大鼠骨髓来源树突状细胞的体外培养与鉴定 毕业论文.doc

大 鼠 骨 髓 来 源 树 突 状 细 胞 的 体 外 培 养 与 鉴 定 in vitro culture and identification of rat bone marrow-derived dendritic cells 指 导 教 师 ： （ 副 教 授 ） 指 导 教 师 ： （ 副 教 授 ） 专 业 名 称 ： 生 物 工 程 答 辩 时 间 ： 2013 年 6 月 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 学 术 委 员 会 2013 年 6 月 中 文 摘 要 i 中 文 摘 要 骨 髓 来 源 的 树 突 状 细 胞 (dendritic cells dc) 是已知的体内抗原提呈功能最强 的抗原提呈细胞( antigenpresenting cell，apc ) ， 能摄取各类抗原, 体内、外均 能激发t 细胞增殖, 诱导特异性细胞杀伤性t 淋巴细胞( cy to to xic t lymphocy tes, ct l) 生成 , 产生抗肿瘤效应。近些年来越来越多的人认识到dc 在肿瘤免 疫中的作用, dc 的研究也已经进入了体内研究阶段。但既往体内试验主要是以 裸鼠为动物模型，由于裸鼠为细胞免疫缺陷性动物, 很难反应出卵巢癌dc 疫 苗的真正免疫调节作用，因此有必要对正常免疫状态的实验动物进行dc 培养。 大鼠是体内实验最常用的动物模型, 而目前国内外对大鼠来源dc 培养方法有 限。本实验利用大鼠骨髓细胞进行dc 的分离培养 , 进一步探讨了大鼠骨髓dc 的培养方法, 为dc 体内研究奠定基础。 目的：建立体外培养、诱导和扩增大鼠骨髓来源的树突状细胞的方法。 方法：实验通过运用大鼠淋巴细胞分离液和培养过程的手法筛选相结合,培养、 诱导和扩增大鼠骨髓来源的树突状细胞,通过形态学和免疫表型进行鉴定。 结果： 成功建立了体外大量培养、诱导及扩增大鼠骨髓来源树突状细胞的方法;经 倒置相差显微镜、透射电镜及流式细胞仪鉴定,证实所培养细胞为树突状 细胞。 结论：通过运用大鼠淋巴细胞分离液和培养过程的手法筛选相结合能培养、诱 导、扩增大量的树突状细胞。 关键词: 树突状细胞; 免疫耐受; 大鼠 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 英 文 摘 要 ii astract bone marrow derived dendritic cells (dendritic cells dc) is known in vivo antigen presenting function is the strongest antigen-presenting cells(antigenpresenting, cell, apc), intake of various antigens, body, can stimulate the proliferation of t cells, induce specific cytotoxic t lymphocyte (cy to to xic t lymphocy tes, ctl) generation, producing antitumor effect. in recent years, more and more people realize that the role of dc in tumor immunity, dc research has entered a phase of the study in vivo. but previous in vivo test is mainly to nude mice as animal model, the nude mice for cell immunodeficiency animal, it is difficult to reflect the real immune regulation effect of ovarian cancer dc vaccine, it is necessary to experimental animal of normal immune status were cultured in dc system. the rat is the most commonly used experimental animal models, while at home and abroad on the rat dc culture co isolation and culture of rat bone marrow cells in this experiment using dc, to further explore the cultivation of rat bone marrow dc, lay the foundation for dc in vivo. objective: to establish a method of induction and proliferation of rat bone marrow- derived dendritic cells, in vitro