近海细菌hzo基因及古菌amoA基因多样性研究 毕业论文.doc

中国石油大学（华东）毕业设计（论文）中国石油大学（华东）毕业设计（论文） 近海细菌hzo基因及古菌amoa基因 多样性研究 学生姓名： 学 号： 专业班级：环境工程 指导教师： 中国石油大学（华东）本科毕业设计（论文） 摘 要 胶州湾和海南岛海域优美的自然环境与独特的地质演化进程吸引了众 多中外科学家的关注。这种复杂的地质演化过程必然也伴随着生物的不断 进化。 本实验中涉及的 hzo 和 amoa 基因序列可用于物种多样性的分析，相 对于比较 dna 所有序列，更简便并具有代表性。本实验通过对胶州湾 a5 站位微生物 hzo 基因以及海南岛海域 e505 站位 amoa 基因的 pcr 扩增， 转入感受态大肠杆菌，酶切分析，测序比功能比对等一系列步骤，分别建 立这两站位的微生物系统树。 本实验所采集的样品来自于胶州湾和海南岛海域，实验采用对沉积物 进行 hzo 和 amoa 基因文库构建进一步测序分析进化关系的方法。通过建 立的系统发育树可以对两个站位的微生物多样性进行评估。本次实验证明 胶州湾 a5 站位 hzo 基因多样性较少而海南岛海域 e505 站位 amoa 基因有 较高多样性。 关键词：关键词：厌氧氨氧化；hzo 基因；amoa 基因 中国石油大学（华东）本科毕业设计（论文） abstract the beautiful natural sceneries and the unique process of geological evolution of jiaozhou bay and hainan island waters are attracting more and more chinese and foreign scientists. the complex geological evolution may go with continuous evolution of living beings. this study analyzed the archaeal and bacterial diversity by the construction of gene sequences that can be applied to the analysis of species diversity. in this experiment, sediment dna from jiaozhou bay and hainan island coastal areas was extracted; hzo genes and amoa genes were amplified through pcr with degenerate primers justified by former researches, inserted into plasmids, which were then transformed with competent e.coli cells, analyzed by rflp, and sequenced. after series of procedures, phylogenetic trees based on hzo and amoa genes were constructed, which is a good indication of microbe diversity. the sediment samples used in this study were collected from the jiaozhou bay and hainan island waters. this study analyzed the archaeal and bacterial diversity by the construction of hzo and amoa gene libraries. from the two phylogenetic trees conducted, we can see hzo genes of staion a5 of jiaozhou bay has low diversity while amoa genes of station e505 of hainan island has high diversity. keywords: anammox; hzo genes; amoa genes 中国石油大学（华东）本科毕业设计（论文） 目 录 第 1 章 前言1 1.1 胶州湾生态环境1 1.2 厌氧氨氧化细菌1 1.3 该实验涉及的的分子生物学技术3 1.3.1 pcr 技术3 1.3.2 限制性酶切6 1.3.3 琼脂糖凝胶电泳7 1.4 本文的研究目的及意义8 1.4.1 本文的研究目的8 1.4.2 本文的研究意义9 第 2 章 实验部分10 2.1 材料及仪器10 2.1.1 胶州湾的地理位置及站位来源10 2.1.2 实验药品10 2.1.3 培养基.11 2.1.4 主要仪器设备.11 2.2 实验步骤12 2.2.1 宏基因组 dna 的提取.12 2.2.2 hzo 与 amoa 基因序列的 pcr 扩增 .14 2.2.3 pcr 产物的乙醇沉淀15 2.2.4 pcr 产物纯化16 2.2.5 纯化 pcr 产物的连接16 2.2.6 感受态细胞的制备16 2.2.7 转化17 中国石油大学（华东）本科毕业设计（论文） 2.2.8 