n 用途：流行病学监测及临床大量标本的检 测 15 (2)化学发光或免疫荧光试验 n 采用 发光或荧光底物 n 既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体 n 酶或荧光标记的 HIV抗原或抗体，加发光或荧光底 物 n 用 发光仪或荧光仪 测定结果 16 全血样品 加 50ul样品于样品垫中 手指血方法 静脉血方法 加一滴缓冲液 15分钟内读取结果 （ 3）快速检测（ RT）及其它检测试验 17 快速检测（ RT）及其它检测试验 优点 :试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检 测。 不需专门设备和人员培训 ,一般可在 10 30分 钟内得出结果。 缺点 :肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。 18 样 样 品品 初筛试验初筛试验 一阴一一阴一 阳阳均阳性反应均阳性反应 报告阴性报告阴性确证试验确证试验 复检试验复检试验 报告阴性报告阴性 均阴性反应均阴性反应 阳性反应阳性反应 原有试剂另一原有试剂另一 不同原理（或厂家）不同原理（或厂家） 试剂或另外两种不同试剂或另外两种不同 原理（或厂家）试剂原理（或厂家）试剂 选用筛查试剂选用筛查试剂 阴性反应阴性反应 HIV抗体筛查检测流程图抗体筛查检测流程图 19 HIV抗体确证试验 确证试验的试剂： 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有 效期内的试剂。 确证样品： 可采用血清、血浆、滤纸干血斑 确证试验方法： 免疫印迹试验 (WB)、条带免疫试验 (LIATEK HIV) 、放射免疫沉淀试验 (RIPA)及免疫荧光试验 (IFA)。 国 内常用的确证试验方法是 WB。 20 HIV抗体确证实验结果抗体确证实验结果 a 强阳性对照（ HIV-1和 HIV-2） b弱阳性对照（ HIV-1） c阴性对照 d典型的 HIV-2血清阳性反应 a b c d gp160 gp120 p66 p55 p51 gp41 p39 p31 P24 p17 血清对照血清对照 HIV-2特异带特异带 21 初筛检测阳性标本 两种筛查试剂 报告阴性 阴性反应一阴一 阳阳性反应 确证试剂 复检试验 根据具体情况进一步 检测 HIV-2 报告阴性 出现 HIV-2指示条 带阴性反应不确定反应 报告 HIV-1 阳性 HIV-1 阳性反应 结合流行病学资料，可以在 4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应， 则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展， 但不满足阳性标准，应继续随访到 8周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告 阴性；满足 HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况 决定是否继续随访。 HIV抗体 确证检测流程图 22 产 时 艾 滋 病 抗 体 检 测 及 服 务 流 程 23 实验室需备有： n 1 2种 HIV-1/2抗体 ELISA（化学发光） 试剂 n 2种 HIV-1/2抗体快速试剂 百度 “HIV抗体试剂临床评估 ” 24 HIV抗体 n 母亲 HIV 抗体经胎盘进入胎儿，出生时新生儿 和婴儿早期抗体阳性，不一定是感染 n 出生时母亲的抗体， 8090% 在生后 912 个月 消失，出生后 18 个月基本上全部消失 n 18 个月后儿童 HIV抗体仍然阳性，视为自身感 染产生的抗体 18个月以下婴幼儿的 HIV诊断 25 婴幼儿 HIV感染的抗体检测 适用于： n HIV感染产妇所生婴幼儿； n 母亲 HIV感染状态不详，儿童出现 HIV相关临床表现， 临床怀疑 HIV感染的儿童。 