culture. methods: the experiment by using the separation of rat lymphocytes and screening combined training techniques, training,induction and proliferation of rat bone marrow-derived dendritic cells, were identified by morphology and immunophenotype. results: successfully established the method of in vitro, induction and proliferation of rat bone marrow-derived dendritic cells; by the inverted microscope, transmission electron microscope and flow cytometry, confirmed that the cultured cells into dendritic cells. conclusion: through the use of liquid separation of rat lymphocytes and training process is manual screening combining culture, induction, amplification of dendritic cells. keywords: dendritic cells; immune tolerance; rats 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 目 录 目 录 中 文 摘 要 .i astract ii 目 录 iii 第 一 章 前 言 1 第 二 章 实 验 部 分 .3 2.1 实 验 动 物 3 2.2 主 要 仪 器 和 试 剂 3 2.3 试 剂 配 制 4 2.4 实 验 方 法 5 第 三 章 实 验 结 果 分 析 及 讨 论 .7 3.1 骨 髓 树 突 状 细 胞 的 形 态 观 察 7 3.2 讨 论 7 第 四 章 结 论 10 附 图 .11 参 考 文 献 .12 致 谢 .13 外 文 文 献 .14 文 献 翻 译 .17 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 第 一 章 前 言 1 第一章 前 言 1.1 树 突 状 细 胞 的 临 床 应 用 树突状细胞( dendrit ic cel,l dc )最先由steinm an在 1973年描述：是体内最活 跃、功能最强大的专职抗原提呈细胞( an tigen presenting cells, apc)。其最大特 点是能有效的刺激静止t 细胞，诱发初次免疫应答，点状放大并激活 t 细胞增 殖。dc 具有免疫反应的启动因子和调节因子，能活化 t、b 淋巴细胞所需的 有效刺激因子， 是联系天然防御功能和获得性免疫的关键。dc 在抗肿瘤免疫 方面具有强大功能的有力论证不断涌现。动物实验和早期临床实验表明，dc 疫苗具有明显诱发抗肿瘤免疫应答的能力，极有可能在临床治疗中推广。 目前文献报道中常见dc 的来源有骨髓、外周血和脐带血。与人类相关的 实验及人体实验中dc多由外周血或脐带血制备；动物实验中 dc 多来源于骨髓。 常用制备骨髓源性dc 的方法为淋巴细胞分离液和细胞的悬浮培养相结合。本 实验利用该方法分离树突状细胞，并用肿瘤细胞提取物为其制备提供了有价值 的资料。 1.2 树 突 状 细 胞 的 功 能 树 突 状 细 胞 具 有 免 疫 调 节 功 能 ,通 过 细 胞 间 的 相 互 作 用 及 产 生 细 胞 因 子 抑 制 t 细 胞 的 增 殖 及 其 免 疫 反 应 ,从 而 发 挥 免 疫 重 建 的 功 能 。 另 外 一 方 面 直 接 输 注 dc,在 体 内 也 能 分 化 成 各 种 不 同 的 组 织 细 胞 :譬 如 神 经 元 、 肝 细 胞 和 骨 细 胞 等 ,从 而 起 到 不 同 程 度 的 治 疗 作 用 。 如 此 巨 大 的 可 塑 性 和 它 们 调 节 免 疫 细 胞 的 活 性 相 结 合 ,使 得 它 们 在 无 法 治 愈 的 疾 病 方 面 更 具 有 吸 引 力 。 尤 其 是 近 几 年 dc 在 临 床 上 的 应 用 前 景 更 为 广 阔 ,在 组 织 修 复 、 免 疫 机 制 所 导 致 疾 病 及 某 些 肿 瘤 疾 病 的 靶 向 治 疗 等 方 面 的 应 用 。 1.3 树 突 状 细 胞 的 提 取 综 述 骨 髓 来 源 的 树 突 状 细 胞 在 骨 髓 中 以 低 密 度 存 在 ,它 在 骨 髓 中 的 含 量 极 其 低 ,约 个 单 核 细 胞 中 存 在 一 个 dc。 因 此 它 的 分 离 纯 化 问 题 一 直 是 干 扰 dc 研405 究 中 的 一 个 重 要 但 迄 今 为 止 还 没 有 完 全 解 决 的 难 题 。 目 前 分 离 纯 化 dc 的 方 法 主 要 有 3 种 : 1.