克隆的 pcr 扩增18 2.2.9 pcr 产物酶切反应19 2.2.10 测序及保种19 2.2.11 测序结果分析20 第 3 章 实验结果分析22 3.1 pcr 图22 3.1.1 胶州湾 a5 站位 pcr 图 .22 3.1.2 海南岛海域 e505 站位 pcr 图24 3.2 酶切图26 3.2.1 胶州湾 a5 站位酶切图谱.27 3.2.2 海南岛海域 e505 站位酶切图谱 .31 3.3 结果分析37 3.3.1 建立系统发育树38 3.3.2 结果分析与讨论38 致谢42 参考文献43 第 1 章 前言 1 第1章 前言 1.1 胶州湾生态环境 胶州湾位于胶南威海造山带与胶莱坳陷东南缘的复合部位的中部， 是黄海伸入内陆的天然海湾，地质构造复杂，具有港口、外贸、旅游和海 洋科研等多种开发功能，对青岛的经济发展有着举足轻重的作用。胶洲湾 水域总面积约423km3，平均水深6.8 m，是一个典型的半封闭海域。 近年来，由于城市化进程的加快，工业和城市废水以及养殖污水大量 排放，导致近岸海域水体富营养化较为严重。胶州湾的主要污染物是营养 盐n、p1，沿岸有许多市区工业废水和生活污水的排污河，故n、p入海量 相对逐年增长。因此，胶州湾环境和浮游植物都发生了很大变化，这对胶 州湾海洋生物资源影响巨大，引起了海洋生物种类和数量的变化，造成赤 潮频繁的发生和其面积扩大。 1.2 厌氧氨氧化细菌 厌氧氨氧化(anammox：anaerobic ammnonium oxidation)是指在厌 氧的条件下，微生物直接以nh4+作为电子供体，以no2-作为电子受体，将 nh4+和no2-转变成n2的生物氧化过程。在此过程中，氨氮的氧化无需分子 态氧的参与，而亚硝酸盐的还原也无需有机物的参与。 craaf等采用n的示踪实验研究表明，anammox是通过生物氧化的途径 实现的，过程中最可能的电子受体是羟胺（nh2oh），而羟胺本身是由亚 硝酸盐产生的。他们提出可能的反应途径见图1-1所示。 第 1 章 前言 2 nh4+ nh2oh no2- no3- 2h n2h4 2h n2h2 n2 图1-1 厌氧氨氧化反应模型2 氨被羟胺氧化形成联氨：联氨产生氮气和还原当量，后者被用于亚硝酸盐产 生更多的羟胺亚硝酸盐被氧化成硝酸盐产生还原当量用于细胞生长 厌氧氨氧化过程涉及的化学反应为： nh3+nh2oh n2h4+h2o n2h4 n2+4h hno2+4h nh2oh+h2o nh3+hno2 n2+2h2o hno2+h2o+nad+ hno3+nadh2 根据上述的模型，厌氧氨氧化菌以羟胺为氧化剂，把氨氧化成联氨： 联氨再氧化成氮气。在这个模型中，亚硝酸盐具有三种功能：一是作为羟 胺的前体；二是作为电子汇，处置反应产生的电子；三是作为能源，在其 氧化为硝酸盐的过程中产生还原当量。 hooper等3对亚硝化单胞菌属细菌n. eurapaea的生物化学进行了相当 充分的研究，主要集中在氨单加氧酶和羟胺氧化还原酶hao。van de graaf 等4用15n标记n化合物研究厌氧条件下的氨氧化，在hooper等研究的基础 上，提出了厌氧条件下以亚硝酸盐为电子受体的氨氧化代谢途径，如图1-2 第 1 章 前言 3 5h- nh2oh 细胞质 h2n=nh2 anammox体4h+ no2- nh3 n2 图1-2 brocadla anammoxidans生化反应模型 按照这个模型机理，亚硝酸盐还原酶（nir）定位于细胞膜的细胞质 一侧，催化亚硝酸盐还原成羟胺；假设存在一个跨膜的联氨水解酶(hh)， 催化羟胺和氨缩合成联氨氧化酶（hzo，可能是hao）定位于细胞膜的厌 氧氮氧化体一侧，催一化联氨转化为氮气；释放的电子通过传递链交给亚 硝酸盐还原酶。 以上即为厌氧氨氧化细菌体内的生化反应机理。 厌氧氨氧化菌的发现，改变人们对传统氮的生物地球化学循环的认识： 反硝化细菌并不是大气中氮气产生的唯一生物类群。越来越多的证据表明， 细菌厌氧氨氧化与全球的氮物质循环密切相关，估计海洋细菌的厌氧氨氧 化过程占到全球海洋氮气产生的一半左右。由于氮与碳的循环密切相关， 因此可以推测，细菌的厌氧氨氧化会影响大气中的二氧化碳浓度，从而对 全球气候变化产生重要影响。另外，由于厌氧氨氧化菌实现了氨氮的短程 转化，缩短了氮素的转化过程，因此为开发更节约能源、更符合可持续发 展要求的废水脱氮新技术提供了生物学基础。 1.3 该实验涉及的的分子生物学技术 1.3.1 pcr技术 1.3.1.1 pcr技术的基本原理 hh nir 4e hao 第 1 章 前言 4 pcr技术的基本原理是以欲扩增的pcr为模板，以一对分别与模板互补 的寡核苷酸片段为引物,在dna聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制 沿着模板链延伸直至完成新的dna合成。 与活体内dna的半保留复制一样，pcr反应中，引物不仅能以原始 dna为模板进行扩增，而且也能以新合成的复制链为模板进行扩增。随着 反应的不断重复,原始模板dna的数量保持不变而新合成的复制链则逐渐 增加。理想的情况下，pcr反应中dna分子是以指数增长的，即每一个 pcr反应结束，dna的数量将变成2n个，n代表循环次数。但在实际反应中， 由于聚合酶的活性不同，模板的纯度，pcr反应仪器的差异等因素的影响， 不同的pcr反映扩增效率不同，dna的数量不是以2n增加,而可用(1+x)n计 算，x表示平均每次反应的扩增效率。