采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响__食品科学工程毕业论文.doc

采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 目录 摘要.1 前言1 1 材料与方法2 1.1 材料 2 1.2 方法 2 1.2 .1 病原菌的分离、纯化和保存.2 1.2.2 孢子悬浮液的制备.2 1.2.3 硅酸钠浸泡处理果实2 1.2.4 损伤接种.3 1.2.5 取样方法.3 1.2.6 丙二醛(mda)含量测定3 1.2.7 细胞膜完整率的测定3 1.2.8 细胞膜微膜囊提取、nadph 氧化酶和 ca2+-atpase 活性的 测定.4 1.2.9 脂氧合酶（lox）活性测定.4 1.2.10 蛋白含量测定.5 1.2.11 数据统计5 2 结果与分析5 2.1 硅酸钠处理及挑战接种对果实细胞膜完整率及 mda 含量的 影响5 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 1 2.2 硅酸钠处理及挑战接种对果实细胞膜 nadph 氧化酶和 ca2+- atpase 活性的影响 .6 2.3 硅酸钠处理及挑战接种对果实脂氧合酶（lox）活性的影响 7 3 讨论7 参考文献9 致谢.10 采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量 及酶活性的影响及酶活性的影响 摘要：摘要：本文研究了 100 mm 硅酸钠采后处理和粉红单端孢 （trichothecium roseum）挑战接种对对“银帝”厚皮 甜瓜果实细胞膜部分氧化还原体系的影响。结果表明： 硅酸钠处理明显延缓了甜瓜果实细胞膜完整率的降低，处 理后第 4d 高于同期对照 20.7%；明显提高了果实细胞膜 nadph 氧化酶，挑战处理后第 10d 高于同期对照 82.4%； 延缓了脂氧合酶（lox）活性的升高，处理后第 6d 活性 低于同期对照 10.9%； 丙二醛（mda）含量有所增加，处 理后第 10d 高于同期对照 44.8%。 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 2 关键词：关键词：硅酸钠 果实 细胞膜 前言前言 甘肃省是我国厚皮甜瓜的主要产区之一，甜瓜营养丰富、 甘甜爽口、风味独特，深受大众喜爱。然而，由于其产期集中， 且正值高温季节加之缺乏必要的冷链和有效的包装，采后腐烂 颇为严重，造成厚皮甜瓜采后腐烂的主要病害包括黑斑病、白 霉病、软腐病、粉霉病等1。 果蔬采后病害发生的重要原因是受到病原物侵染时，细胞 的膜结构和特性将发生改变，从而引起代谢失调，最终导致细 胞死亡。质膜 nadph 氧化酶是一种以胞质 nadph 为电子供体， 催化胞外 o2生成超氧阴离子的氧化还原酶，通过催化产生 aos，细胞质内 ca2+增加会促进植物组织乙烯合成并加速这些 组织的衰老2-3。质膜和细胞器外膜的 ca2+-atp 酶能够把细胞 质过多的 ca2+转运到细胞外或细胞器贮藏起来。另外 lox 能催 化多元不饱和脂肪酸发生过氧化作用，lox 及其氧化物可能直 接参与了植物组织的衰老过程。 有报道表明硅可以有效降低厚皮甜瓜的采后病害4-7。但是 对其作用机理的探讨主要集中于硅酸钠处理对 pod 、pal 和 cht 活性的影响,但是对细胞膜相关物质含量(mda)及酶（nadph 氧化酶、lox 和 ca2+-atpase）活性的影响鲜有报道。本实验以 厚皮甜瓜为试验材料，研究硅酸钠处理对细胞膜相关物质含量 及酶活性的影响，探讨其降低采后病害的机理，以其为硅的进 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 3 一步扩大使用提供理论依据。 1 1 材料与方法材料与方法 1.11.1 材料材料 供试“银帝”甜瓜采自甘肃民勤县收成乡露天栽培大田中， 花后 45 天采收。单果套发泡网袋后入标准包装箱（6 个/箱） 当天运抵实验室后在常温条件下（222；rh 55-60%）贮藏 待用。 硅酸钠由天津市科密欧化学试剂开发中心生产，分析纯。 1.21.2 方法方法 1.21.2 .1.1 病原菌的分离、纯化和保存病原菌的分离、纯化和保存 参照方中达法（1998） 。采集典型粉霉病（t. roseum）发 病甜瓜果实，用70%酒精表面消毒后切取病健交界处组织，经表 面消毒后移至马铃薯葡萄糖琼脂（pda）培养基上，于25保温 培养。