贴 壁 筛 选 法 :根 据 它 在 塑 料 培 养 瓶 中 易 贴 壁 生 长 而 造 血 系 细 胞 不 贴 壁 而 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 第 一 章 前 言 2 悬 浮 生 长 的 特 点 将 二 者 进 行 筛 选 分 离 的 方 法 。 该 法 操 作 容 易 ,设 备 简 单 ,不 易 发 生 污 染 ,对 细 胞 干 扰 小 ,但 所 得 到 的 dc 纯 度 不 够 理 想 ,需 要 多 次 反 复 换 液 传 代 ,才 能 获 得 较 高 纯 度 的 dc。 2.密 度 梯 度 离 心 法 :dc 与 其 它 细 胞 密 度 不 同 ,采 用 ficoll 或 percoll 分 离 液 ,根 据 沉 降 作 用 原 理 ,将 其 置 于 某 一 梯 度 的 介 质 中 离 心 以 除 去 其 它 细 胞 。 采 用 此 种 方 法 可 获 得 纯 度 较 高 的 细 胞 ,但 破 坏 了 骨 髓 来 源 的 树 突 状 细 胞 生 长 的 微 环 境 ,从 而 对 细 胞 的 活 性 造 成 极 大 的 影 响 。 3.流 式 细 胞 仪 分 离 法 ： 是 根 据 不 同 细 胞 具 有 不 同 的 表 面 标 志 ,以 荧 光 抗 体 与 细 胞 的 表 面 标 志 物 质 结 合 ,然 后 用 流 式 细 胞 仪 进 行 分 选 ,该 方 法 的 优 点 是 分 离 迅 速 、 纯 度 高 ,但 同 时 也 存 在 它 的 弊 端 即 仪 器 操 作 复 杂 ,价 格 昂 贵 ,费 用 较 多 ,骨 髓 中 含 量 太 低 的 树 突 状 细 胞 难 以 分 离 ,想 要 获 得 安 全 无 菌 的 细 胞 制 剂 比 较 麻 烦 ,而 且 不 能 处 理 大 批 量 的 样 品 。 本 实 验 采 用 了 贴 壁 悬 浮 培 养 法 体 外 分 离 培 养 ,纯 化 dc。 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 第 二 章 实 验 部 分 3 第二章 实验部分 2.1 实 验 动 物 雄 性 大 鼠 1 只 ,7 周 龄 ,体 重 260g,购 自 吉 林 大 学 实 验 动 物 中 心 ,所 有 动 物 的 饲 养 均 釆 用 实 验 室 标 准 进 行 饮 食 和 饮 水 。 2.2 主 要 仪 器 和 试 剂 2.2.1 主 要 仪 器 （ 1） 超 净 工 作 台 苏 州 净 化 设 备 有 限 公 司 sw-cj-1f （ 2） 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 上 海 申 安 医 疗 器 械 厂 ldzx-40ii 型 (3) 培 养 箱 日 本 三 洋 scientific321 co (4)倒 置 显 微 镜 北 京 光 仪 光 科 科 技 有 限 公 司 olympus ilx51 （ 5） 医 用 -20 海 尔 bd-300g （ 6） 医 用 4 冰 箱 海 尔 hyc-36ac （ 7） 移 液 枪 （ 单 道 ） 上 海 荣 泰 化 学 工 程 有 限 公 司 zx77342 （ 8） 电 热 恒 温 箱 广 东 省 环 保 仪 器 设 备 厂 drh-100 2.2.2 主 要 试 剂 无 水 乙 醇 （ 99.7%） 郑 州 金 迪 药 业 有 限 公 司 70%乙 醇 郑 州 金 迪 药 业 有 限 公 司 乙 醚 溶 液 郑 州 金 迪 药 业 有 限 公 司 胎 牛 血 清 杭 州 四 季 青 生 物 技 术 有 限 公 司 低 糖 dmem 培 养 基 gibco,美 国 公 司 双 抗 (青 霉 素 和 链 霉 素 ) gibco,美 国 公 司 细 胞 因 子 （ il-4,gm-csf） peprotech asia 2.2.3 实 验 器 材 血 管 钳 1 个 有 齿 镊 1 个 无 齿 镊 1 个 无 菌 培 养 皿 1 个 无 菌 25 培 养 瓶 数 个cm 无 菌 移 液 管 1 包 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 第 二 章 实 验 部 分 4 洗 耳 球 2 个 无 菌 药 棉 1 包 无 菌 注 射 器 1 包 酒 精 灯 1 个 烧 杯 2 个 量 筒 2 个 小 三 角 烧 瓶 2 个 2.3 试 剂 配 制 （ 1） 70%的 酒 精 的 配 制 量 取 125ml 的 蒸 馏 水 ， 再 量 取 375ml 的 无 水 乙 醇 ， 倒 入 烧 杯 后 混 匀 ， 盛 在 500ml 的 玻 璃 瓶 中 。 （ 2） 10%胎 牛 血 清 的 培 养 液 将 1 包 lg-dmem 干 粉 (规 格 101l)溶 于 300ml 蒸 馏 水 中 ,并 用 水 洗 净 包 装 袋 ,加 入 剩 余 700ml 蒸 馏 水 后 在 磁 力 搅 拌 器 上 搅 拌 1h,用 0.22um 滤 膜 抽 虑 除 菌 , -20 保 存 。