另外，在反应初期，靶序列dna片 段的增加呈指数形式，随着pcr产物的逐渐积累，被扩增的dna片段不再 呈指数增加，而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”，这种效应 称平台期。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的，它取决于样品中 模板的拷贝数、pcr扩增效率及dna聚合酶的活性及非特异性产物的竞争 等因素。通常情况下,每完成一个循环需210分钟，pcr反应到26-28个循 环就基本达到平台期,此时就可以结束pcr反应。因此经过24小时就能将 待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。在这个毕业设计课题中，我们选择 的是30个循环，可以说是刚刚到达平台期。这段时间所复制的dna片段已 经足够多，所以平台期的差值可以忽略不计。 pcr反应体系由引物、taq酶、dntp、模板、mg2+组成，其中各成分 的功能如下： 引物:引物是一段寡核苷酸序列,类似于半保留复制中的冈崎片段。 理论上，只要知道任何一段模板dna序列,就能按其设计互补的寡核苷酸 链做引物,利用pcr就可将模板dna在体外大量扩增。在pcr反应中,引物 一旦与模板链结合,在dna聚合酶的作用下，引物就会从3端开始延伸。随 第 1 章 前言 5 着反应的进行，反应体系中引物的量会不断减少。 taq酶全名为taq dna多聚酶（taq dna polymerase），它在dna 的复制中起聚合作用。 dntp:即四种核苷酸,随着反应的进行,反应体系中dntp的量会不断 减少。 模板:典型的pcr反应是用dna做为模板核酸（靶基因）,它的量与 纯化程度,是pcr成败与否的关键环节之一。 mg2+浓度:由于dna聚合酶活性需要一定的离子环境,所以mg2+对 pcr扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的pcr 反应中,mg2+浓度过 高,反应特异性降低，浓度过低会降低taq dna聚合酶的活性,使反应产物 减少。 1.3.1.2 pcr污染及对策 pcr反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头 痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。在我们的实 验中，出现污染的原因主要有以下几个方面：一、模板间交叉污染：dna 模板在提取过程中，由于移液枪污染导致模板间污染。二、pcr试剂的污 染:主要是由于在pcr体系配制过程中，由于移液枪、离心管、ddh2o及其 它溶液被dna模板污染。三、pcr扩增产物污染：这是pcr反应中最主要 最常见的污染问题.因为pcr产物拷贝量大，远远高于pcr检测数个拷贝的 极限，所以极微量的pcr产物污染，就可形成假阳性。 在防止污染方面，我们应该注意以下几点：(一)移液枪：移液枪污染 是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板吸入枪内或粘上枪 头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板时要十分小心，吸样要慢， 吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 (二)防止操作人员污染，使用一次性手套、枪头、小离心管应一次性使用。 (三)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低 第 1 章 前言 6 量的标准模板为宜，并注意交叉污染的可能性；每次反应都应有一管不加 模板的试剂对照及相应不含有被扩增模板的样品作阴性对照。(七)选择质 量好的离心管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离 心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出。 1.3.2 限制性内切酶酶切 限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类能够识别dna的特异 序列并在识别位点剪切双链dna的内切酶。主要存在于原核生物中，大多 数来自于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 体系，限制外源dna、保护内源dna5。 限制性内切酶可分为三类6:i类和ii类酶在同一蛋白质分子中兼有切割 和修饰(甲基化)作用且依赖于atp的存在。i类酶结合于识别位点并随机的 切割识别位点不远处的dna，而iii类酶在识别位点上切割dna分子，然后 从底物上解离。ii类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶） ， 它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识 别序列8。ii类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是 重组dna的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对 称特异核苷酸序列，有少数酶识别更长的序列或简并序列。