待菌落形成后采用稀释法进行单孢分离、纯化。纯化菌 株经回接试验确定其致病力后于斜面pda上4下保存待用。 1.2.21.2.2 孢子悬浮液的制备孢子悬浮液的制备 参照bi et al.（2006）方法。取25下培养10天的带菌 pda平皿一个，加入含0.05% tween20的无菌水约10ml，用玻璃 棒刮下平板上的病原菌孢子，然后转入50ml三角瓶中，在wyx-a 微型旋涡混合器上振荡15秒，再用双层纱布过滤，滤液用血球 计数板计数算出孢子悬浮液的浓度后，最后稀释至所需浓度， 1106 个/ml。 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 4 1.2.31.2.3 硅酸钠浸泡处理果实硅酸钠浸泡处理果实 硅酸钠诱导处理：将表面用自来水冲净并晾干的果实浸入 100 mm的硅酸钠溶液中(内含0.05%的tween80)10 min，取出晾 干后，单果套发泡网袋，入包装箱（6个/箱） ，于常温 （222；rh55%-60%）下贮藏供接种之用。以清水（内含 0.05%的tween80）处理作对照。 1.2.41.2.4 损伤接种损伤接种 参照毕阳和张维一（1993）方法并修改8。选取硅酸钠处 理后常温贮藏48h的果实，经75%酒精表面消毒后，用灭菌铁钉 （直径3mm）在果实表面等距离刺孔10个（深3mm） 。分别取 20l孢子悬浮液接入孔内。稍作晾干后入包装箱，上覆聚乙烯 塑料薄膜（厚0.01mm）保湿，室温(222；rh85%-90%)条件 下贮藏待取样用。每处理用果实12个，重复3次。 1.2.51.2.5 取样方法取样方法 参照 bi et al.（2005）方法。分别于处理后 0、2、4、6、8、10 天用直径 5mm 打孔器打取皮下 3-10mm 处果 肉组织 3g。挑战接种样品则取t. roseum接种后 2、4、6、8 天病斑以外皮下 3-10mm 处果肉组织 3g。组织用锡箔纸包好， 液氮冷冻，在-80超低温冰箱中保存待测。每个处理每次取样 用果实 6 个。 1.2.61.2.6 丙二醛丙二醛(mda)(mda)含量测定含量测定 参照 hodges et al.（1999）方法并修改。取 3 .0 g 果肉 组织，加入 3 ml 10%三氯乙酸（tca）溶液研磨成匀浆后，于 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 5 4下 12000g 离心 20 min。取 1ml 上清液，加入 2 ml 0.6%的 2-硫代巴比妥酸（tba）溶液(用 tca 配制)，混合后煮沸 15 min，冷却后再离心一次。分别测定反应液在 450 nm、532 nm 和 600 nm 处的吸光度值。按下式计算反应混合物中 mda 的浓度， 然后计算出果实样品中 mda 含量（nmolg fw-1） 。 反应液中 cmda（mol/l）=6.45（od532-od600）-0.56od450 mda 含量（nmolg fw-1）= cmda（mol/l）提取液体积 （ml）/果肉组织鲜重（g） 注：上式中 6.45、0.56 均为常数。 1.2.71.2.7 细胞膜完整率的测定细胞膜完整率的测定 参照 lester and bruton（1986）方法并修改。直径 5 mm 打孔器打取赤道部位皮下 2-8mm 组织 9 片，挑战接种样品则取 接种后 2、4、6、8 天病斑以外皮下 2-8 mm 处果肉组织（每次 用果实 3 个，每个果实取样 3 次） 。称重后，组织用无离子水充 分冲洗 3 次后，置于滤纸上吸干多余水分，放入含 40 ml 无离 子水的烧杯中，用电导仪测 3 h（25）后的电导率。然后将 烧杯及组织在 95下水浴 30 min 后测定最终的电导率。细胞 膜完整率由下式计算： 细胞膜完整率（%）=1-（3 h 后电导率/最终电导率） 100 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 6 1.2.81.2.8 细胞膜微膜囊提取、细胞膜微膜囊提取、nadphnadph 氧化酶和氧化酶和 caca2+ 2+-atpase -atpase 活性的活性的 测定测定 参照 morre et al.(2000)方法提取细胞膜微膜囊。取果肉 3g，用 3ml 提取液匀浆，然后用四层纱布过滤。滤出液 7500 g 离心 15 min，上清液 20000 g 离心 40min，保留沉淀。沉淀用 1 ml 悬浮液稀释，得到粗的细胞膜微膜囊提取液。 