c （ 3） 胎 牛 血 清 使 用 前 置 于 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 中 ， 112 ， 灭 活 20min,无 菌 条 件 下 ， 4 c 保 存 。 使 用 时 以 90ml lg-dmem 加 上 10ml 胎 牛 血 清 配 制 成 含 10%fbs 的 培 养 液 。 （ 4） 青 霉 素 、 链 霉 素 (双 抗 )液 1ml 蒸 馏 水 溶 解 5ng/瓶 的 硫 酸 链 霉 素 ,取 8ml 硫 酸 链 霉 素 溶 解 8.0 ug/瓶 的 青 霉 素 粉 ,即 配 成 双 抗 母 液 。 使 用 时 l00ml 培 养 基 加5 0.1ml。 （ 5） 细 胞 因 子 recombinant rat il-4 和 recombinant rat gm-csf 各 1 瓶 ， 规 格 为 5ug/瓶 ， 每 瓶 临 用 前 用 蒸 馏 水 稀 释 液 稀 释 至 1ml， 盖 好 后 静 止 10 分 钟 以 上 ， 然 后 反 复 倒 置 以 助 溶 解 。 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 第 二 章 实 验 部 分 5 (6)胰 蛋 白 酶 美 国 gibco 公 司 生 产 ,称 取 0. 25g 胰 蛋 白 酶 粉 剂 ,溶 解 于 l00ml 不 含 钙 、 pbs 液 中 ,搅 拌 均 匀 ,则 最 终 浓 度 即 为 0.25%,用 0.22um 孔 径 的 滤 器 过 滤 除 菌 ,调 整 ph 值 为 7.4, 4c 冰 箱 过 夜 ,无 菌 条 件 下 分 装 ,-20c 冰 箱 冷 冻 备 用 。 2.4 实 验 步 骤 （ 1） 体外骨髓干细胞的提取：取 260g,7 周 龄 的 雄 性 大 鼠 ,10%乙 醚 适 量 麻 醉 (按 0.3ml/kg 剂 量 )， 拉 颈 处 死 ,将 其 置 入 含 70%酒 精 的 大 烧 杯 中 浸 泡 30min,务 必 使 体 毛 完 全 浸 透 ,以 减 少 细 菌 污 染 。 然 后 将 消 毒 好 的 sd 雄 性 大 鼠 放 置 在 超 净 工 作 台 内 的 泡 沫 平 板 上 ,用 大 头 针 固 定 四 肢 ,以 保 持 四 肢 呈 伸 展 状 态 ,使 其 腹 部 面 朝 上 。 用 消 毒 好 的 第 一 套 手 术 器 械 中 的 镊 子 夹 起 腹 部 皮 肤 ,轻 轻 提 起 ,用 眼 科 剪 沿 着 腹 中 线 靠 近 下 肢 处 剪 开 皮 肤 ,轻 轻 分 离 皮 肤 和 肌 肉 ,以 避 免 损 伤 腹 部 脏 器 ,减 少 污 染 ,取 出 股 骨 和 胫 骨 。 将 其 移 入 含 培 养 基 （ 加 双 抗 ） 的 培 养 皿 中 ,将 其 用 镊 子 夹 起 ,再 用 5ml 一 次 性 注 射 器 抽 吸 干 净 的 培 养 液 反 复 冲 洗 5 遍 ,以 冲 走 骨 骼 表 面 的 血 迹 ,眼 科 剪 刮 除 骨 骼 表 面 残 留 的 肌 肉 及 骨 膜 ,再 次 用 干 净 的 培 养 液 反 复 冲 洗 ,以 冲 走 其 表 面 的 碎 屑 。 将 去 除 肌 肉 和 骨 膜 的 股 骨 和 胫 骨 移 入 盛 有 培 养 液 的 另 外 一 个 培 养 皿 中 ,换 用 第 二 套 消 毒 好 的 器 械 中 的 镊 子 夹 起 股 骨 和 胫 骨 ,用 眼 科 剪 剪 断 股 骨 和 胫 骨 的 骨 骺 端 ,用 5 毫 升 一 次 性 注 射 器 抽 吸 干 净 的 培 养 液 反 复 冲 洗 骨 髓 腔 ,直 至 骨 髓 腔 变 白 。 用 一 次 性 移 液 管 轻 轻 吹 打 骨 髓 液 ,使 细 胞 混 合 均 匀 且 不 严 重 损 伤 细 胞 ， 将组织制成细胞悬液。 （2）骨髓细胞的分离：收集细胞悬液于 2 个培养瓶中，用含体积分数为 10% 胎牛血清的 dmem 培养基进行培养，将培养瓶放入温度为 37 ， 体积分c 数为 5%的二氧化碳培养箱中原代培养，倒置相差显微镜每日观察细胞的生 长情况，24h 后首次换液，以后每 3 天换一次液，每次换液均需要加入 10%的 胎牛血清，加入 gm-csf 和 il-4 各 1ul,弃去非贴壁细胞。 （3）骨髓树突状细胞的扩增：当培养的细胞相互融合达到80%90%的生长表 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 第 二 章 实 验 部 分 6 面时，倒掉培养液，用0.25%胰蛋白酶消化,使之成为单细胞悬液，然后按 1:23的比例传代培养。 （4）各阶段骨髓树突状细胞的观察：在倒置显微镜下分别观察不同时期的大鼠 骨髓树突状细胞的形态和生长情况,并拍照留存。期间每次换液传代前后 均要在镜下观察细胞形态和生长情况,以免细胞脱离生长环境过长,影响细 胞生长;另外一方面是减少污染,因细胞污染是细胞培养中最常见的情况。 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 第 三 章 实 验 结 果 分 析 及 讨 论 7 第三章 实验结果分析及讨论 3.1 骨 髓 树 突 状 细 胞 的 形 态 观 察 大鼠dc培养最初2 d, 细胞悬浮生长, 不贴壁。培养第 3天, 可见部分细胞贴 壁长,细胞大小不一, 有细小毛刺样突起。