ii类酶切割位 点在识别序列中，有的在对称轴处切割,产生平末端的dna片段；有的切割 位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的dna片段称粘性末端。 在我们这个实验中来源于不同菌株的dna分子，由于结构和序列的不 同，用mspi和hhai限制性内切酶作用后会形成大小不等的一些片断。这些 片断通过凝胶电泳可以分离开来，经eb染色后，在紫外光下会形成具有生 物种或株特异性的图谱。分析比较这些图谱就可以达到我们区分不同基因 序列的目的。 在这个研究中，我们选择的是mspi（以后简称m酶）和hhai（以后简 第 1 章 前言 7 称h酶）两种限制性内切酶，通过这两种酶切图谱的分析，我们便可以将 不同基因序列初步划分的。 1.3.3 琼脂糖凝胶电泳 1937年首创纸电泳技术后，电泳的种类和应用在深度和广度两方面均 发展迅速，已成为分子生物技术中分离生物大分子的重要手段。电泳技术 的发展已有近80年的历史，在早期电泳技术得到了迅猛发展，许多新的电 泳技术不断涌现，尽管最近几年电泳发展的脚步缓慢了，但在某些领域仍 取得了突破，如空间电泳技术的出现。如今电泳技术正向着全面化、综合 化、简便化及实用化方向发展，同时电泳芯片的发展也必然会给电泳技术 带来一场新的技术革命8。其中，凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏 等优点，使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选的标准方法9。这当中又 以琼脂糖凝胶电泳作为基础。 琼脂糖凝胶电泳的原理10:琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其 结构单元是-半乳糖和3.6-脱水-l-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的 作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适 合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中 常用于ldh、ck等同工酶的检测。 整个过程如下： 凝胶制作 配制凝胶的浓度据实验需要而变11一般在0.83.0之间。随着融 化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果 不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的 水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的 方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值，以保证凝胶浓度 基本维持在原浓度12。在这里，我们选择的是后一种方式。 点样 第 1 章 前言 8 将移液器基本垂直点样孔，用另一只手帮助固定移液器下端，移液器 枪头尖端进入点样孔即可将样品注入孔内，千万不可将枪头尖插至孔底， 并点上适合的dna分子量标准，所谓适合是指样品dna分子量大小应基本 在dna分子量标准范围之内。在这个过程中，我们一般选择的是25个点样 孔的凝胶，每个点样孔注入样品量为3l。 电泳 在pcr产物电泳时，选择电压90v，时间50min。而在酶切电泳中，我 们选择的是电压65v，时间上在1h、1h20min、1h40min时各成一次像（其 中hhai酶切体系要在2h时再成一次像）。 在我们这个实验中，需要注意的问题有：一、灌胶模具要保持清洁无 污染，除了无核酸、蛋白及其它可见杂物进入凝胶外，最主要是排除eb在 制胶模具的沉积。二、电泳缓冲液一般可重复使用多次，但若出现浑浊情 况就应及时更换，否则影响电泳分辨率。每次电泳前将电泳缓冲液重新摇 匀，使正负极的ph基本一致。三、琼脂糖应完全熔化呈清澈、透明的液体。 当胶冷却至5060时加入eb（eb见光易分解，但耐高温，在230以上 才会分解），充分摇匀；在5060时倒人模具制胶，动作要轻，避免产 生气泡，若温度过低，则胶冷却后不均一，电泳谱带弯曲。要保证胶的凝 固时间，确保凝胶形成稳定均一的孔径，一般在胶冷却3045min后再拔梳 子点样电泳。四、上样buffer一般采用甘油增加样品比重13，但放置一段 时间后会使其沉降不均。因此，使用时应先摇匀后再取用，否则样品会漂 移散失。 1.4 本文的研究目的及意义 1.4.1 本文的研究目的 近年来，由于城市化进程的加快，工业和城市废水以及养殖污水大量 排放，导致近岸海域，水体富营养化较为严重。因此，胶州湾环境和浮游 植物都发生了很大变化，这对胶州湾海洋生物资源影响巨大，引起了海洋 第 1 章 前言 9 生物种类和数量的变化，造成赤潮频繁的发生和其面积扩大。近期的研究 发现，厌氧氨氧化菌实现了氨氮的短程转化，缩短了氮素的转化过程，因 此为开发更节约能源、更符合可持续发展要求的海水脱氮新技术提供了生 物学基础。在厌氧氨氧化细菌的脱氮过程中，联胺氧化还原酶无疑起着关 键性的作用，而hzo基因即控制联胺氧化还原酶合成的片段基因，所以，我 们要截取这段关键的基因片段来进行我们的研究。 海南岛海域位于我国南海西北部，处于热带北缘，具有丰富的热带海 洋生物资源。aoa 能进行氨氧化作用，在海洋氮循环中起着重要作用。