提取液含有：25 mmoll-1tris-mes（ph 7.8） 、0.25 moll-1蔗糖、3 mmoll-1 edta、0.9% pvp、5mmoll-1 dtt（二硫苏糖醇） 、1 mmoll-1 pmsf（苯甲基磺酰氟） ；悬浮 液含有：5 mmoll-1 tris-mes三羟甲基氨基甲烷-2-（n-吗啉） 乙磺酸缓冲液，ph 7.8、0.25 moll-1蔗糖、5 mmoll-1 kcl、1 mmoll-1 dtt、1 mmoll-1 pmsf。 nadph 氧化酶活性的测定：参照 sagi et al.( 2001)方法 并修改，采用上述细胞膜微膜囊，通过 nadph 氧化酶产生的活 性氧氧化 xtt2，3-bis（2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl）-2h-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt的 量来表示该酶活性。反应体系 2ml 包括 50 mmoll -1 tris- hcl 缓冲液（ph 7.4） ，0.5 mmoll -1 xtt，100 moll-1 nadph 和 200l 的细胞膜微膜囊，加入 nadph 启动反应，xtt 减 少量可通过 470 nm 检测。酶活性以 od470min-1g-1fw。 ca2+-atpase 活性的测定：参照李杨瑞（1987）和 robbins et al.（1999）方法，稍作修改。利用细胞膜微膜囊跟反应液 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 7 产生的磷含量来表示该酶的活性。取 400l 反应液（25 mmoll-1 tris-mes，50 mmoll -1 kcl，10 mmoll-1 cacl2，2 mmoll-1 na+-atp，ph 7.5） ，加入 40 l 0.4% triton-x-100，再加入 40 l 的微膜囊启动反应，置于 37水 浴锅中培养 30 min。反应之后加入 1ml 反应终止液，置于 37 水浴锅中培养 30 min，来终止反应，接着在紫外分光光度计上 读取 820 nm 的 od 值。终止液包括 a：0.42%的钼酸铵0.5 mol h2so4；b：10%抗坏血酸；c：0.3% sds（十二烷基磺酸钠） 。 其中 vavbvc611。酶活性以od820g-1fw 表示。实验 重复 3 次。 1.2.91.2.9 脂氧合酶（脂氧合酶（loxlox）活性测定）活性测定 参照 axelrod et al.（1981）的方法略加改进。底物 制备。底物为 10mmol /l 的亚油酸钠，即 70mg 亚油酸钠、 70l tritonx-100 和 4ml 无氧水， 混匀后用 naoh 滴定至澄 清， 定容至 25ml， 低温保存备用。粗酶液提取。取果肉 3.0g， 冰浴研磨， 加入 50mmol/l 磷酸缓冲液(ph 值 7.0) ， 4 下离心， 上清液用于酶活性测定。lox 活性测定。3ml 反应体系中含底物 25l，100mmol/l 柠檬酸-磷酸缓冲液(ph 值 6.0) 2.775ml，30 温育， 加酶液后 15 s 开始计时， 记 录 234 nm 处的吸光值变化， 酶活性以 od 234 / ( gmin) 表示。实验重复 3 次。 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 8 1.2.101.2.10 蛋白含量测定蛋白含量测定 参照 bradford(1976) 方法测定，以牛血清蛋白（bsa）为 标准蛋白作标曲，计算蛋白含量。 1.2.111.2.11 数据统计数据统计 全部试验数据用 microsoft excel 2003 进行标准偏差 (se) 计算。 2 2 结果与分析结果与分析 2.12.1 硅酸钠处理及挑战接种对果实细胞膜完整率及硅酸钠处理及挑战接种对果实细胞膜完整率及 mdamda 含量的含量的 影响影响 图 1 100mm 硅酸钠处理及t. roseum挑战对甜瓜果实细胞膜完 整率(a)和丙二醛含量(b)的影响, 图中小垂线表示标准误 （se） 。 甜瓜果实采后细胞膜完整率总体呈下降趋势，而硅酸钠处理 30 60 90 120 0246810 处理后天数（d） 细胞膜完整率(%) controlsi control+csi+c challeng challenge a 0 0.35 0.7 1.05 0246810 处理后天数(d) mda 含量 controlsi control+csi+c challenge b 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 9 延缓了果实细胞膜完整率的降低（图 1a） 。