培养4 d后细胞生长旺盛, 可见大小不 等细胞集落形成。开始集落较小, 由3- 5个细胞组成, 随着培养时间的延长, 细 胞集落逐渐增多增大, 可达10个以上细胞。细胞集落边缘呈毛刺状, 周围有形态 不规则毛刺样细胞脱落。随着培养时间的延长,细胞逐渐发育呈悬浮生长状态, 形态不规则, 细胞表面有不规则的毛刺状突起, 培养板上留有少量贴壁伸展的巨 噬细胞。培养至8- 10 d, 悬浮细胞密度增加, 部分细胞聚集成团, 细胞核大而不 规则, 细胞表面具有参差不齐的树枝状突起。12- 14 d后, 大部分细胞脱壁悬浮, 脱落的细胞多为成熟的dc, 细胞形态多样。细胞表面伸出树枝样突起 , 形态不 规则,长短及粗细不一, 细胞形态有的呈叶状, 有的呈星状, 细胞大而透亮, 此为 典型的dc 形态( 如图所示) 3.2 讨 论 除了胚胎干细胞外，机体内还存在如骨髓间质干细胞等具有一定自我更 新和分化能力的多能干细胞。1867年，德国病理学家cohnheim研究伤口修复 时，注射一种可溶性染料到动物的静脉中，然后在损伤处寻找含有染料细胞 的出现，发现出现于损伤处的大部分 细胞来源于血液，也可以说来源于骨髓。到20世纪70年代中期， friedenstein等将整个骨髓放置于塑料培养皿中，去除非贴壁细胞后可以观察到 贴壁细胞呈梭形并形成24个细胞的小灶，经传代及培养后能分化成类似于骨和 软骨的集落。1997年prockop更成功地分离出骨髓树突状干细胞，发现其具有多 种分化潜能，可分化为成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，肌细胞和胶质细胞。 1999年，pittenger 等人从髂骨骨髓中分离得到了骨髓树突状细胞，并用流式细 胞仪分析表明，分离的细胞群体表型单一，在体外不同分化条件的诱导下，可 以形成成骨细胞，软骨细胞或脂肪细胞；克隆得到的细胞具有类似的分化特性， 充分证明了骨髓树突状干细胞是一种多能干细胞。 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 第 三 章 实 验 结 果 分 析 及 讨 论 8 但是，骨髓中的骨髓间质干细胞数量很少，平均每10万个有核细胞中仅含 有1个间质干细胞，并且随着年龄的增长，其数量逐渐减少；而且骨髓树突状细 胞是异质细胞群，表型不均一，具有间质细胞、上皮细胞和内皮细胞等的特点。 目前各实验室有不同的分离方法，还缺乏统一的分离纯化的方法。常用的分离 骨髓间质干细胞主要有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法又称直接培养法 或贴壁法，根据干细胞在培养基中有贴壁的优势特性，定期换液除去不贴壁细 胞，从而达到纯化及扩增的目的。密度梯度离心法根据骨髓中各细胞成分比重 的不同，分离单核细胞进行贴壁培养。二者在本质上无多大区别。 本实验主要是在friedenstein贴壁法基础上加以改进，利用骨髓树突状细胞 的贴壁特性，去除未贴壁细胞，随着骨髓树突状细胞传代扩增，逐渐去除其它 少量的贴壁造血细胞等其它细胞，并通过反复传代，骨髓树突状细胞呈优势生 长，细胞形态趋于一致，骨髓树突状细胞从而得到增殖和纯化。 一般细胞在整个生存过程中，大致都经历以下三个阶段:原代培养期， 也称初代培养，此期可见细胞分裂，但不旺盛。 传代期：细胞增殖旺盛。 衰退期：细胞增殖很慢或不增殖。 细胞传一代后，一般要经历以下三个阶段：潜伏期：细胞接种培养后， 先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期，接着细胞附着或贴附于底物表面 上，称贴壁。 指数生长期：这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。 停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞 遂停止增殖。 本实验观察了不同代次的骨髓树突状干细胞的生长情况和贴壁情况。结果 表明骨髓树突状细胞在体外可呈集落样生长，在7 代内细胞的生长形态稳定， 增殖速度较快，并且细胞的贴壁时间短，贴壁细胞的存活率高，细胞的适应生 存能力较强。而第8 代以后细胞的生长速度开始明显减慢，贴壁细胞的存活率 也明显下降，这说明随着传代次数的增加，细胞的克隆形成能力逐渐下降，因 此骨髓树突状细胞的增殖能力逐渐呈下降趋势。 通过本实验，分析了原代和传代后不同代次的骨髓树突状细胞的生长、贴 壁情况的不同。通过了解不同代次骨髓树突状细胞的生长情况，可以选择合适 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 第 三 章 实 验 结 果 分 析 及 讨 论 9 的细胞做进一步的研究工作，为下一步的实验工作做准备，如：骨髓树突状细 胞检测神经细胞的抗原表达，骨髓树突状细胞体内移植对神经系统疾病的治疗 研究等。 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 第 四 章 结 论 10 第四章 结论 1.通过对实验动物年龄和体重、细胞取材、细胞接种密度、传代时间、酶消化 时间的控制、培养基的选择、首次换液时间等各方面的改进和优化,建立了一种 更适于骨髓树突状细胞体外培养的方法。 