n 婴儿 12个月 时进行 HIV抗体检测 阴性排除感染 ，纳入正常儿童保健； 阳性者继续追踪随访 ，至 18个月再次进行 HIV抗体检 测，结果阴性排除感染。 26 艾滋病病毒感染产妇所生儿童 阳阴 用另一种不同原理或不同厂家 生产的筛查试剂再次检测 12个月进行 HIV抗体筛查试验 确证试验 18个月时再进行 HIV抗体筛查试验 报告 HIV抗体检测结果阴性 艾滋病感染产妇所生儿童 HIV抗体检测流程 阳性阴性 阴性 阳性 用另一种不同原理或不同厂 家生产的筛查试剂再次检测 阴性 阴性 阳性 报告 HIV抗体检测结果阳性 提供咨询，继续随访， 4周后再次 进行确证试验 不确定阳性 27 18个月以下婴幼儿的 HIV诊断 核酸检测 HIV 前病毒 DNA（ HIV DNA） n 检测已整合到外周血液中血细胞基因组上的 HIV DNA n 基于 PCR 技术 n 高特异度 (98%)和高灵敏度 (99%) 28 18个月以下婴幼儿的 HIV诊断 HIV 病毒载量 （ HIV RNA） n用来监测已知的 HIV 感染病人的病毒载量试 验 ； n真阳性的结果通常 100,000 拷贝 /毫升 , 而 假阳性结果 350/mm3的艾滋病感染孕产妇，采用预 防性抗病毒用药方案； n 对于 CD4+T淋巴细胞计数 350/mm3的艾滋 病感染孕产妇，采用治疗性抗病毒用药方 案。 58 常规 CD4+T淋巴细胞检测的方法和程序 流式细胞仪检测方法 双平台方法 单平台方法 样品： EDTA、枸橼酸（ ACD）或肝素抗凝全血 运送条件： n 室温（ 18 25 ）保存和运输样品 n 避免极端温度（结冰或大于 37 ） n 高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将其置 于有冰袋和吸热物质的容器中。 59 常规 CD4+T淋巴细胞检测的方法和程序 n 48小时内 染色，染色后 6小时内分析； n 如采血后 24小时内染色，可在染色后 24小时内分 析； n 利用 CD45单克隆抗体设淋巴细胞门，可检测放置 72小时 的样品； n 在血球分析仪生产商允许的样品采集时间范围内 检测。 60 FACSCalibur流式细胞仪 61 二、梅毒检测技术 n 显微镜检查法 n 血清学检查法 梅毒特异性抗原血清学检测 梅毒非特异性抗原血清学检测 62 各期梅毒的取材部位和检查方法 临床表现 取材部位 检查方法 一期梅毒 溃疡、淋巴结 暗视野检查 血液 血清学检查 二期梅毒 皮损、淋巴结 暗视野检查 血液 血清学检查 三期梅毒 血液、脑脊液 血清学检查 隐性梅毒 血液 血清学检查 胎传梅毒 皮损、胎盘 暗视野检查 血液 血清学检查 63 （一 )、显微镜检查法 n 1.暗视野显微镜检查 n 2.直接免疫荧光试验（ DFA） n 3.渡银染色检查 64 1.暗视野显微镜检查 n 暗视野显微镜下，典型的梅毒螺旋体呈白色发 光 , 其螺旋较密而均匀 。运动规律，运动性较 强，其运动方式包括 旋转式，围绕其长轴旋 转； 蛇行式 , 全身弯曲如蛇行； 伸缩其螺 旋间距离而移动。观察其运动形式有助于与其 他螺旋体相鉴别。 n 未检出螺旋体不能排除梅毒的诊断 ，阴性结果 可能说明： 螺旋体数量不足 (单次暗视野显 微镜检查阳性率小于 50%)。 患者已接受抗生 素或杀灭梅毒螺旋体的药物治疗。 损害接近 自然消退。 损害不是梅毒。 65 2.直接免疫荧光试验（ DFA) n 在荧光显微镜下可见到 发苹果绿色 的梅毒 螺旋体。 n 临床意义与暗视野显微镜检测相同。 n DFA的特异性及敏感性均大于暗视野显微镜 检测。 66 3.梅毒螺旋体渡银染色检查 n 梅毒螺旋体具有亲银性，显微镜下可见到 染成棕色的梅毒螺旋体。临床意义基本同 暗视野显微镜检查法。 