硅酸钠处理者与对 照在第 4d 细胞膜完整率差异最大，处理者高于同期对照 20.7%。t. roseum挑战接种可明显增大对照和处理者细胞膜完 整率的降低速率，但在接种后的 6d 期间硅酸钠处理者细胞膜完 整率明显高于对照。 硅酸钠处理明显增加了果实的mda含量（图1b） ，处理者mda 含量与对照的差异随着贮藏时间的延长逐渐增大，第10d达到最 大，高于同期对照44.8%。t. roseum挑战接种可进一步提高处 理者和对照的mda含量，且挑战后处理者的mda含量显著高于挑 战后的对照，两者mda含量的最大差异出现在第8d，含量高于同 期对照1.8倍。 2.22.2 硅酸钠处理及挑战接种对果实细胞膜硅酸钠处理及挑战接种对果实细胞膜 nadphnadph 氧化酶和氧化酶和 caca2+ 2+- - atpaseatpase 活性的影响活性的影响 图2 100mm硅酸钠处理及t. roseum挑战对甜瓜果实nadph氧化酶 (a)和ca2+-atpase活性(b)的影响, 图中小垂线表示标准误 （se） 。 0 0.015 0.03 0.045 0246810 处理后天数(d) nadph氧化酶 活性 controlsi control+csi+c challenge a 0 1.5 3 4.5 0246810 处理后天数(d) ca2+-atpase 活性 controlsi control+csi+c challenge b 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 10 硅酸钠处理果实细胞膜 nadph 氧化酶活性在贮藏期间逐渐 增大，第 6d 之后高于对照，而对照果实细胞膜 nadph 氧化酶活 性变化不大（图 2a） 。t. roseum挑战接种明显提高了处理者和 对照的 nadph 氧化酶活性，两者在第 8d 达到最高峰，之后逐渐 降低，而对照果实 nadph 氧化酶活性在第 10d 下降到未接种对 照水平，且挑战后处理者的 nadph 氧化酶活性明显高于挑战后 的对照，第 10d 差异达到最大，活性高于同期对照 82.4%。与 处理间相比，挑战后处理者和对照 nadph 氧化酶活性的增加分 别可至少持续 8d 和 6d。 甜瓜果实采后细胞膜 ca2+-atpase 活性总体呈下降趋势，且 硅酸钠处理果实 ca2+-atpase 活性的下降速率明显高于对照果实 （图 2b） 。但t. roseum挑战接种明显延缓了处理者 ca2+- atpase 活性的下降，且在挑战后第 4d 开始活性高于挑战后对 照，挑战后第 6d 达到未接种对照水平，而挑战后对照果实 ca2+-atpase 活性的下降速率增大。 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 11 2.32.3 硅酸钠处理及挑战接种对果实脂氧合酶（硅酸钠处理及挑战接种对果实脂氧合酶（loxlox）活性的影响）活性的影响 图3 100mm硅酸钠处理及t. roseum挑战对甜瓜果实脂氧化酶的 影响, 图中小垂线表示标准误（se） 。 甜瓜果实采后细胞膜 lox 酶活性总体呈上升趋势，且硅酸 钠处理果实 lox 酶活性的上升速率明显低于对照果实（图 3） 。 但t. roseum挑战接种后甜瓜果实 lox 酶活性明显高于未挑战 对照，且在挑战后第 4d 开始活性高于挑战后对照，第 6d 挑战 后处理者与对照差异达到最大，活性低于同期对照 10.9%，之 后 lox 酶活性上升趋势减缓。 3 3 讨论讨论 mda 是细胞质膜和生物膜系统中脂质过氧化的主要产物，对 病原菌具有直接毒性。本实验发现，硅酸钠处理甜瓜果实后果实 组织中 mda 迅速积累，这表明脂质过氧化也参与了硅酸钠诱导果 80 100 120 140 160 180 0246810 处理后天数（d） lox 活性 controlsi control+csi+c challenge 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 12 实产生的抗病性。果实细胞膜完整率的降低速率在硅酸钠处理 及t. roseum接种后明显抑制，细胞膜完整率的降低是病害发生 中的常见现象，但是硅酸钠处理有效抑制了挑战后细胞膜完整率 的降低速率，表明硅酸钠在胁迫下启动了细胞的各种保护机制， 在一定程度上维持了果实细胞膜的完整性。 