因 此，人们可以通过本研究进一步分析该海域的氮循环状况及生态环境状况； 此外，该海域受当地人们生产生活影响较大，其生态环境与人类活动密切 相关，本研究也可以在海洋生态保护，海洋污染治理等方面提供基础信息。 1.4.2 本文的研究意义 越来越多的研究表明在海底深部沉积物中蕴藏着巨大的微生物生物量、 生物和分子多样性以及复杂多样的生理生态功能过程。海底深部生物圈微 生物正成为生命起源和进化、地球系统进化和演化、全球变化和海洋生物 技术开发利用的研究焦点。我们所做的课题正是在这一大背景下应运而生。 对胶州湾 hzo 基因以及海南岛 amoa 基因的研究目前还处在空白阶段，通 过对其研究分析可以得出在人为影响下，对微生物发育进化的影响。通过 微生物同源性的研究，思考在相似的生态环境微生物的相似度，对海底沉 积物中厌氧氨氧化细菌以及氨氧化古菌的研究对于以后更深入的研究海洋 氮循环、生命起源和进化、海洋生物技术的开发利用都具有非常重要的意 义。 第 2 章 实验部分 10 第 2 章 实验部分 2.1 材料及仪器 2.1.1 胶州湾的地理位置及站位来源 图 2-1 胶州湾的地理位置及站位来源 图 2-1 胶州湾的地理位置及站位来源 2.1.2 实验药品 fast dna spin kit for soil（mptm, biomedicals，cat#6560-200） ，琼脂 糖凝胶 dna 回收试剂盒(omega，d6492-01)，pmd18-t 载体连接试剂 盒（大连宝生物工程有限公司） ，质粒提取试剂盒（omega，d6943-01） ， 氨苄青霉素（amp 50 mg/ml, bbi） ，dntp（fermentas） ，bsa(200ng/l)， 引物(hzof1, hzor1)，引物（m13-d 和 rv-m, 2.5g/ml） ，5-溴-4-氯-3-吲哚- -d-半乳糖苷（x-gal, 20mg/ml） ，异丙基硫代-d-半乳糖苷（iptg, 24 mg/ml） ，低熔点琼脂糖（biowest） ，溴化乙锭（天根生化科技有限公司） ， genefinder（厦门百维信） ，taq 酶（fermentas） ，d2000 marker（北京天根 生化科技有限公司） ，100bp dna ladder（北京天根生化科技有限公司） ， hhai 限制性内切酶、mspi 限制性内切酶和 taqi（fermentas） ，蛋白胨 第 2 章 实验部分 11 （oxoid） ，酵母提取物（oxoid） ，nacl（上海国药集团） ，琼脂粉（上海 国药集团） ，mgcl2（上海国药集团） ，甘油。 2.1.3 培养基 soc 培养基； 固体 lb(+amp+x-gal+iptg)培养基； 固体 lb（+amp）培养基； 液体（+amp）培养基； 表 2-1 100ml 液体 soc 培养基配方 试剂用量 胰蛋白胨2g 酵母膏0.5g 1mol/lnacl1ml 1mol/l kcl0.25ml 2mol/l 葡萄糖1ml soc 培养基（ph=7.0）：sob 培养基经高压灭菌后冷却到 60，加 入 20ml 除菌的 1mol/l 的葡萄糖溶液。 液体 lb 培养基配方如表 2-2，向 lb 液体培养基中加入 15g/l 琼脂则为固 体 lb 培养基。 表 2-2 1l 液体 lb 培养基配方 试剂用量 蒸馏水1000ml 蛋白胨10g 酵母粉5g nacl10g 2.1.4 主要仪器设备 （1）fast prep-24 核酸提取仪（mp） ； 第 2 章 实验部分 12 （2）电泳仪（dyy-7c 型，北京市六一仪器厂） ； （3）高压蒸汽灭菌器（yxq-ls-30sii 型，上海博迅实业有限公司医 疗设备厂） ； （4）电子天平（al204 型，mettler） ； （5）层析实验冷柜（yc-2 型，北京德天佑科技发展公司） ； （6）制冰机（xb100 型，grant） ； （7）微生物操作超净工作台（dw-cj-2f 型，苏净集团安泰公司） ； （8）电热恒温振荡水槽（dk-s24 型，上海精宏实验设备有限公司） ； （9）恒温培养箱，烘箱（上海福玛实验设备有限公司） ； （10）电热恒温鼓风干燥箱（dhg-9146a 型，上海精宏实验设备有限 公司） ； （11）蓝盾 501 可见光凝胶投射仪（厦门百维信生物科技有限公司） ； （12）pcr 仪（tgradient 型和 tpersonal 型） ； （13）冷冻高速离心机（eppendorf，5810r 型） ； （14）普通离心机（sigma，1-14 型） ； （15）凝胶成像分析系统（alpha innotech,7-800-823-0404 型） ； （16）超低温冰箱（mdf-382e 型，sanyo） ； （17）ph 计（hanna，211 型） ； （18）旋涡振荡仪（ql-901 型，其林贝尔仪器制造公司） ； （19）微波炉（galanz） ； （20）冷冻恒温震荡器（dhz-da 型，培英，太仓市实验设备厂） ； （21）haier 冰箱（青岛海尔股份有限公司） ； 2.2 实验步骤 2.2.1 基因组 dna 的提取 采用土壤 dna 快速提取试剂盒（fastdna spin kit for soil）及 fast prep-24 核酸提取仪进行提取。dna 提取的质量决定后续实验的准确性和 第 2 章 实验部分 13 可靠性。每个站位均用 0.3g 左右的沉积物样品进行 dna 提取。