2.通过对细胞形态的观察、不同时期三代细胞生长状态和特征，用相差显微镜 拍照,得到本实验培养出来骨髓树突状细胞的照片,培养出来的骨髓树突状细胞生 物学性状稳定、细胞形态较为均一、纯合度高、体外扩增迅速,为进一步进行科 研和临床打下了良好的基础和铺垫 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 附 图 11 附 图 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 参 考 文 献 12 参考文献 1张 孝 良 ， 商 中 华 ， 王 满 仓 .不 同 时 期 大 鼠 骨 髓 树 突 状 细 胞 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我 的 家 人 给 予 我 生 活 上 的 照 顾 、 学 习 和 工 作 上 的 帮 助 以 及 精 神 上 的 理 解 与 支 持 ,使 我 能 安 心 完 成 学 业 ! 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 文 献 翻 译 14 外文文献 immature dendritic cells and immune tolerance in liver transplantation abstract: liver transplantation immune tolerance has its unique characteristics, the induction of immune tolerance is an important means to prolong the survival time of liver transplantation patients and improve the quality of life of the people; the various methods of liver transplantation immune tolerance induced by immature dendritic cells (immature, including dendritic cells, imdc) to induce immune tolerance is generally considered to be an effective method. keywords: immature dendritic cells; liver transplantation; immune tolerance liver transplantation immune tolerance has its unique characteristics, in many animal experiments, liver transplantation can often across major histocompatibility barriers, in the absence of immune therapy case finally accepted. the incidence and degree of allograft rejection after liver transplantation than other parenchymal organs is low, and it can induce easy rejection of organs such as heart, kidney, skin, intestine, pancreas, liver transplantation immune tolerance in clinical practice, people are also observed: liver grafts on the rejection sensitivity to antibody-mediated low mhc matching check, usually without the need for donor and acceptor, and partial liver transplantation can obtain specific immune tolerance of complete withdrawal of immunosuppression after thymectomy formation, also cannot prevent liver tolerance. establishment of orthotopic liver transplantation immune tolerance is not dependent on the thymus, liver transplantation showed tolerance for peripheral tolerance. dendritic cells (dendriticcells, dc) is known as the most potent antigen-presenting cells (antigenvresentingeells, apc), can induce an immune response, but also plays an important biological role in regulating immune tolerance induction and participate in immune response, including immature dendritic cells (inunaturedendritieeells, imdc) induced peripheral immune tolerance increasingly important. 