本研究还发现，硅酸钠处理经挑战接种诱导了甜瓜果实细 胞膜nadph氧化酶活性的升高，而且也诱导了ca2+-atpase活性的 升高，说明在病原物胁迫下硅酸钠处理可能通过nadph氧化酶催 化形成的活性氧而激活钙信号，启动应答反应机制，提高果实 抗病性，同时ca2+-atpase可以维持细胞质内ca2+稳态，抑制了 果实组织衰老。另外lox能催化多元不饱和脂肪酸发生过氧化作 用，lox 及其氧化物可能直接参与了植物组织的衰老过程9。 此外gbel（2001）报道lox可能在伤害及病虫害防御中扮演着 重要的角色，它本身可能是通过其作用的产物如茉莉酸的信号 作用， 使植物体构建起防御体系10。硅酸钠处理经挑战接种 抑制了甜瓜果实细胞膜lox酶活性的升高，说明硅酸钠处理通过 对lox酶活性的抑制来提高果实的抗病性。 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 13 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 14 参考文献参考文献 1 毕阳, 王春玲. 白兰瓜贮藏期的病害j. 中国果品研究. 1987, 1: 22-24. 2 郝福顺, 陈珈. 植物细胞膜 nadph 氧化酶的研究进展j. 植 物学通报. 2005, 22: 1-10. 3 关军锋. 钙与植物衰老m.北京:农业出版社, 2001. 271- 298. 4 郭玉蓉, 毕阳, 曹孜义. 硅处理对甜瓜红粉病的影响j. 园艺学报. 2003, 5: 248-250. 5 bi y, tian s.p, guo y.r., et al. sodium silicate reduces postharvest decay on hami melons:induced resistance and fungistatic effects j. plant disease, 2006, 90: 279283. 6 盛占武, 毕阳, 鄯晋晓等. 采后硅酸钠处理对马铃薯干腐 病的抑制j. 食品工业科技, 2007, 9: 190-191 7 li y. c., bi y., ge y. h., et al. antifungal activity of sodium silicate on fusarium sulphureum and its effect on dry rot of potato tubersj. journal of food science, 2009, 5: 1334-1339. 8 毕阳, 张维一. 杀菌剂和热水处理损伤接种果实控制哈密瓜 的采后病害j. 植物保护学报, 1991, 23: 362-367. 9 马崇山. 脂氧合酶在果实成熟衰老及抗伤病中的作用j. 广 西科学, 2004, 11（4）:347-350. 10 gbel c g, feussner i, schmidt a , et al. 贺顺龙：采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响 15 profiling reveals the pref-erential stimulation of the 9-lipoxygenase pathway in elicitor-treated potato cells j. biology chemistry, 2001, 9: 6267- 6273. effecteffect ofof postharvestpostharvest s sodiumodium s silicateilicate t treatmentreatment onon thethe c contentontent ofof r relatedelated s substancesubstances andand thethe a activityctivity ofof e enzymesnzymes ofof c cellell m membraneembrane inin m muskmelonuskmelon f fruitruit he shun-long (college of food science and engineering, gansu agricultural university, lanzhou, 730070) abstract: the effect was studied of sodium silicate dipping tr