具体操作 过程如下： （1）向 lysing matrixz tube 中加入 0.3g 沉积物混合样，加入 1100l 裂 解液溶解，裂解液组成为 978l 磷酸钠缓冲液和 122l mt 缓冲液。 （2）将上述离心管放入 fastprep instrument 中，设定速度 6.0，离心时 间 40s。 （3）离心机预冷 15min，至 4，将上述离心管以 14000g 离心 30s。 （4）将上清移入新的 15ml lysing matrixz tube 中加入 250lpps，并颠 倒 10 次将其混匀。 （5）将上述混合液以 14000g 离心 5min，将上清移入另一新的 15ml 的 lysing matrixz tube 中，将 binding matrix suspension 摇匀，悬浮，向上 述上清中加入 1ml binding matrix suspension。 （6）用手颠倒混匀 2min，将管放置于管架上静置 3min(4)。 （7）吸出 500l 上清，将之丢弃，使余下的上清与 binding matrix 混匀， 将 600l 的混合液移入纯化柱中 14000g 离心 1min，倒掉收集管中的废液， 将剩余的 binding matrix 全部移入纯化柱中 14000g 离心 1min，倒掉收集 管中的废液。 （8）向纯化柱中加入 500l sews-m，14000g 离心 1min，倒掉收集 管中的废液，重复三次后，以 14000g 离心 2min，以使 sews-m 洗脱液 被全部除去。 （9）将纯化柱移入新的收集管中，室温下空气中干燥纯化柱 5min。 （10）加入 50ldes，并且用枪头清搅滤膜或用手指轻弹使 dna 溶解， 静置 1min，以 14000g 离心 1min，使 dna 转移到收集管中。再加 30l 重复以上步骤，最后共得到 80ldna 样品。 （11）提取的 dna 用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，marker 用 dna/hind。-80冰箱保存。 第 2 章 实验部分 14 2.2.2 hzo 与 amoa 基因序列的 pcr 扩增 （1）准备工作：4离心机、制冰机提前打开，黄色切头枪头-20冰 箱中预冷，灭菌 ddh2o，大小离心管，大小枪头超净工作台紫外灭菌 15min。 所有的酶、buffer、引物等都进行分装，防止污染。 取出 dna，冰上解冻，用冷却的无菌切头黄色枪头轻轻吹打 dna，4，10000rpm 离心 5min。取 1.5l dna 稀释 20，取出 10ul 的原 液。剩余 dna 放回-80冰箱。 （2）梯度 pcr 实验，pcr 体系 12.5l，模板梯度分别为稀释的 0.5，1，2，4，原液 0.5，1.0l，具体配方如表 2.3 表 2-3 梯度 pcr12.5l 体系 试剂体积(l) ddh2o根据模板的量补足 12.5l buffer1.25 dntp（2.5mm）1 mgcl2（25mm）0.75 bsa（200ng/l）1 引物 hzof1（20m0.25 引物 hzo r1(10m)0.25 模板 dna0.5，1，2，4，原液 0.5，1.0 taq 酶0.1 阴性对照：模板用无菌 ddh2o。 电泳检测：将已制备好的琼脂糖凝胶水平放入装有 tae 缓冲液的电泳 仪中，使缓冲液没过凝胶，用微量移液器向胶孔中加入 marker 和混有 loading buffer 的待测 dna 样品后，100v 电压电泳约 30min。放入凝胶成 第 2 章 实验部分 15 像仪进行成像检测，根据条带的位置和清晰程度判断所扩增的目的基因的 质量。选取特异性高的，非特异性扩增少，条带清晰的并且产量较高的浓 度。 （3）平行 pcr 实验：梯度 pcr 实验，平行 pcr 实验同一天完成， 防止因 dna 降解产生误差。25l 反应体系：做 8 个平行。 表 2-4 平行 pcr 25l 体系 试剂体积(l) ddh2o根据模板的量确定加入量 buffer2.5 dntp（2.5mm）2 mgcl2（25mm）1.5 bsa（200ng/l）2 引物 hzof1（10pm） 0.5 引物 hzo r1(10pm)0.5 模板 dna 梯度 pcr 后最好的浓度 taq 酶0.3 2.2.3 pcr 产物的乙醇沉淀 （1）将检测后的平行 pcr 产物全部加在一起，估计体积。 （2）调整单价阳离子浓度。若 dna 溶液中含有高浓度的盐，可用 te 稀释（ph8.0）稀释，否则加入盐。 （3）充分混匀溶液，准确加入 2 倍体积的冰冷乙醇（-20） ，再充分 混匀（吹打）溶液。将此含乙醇的溶液置冰上或-20过夜使 dna 沉淀形 成。 （4）第二天早上于 0，13000rpm 离心 20min 回收 dna。 （5）小心移出上清液，注意不要搅动沉淀（有时沉淀是看不见的） ， 第 2 章 实验部分 16 用吸头吸尽附于管壁的所有液滴。 （6）加 500l 70%乙醇（先 4保存） ，413000rpm 离心 4min。 （7）重复步骤 5。 （8）离心管室温下敞口放置在实验台上，直至残留的液体挥发干。 （9）将 dna 沉淀重新溶解于适当体积（20l 左右）的缓冲液（一般 为 7.68.0te）或无菌去离子水中，充分漂洗管壁。 注：离心时离心管放置位置要有所标记，离心后，注意观察离心管底 外侧，一般会有白色沉淀。 2.2.4 pcr 产物纯化 将乙醇沉淀后得到的 dna 溶液用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化，琼 脂糖凝胶浓度 1.5%，纯化方法按说明书操作。