67 (二 )、血清学检查法 n 血清学检查是辅助诊断梅毒的重要手段。 n 当人体感染梅毒螺旋体后 4 10周左右，血清中 可产生一定数量的抗类脂质抗原的非特异性反应 素（主要是 IgM、 IgG）和抗梅毒螺旋体抗原的特 异性抗体（主要是 IgM、 IgG）。这些抗体均可用 免疫学方法进行检测。 68 梅毒血清学检测方法 69 1.非梅毒螺旋体抗原血清试验 n 1.1 性病研究实验室试验（ Venereal Disease Research Laboratory test， VDRL） n 1.2 快速血浆反应素环状卡片试验（ Rapid plasma reagin circle card test， RPR） n 1.3 甲苯胺红试验（ Toluidine red unheated serum test， TRUST） 方法 简便、快速，敏感性和特异性较好 。对一期梅毒的 敏感性为 74 87，二期梅毒达 100，三期梅毒 34 94。特异性 96 99。 70 非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义 n 适用于各期梅毒的诊断 。早期梅毒经治疗后血 清滴度可下降或转阴，故可用于疗效观察、判 愈、判定复发或再感染。 也适用于人群的筛查 、产前检查及健康体检等 。 n VDRL试验适用于神经梅毒的脑脊液检查 , 特异 性高，但敏感性低。 n 可在某些传染病及胶原病时出现假阳性反应， 因此对 阳性反应应结合临床进行鉴别 ，或 做梅 毒螺旋体抗原血清试验以进一步证实 之。 71 2.梅毒螺旋体抗原血清试验 n 采用梅毒螺旋体作抗原，为特异性抗原，检测 血清中抗梅毒螺旋体 IgG或 IgM抗体。 n 敏感性和特异性均较高。一期梅毒的敏感性为 70 100，二期梅毒达 100，三期梅毒 95 98，特异性 94 100。 72 梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（ TPPA） 原理 TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒，此致敏颗 粒与人血清中的 抗梅毒螺旋体抗体 结合，产生可 见的凝集反应。明胶颗粒为玫瑰红色，便于肉眼 观察结果。 73 梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（ TP-ELISA） 原理 n 用经纯化及超声裂解处理的梅毒螺旋体为抗原 包被固相板条 n 加入待检血清和辣根过氧化酶标记的抗人 IgG抗 体，利用酶免疫法检测患者血清中的 抗梅毒螺 旋体特异性抗体 。 n 采用特异的梅毒螺旋体重组蛋白作为抗原，使 试验更加敏感、特异。 74 梅毒 IgM抗体血清学试验 n 梅毒特异性 IgM抗体是梅毒感染最早期产生的 抗体。 n IgM分子量较大不能通过胎盘屏障。因此在新 生儿血中检测到 IgM抗体表明有先天感染。 n 如在患者的脑脊液检测到 IgM抗体表明有活动 性神经梅毒。 n 血液中或脑脊液中出现抗梅毒 IgM抗体均表示 需要治疗。 75 梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义 n 梅毒螺旋体抗原血清试验 多用作证实试验 ，特别 是隐性梅毒及一些非螺旋体抗原血清试验阴性而 又怀疑为梅毒的患者。但 不能用于观察疗效、判 断复发及再感染。 n 梅毒螺旋体抗原血清试验偶可出现生物学假阳性 反应。 76 梅毒血清学试验的合理应用 非梅毒螺旋体试验阳性可能表示： 现症感染、接 受或未接受过治疗的近期感染、生物学假阳性 结果。 在一般人群中的假阳性率是 1-3%。大部 分假阳性血清抗体滴度 1:4，但低滴度不能排 除梅毒，可出现在潜伏或晚期梅毒病人中。 梅毒螺旋体试验阳性可表示： 现症感染、接受或 未接受过治疗的近期感染、既