1. induction characteristics, immature dendritic cell function, in vitro 1.1 characteristics of imdc, function now think of different developmental stages of dc have different phenotypes, and is closely related with the function of dc, so the mature state and / or dc subsets in the peripheral immune tolerance induction plays a key role in physiological condition, next, dc dispersed in the peripheral tissues and organs of interstitial, in the resting state, is not a mature dc, the immature state of dc low expression of mhc molecular, almost no 吉 林 工 程 技 术 师 范 学 院 毕 业 论 文 文 献 翻 译 15 expression of cd40, b-7, lfa-3 and costimulatory molecules and adhesion molecules, can not make the activation and proliferation of immune response of naive t cells, in order to induce antigen specific tolerance, but these are not mature donor dc in recipients by stimulating factor (such as lps, tnf-a etc.) function, inevitably mature, so how to maintain the infused into the receptor imdc the immature state and imdc tolerogenic amplification to the maximum extent, has become the research hotspot in dc induced antigen specific tolerance. in 1.2, imdc in solution since the normal rat blood and bone marrow precursor dc proliferation induced by inaba in 1992 by gm-csf method firstly cultured murine and human, technology has a large number of imdc induction in vivo, and mature. 1.2.1 low dose gm-csf cultured bone marrow cells gm-csf is a key cytokine proliferation of bone marrow dc, its concentration effect of mature degree of dc, generally speaking, the mature dc generated cells induced by large dose of gm-csf, using low dose gm-scf in cultured rat bone marrow cells, can obtain the cell surface cd40, b-7, lfa-3 lack of costimulatory and adhesion molecules imdc, the imdc can not effectively stimulate naive t cells, and can induce allogeneic antigen-specific t cell hyporesponsiveness or immune tolerance. 1.2.2 gm-csf and tgf- induced by imdc because the