最后 dna 溶解体积为 20l。 2.2.5 纯化 pcr 产物的连接 将目的基因连接到质粒载体 pmd18-t 上。 表 2-5 连接体系的配制 组分体积(l) pcr 产物2 pmd18-t vector0.5 solution2.5 于 16连接 2h 后，4连接过夜。 2.2.6 感受态细胞的制备 （1）从新鲜的大肠杆菌 ecoli. dh5 培养平板上接种一环菌落于 5mllb 液体培养基，37培养过夜。 （2）按 0.5%1%的比例转接于 100mllb 液体培养基，37培养 24 个小时，当菌液 od600 约为 0.3。 （3）将菌液转移到预冷的 50ml 离心管中，冰浴 30min，4000rpm 离 第 2 章 实验部分 17 心 10min。 （4）去上清，沉淀悬浮于 5ml 预冷的 0.1m 的 cacl2 溶液中，冰浴 15min,4000rpm 离心 10min。 （5）去上清，沉淀悬浮于 2ml 预冷的 0.1m 的 cacl2溶液中，冰浴 10min，4000rpm 离心 10min。 （6）去上清，沉淀悬浮于 1ml 预冷的 0.1m 的 cacl2溶液中，加入高 压灭菌的甘油至终浓度 15%。 （7）取 200l 分装于 1.5ml 的离心管中，于-80保存，备用。 2.2.7 转化 准备转化用的液体 soc 和固体 lb 培养基，以及 100l/ml 的 amp。 lb 固体培养基：每个平板至少 30ml，每个库至少 120ml。 （1）用冷却的无菌吸头将重组载体加入200l用cacl2溶液制备的感受 态细胞悬液中（重组dna体积不超过10l，dna小于10ng） ，轻轻旋转以 混匀内容物，在冰中放置30min。 （2）将离心管放入预加温至42的循环水浴中，放置90s，不要摇动 管。热激是一个关键步骤，准确达到热激温度非常重要。 （3）快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。 （4）每管加入800l soc培养基（提前备好，放于4待用） ，用水浴 将培养基加温至37，然后将离心管转移到37摇床上，温育45min，使细 菌复苏并表达质粒编码的抗生素标记基因。 （用低于50r/min的转速的摇床） 。 （5）将适当体积已转化的感受态细胞转移到含100g/ml氨苄青霉素的 lb固体平板上，用x-gal（24g/ml）和iptg（40g/ml）作为显色指示剂。 进行梯度涂布，作50l、100l、200l、400l四个板。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平板，于37培养，12-16h后可出现菌落。 第 2 章 实验部分 18 （8）取出培养板于4放置数小时使之显色。 （9）从克隆数约200个的同一个平板上用平头牙签随机挑选约200个白 色菌斑，将挑选出的阳性克隆在含100g/ml氨苄青霉素的lb固体平板上用 平头牙签划菌落，一个板15个左右标号，防止交叉污染，于37培养过夜 （第四天下午挑克隆） 。 （10）第五天挑菌进行菌落pcr，并封好平板保存于4，并保持15天 转接一次。或挑至试管，进行保种。 2.2.8 克隆的 pcr 扩增 将灭菌大号离心管按所需提 dna 的菌落编号作好标记；加入 100lddh2o；按照管号挑取相应编号的单菌落于无菌超纯水中（注意控制 挑取菌落的量） ，沸水中煮菌 5min，然后立即置于冰上，使其迅速冷却， 时间约为 5min。擦干离心管壁，以 12000rpm 离心 5min；用移液器取上清 液 20l 作为 pcr 模板于干净的小号离心管中待用。 表 2-6 25lpcr 体系 组分体积(l) ddh2o15.8 buffer2.5 dntp2 mgcl22 m13-d1 rv-m1 taq 酶0.2 模板 dna0.5 pcr 反应程序如下： （1） 94 预变性 3min 第 2 章 实验部分 19 （2）94 变性 45s （3）58 退火 1min （4）72 延伸 90s （5）72 延伸 10min 其中（2）-（4）步进行 25 个循环。 pcr 产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，marker 用 d2000。 2.2.9 pcr 产物酶切反应 片断大小合适的pcr产物分别用mspi，hhai，taqi限制性内切酶进行 酶切。其中mspi与hhai酶切体系的配制在第一章已经涉及，taqi酶切体系 配制见表2-7。酶切反应于37过夜。酶切产物用3%的琼脂糖凝胶进行电 泳分析（电压65v） 。 注：每次电泳检测所用电压，跑胶时间应基本相同。 表2-7 mspi、hhai酶切6l体系 组分体积 酶切缓冲液0.6l 限制性内切酶(msp/hha)0.3l pcr 产物 dna2.7l 无菌超纯水2.4l 表2-8 taqi酶切9l体系 组分体积(l) 酶切 buffer0.6 限制性内切酶(taqi)0.45 pcr 产物 dna2.7 无菌超纯水5.25 第 2 章 实验部分 20 2.2.10 测序及保种 （1）配制 lb 液体培养基。 （2）将 lb 液体培养基移入有帽试管中，每只试管中加入 4ml 液体 lb 培养基。 （3）将所有装有 lb 液体培养基的试管进行灭菌。 （4）在无菌超净操作台中按酶切分析结果分别对灭过菌的试管进行编 号，并向 lb 液体培养基中加入一定量的 amp，用黄枪头将对应的菌株转 入试管中。 （5）将试管放入摇床中，在 37，150rpm 的条件下摇菌 12-14h。 （6）培养后的菌放入已提前灭好菌的超净工作台中待保种。 （7）取两组 1.5ml 的离心管（一组用于保种，另一组用于送去测序列） ，按顺序编号，每管加入 600l 50%甘油和 600l 对应序号的菌液。 （8）将离心管管用 qc-901 vortex 旋涡振荡仪振荡混匀 1min，静置 5min 后再振荡混匀 30s。 （9）将混匀的一组菌液放入冻存盒中，在冻存盒上用记号笔标记好所 存菌株号以及保种日期，放入-80超低温冰箱中保存。另一组送往上海生 工生物科技公司测序列。 2.2.11 测序结果分析 将筛选出的有效克隆送国家人类基因组南方中心测序部进行测序，所 得序列在 ncbi 中进行 blast 比对，找出与该序列最相似的序列，并查找 相应微生物信息，确定样品中所含微生物的种类范畴。然后用 bioedit 将测 序核酸序列翻译成氨基酸序列，结合前一步搜索结果，利用 phylip 根据其 亲缘关系构建系统进化树。 第 3 章 实验结果分析 21 第3章 实验结果分析 3.1 pcr图 3.1.1 胶州湾a5站位pcr图 图 3-1 胶州湾 a5 站位 hzo 基因 1-39 号菌株 pcr 图 由上图可以看出这 36 号菌株并不全，原因是在挑克隆的时候就直接在 平板上标号了，但是实际上第二天并不是所有的菌株都长势良好。 图 3-2 胶州湾 a5 站位 hzo 基因 40-63 号菌株 pcr 图 第 3 章 实验结果分析 22 图 3-3 胶州湾 a5 站位 hzo 基因 64-80 号菌株 pcr 图 由上图可以看出 78、79、80 三个号码菌株的 pcr 结果并不成功，所 以将这三个号重做。 图 3-4 胶州湾 a5 站位 hzo 基因 78-98 号菌株 pcr 图 图 3-5 胶州湾 a5 站位 hzo 基因 99-111 号菌株 pcr 图 第 3 章 实验结果分析 23 上图是 a5 站位 99-111 号菌株与 y1 站位 63-73 号菌株的 pcr 电泳图 片，具体号码已经标出。 图 3-6 胶州湾 a5 站位 hzo 基因 112-142 号菌株 pcr 图 图 3-5 与图 3-6 的电泳图很不成功，由于该段时间本实验室普遍都有 这种情况，而且在换了新的一盒琼脂糖后情况就立刻好转，所以判断是琼 脂糖的问题。 总结以上图谱可以得出 100、102、127、130 号菌株未出带，而由于 2、9、11、13、15、16、17、21、23、28、30、31 菌株长势不好所以没有 做，12、25、26、27、40、42、52、56、57、69、70、84、87、96、123 主要谱带下又出现一条较淡谱带，可能是杂菌，需要重新划线。这个部分 已经做了。这个站位是我们进入实验室所接触的第一个站位，由于经验以 及操作的原因，问题出现的比较多。 3.1.2 海南岛海域 e505 站位 pcr 图 第 3 章 实验结果分析 24 图 3-7 海南岛海域 e505 站位 amoa 基因 1-47 号菌株 pcr 图 图 3-8 海南岛海域 e505 站位 amoa 基因 48-54 与 102-118 号菌株 pcr 图 第 3 章 实验结果分析 25 图 3-9 海南岛海域 e505 站位 amoa 基因 55-101 号菌株 pcr 图 图 3-10 海南岛海域 e505 站位 amoa 基因 119-141 号菌株 pcr 图 由以上图谱可以看出 7、10、75、81、112、119、120、124、137 号 菌株出现低带，13、32、70、71、88、100 号菌株出现两条谱带，66 号菌 株未出带，133 号谱带很淡，以后做酶切得时候可以适当增加模板的量。 需要重新划线的部分，但是由于时间原因，重新划线的部分没有进行，只 是将除上述低带和多带以外的其它菌株进行了酶切和测序保种等后序工作。 第 3 章 实验结果分析 26 3.2 酶切图 本实验采用mspi、hhai、taqi进行酶切分析。其中胶州湾hzo基因采取 前两种酶切分析，而海南岛海域amoa则采用以上三种酶。在同一个酶切图 谱中，如果两个克隆，酶切片段完全相同，我们就认为它属于同一个 otu（可操作分类单元） 。 3.2.1 胶州湾a5站位酶切图谱 3.2.1.1 胶州湾a5站位hhai酶切图谱 图3-11 胶州湾a5站位hzo基因1-36号菌株hhai酶切图 图3-12 胶州湾a5站位hzo基因37-60号菌株hhai酶切图 第 3 章 实验结果分析 27 图3-13 胶州湾a5站位hzo基因61-88号菌株hhai酶切图 图3-14 胶州湾a5站位hzo基因89-112号菌株hhai酶切图 图3-15 胶州湾a5站位hzo基因113-136号菌株hhai酶切图 第 3 章 实验结果分析 28 图3-16 胶州湾a5站位hzo基因137-142号菌株hhai酶切图 3.2.1.2 胶州湾a5站位mspi酶切图谱 图3-17 胶州湾a5站位hzo基因1-36号菌株mspi酶切图 第 3 章 实验结果分析 29 图3-18 胶州湾a5站位hzo基因37-40号菌株mspi酶切图 图3-19 胶州湾a5站位hzo基因40-63号菌株mspi酶切图 图3-20 胶州湾a5站位hzo基因64-78号菌株mspi酶切图 图3-21 胶州湾a5站位hzo基因79-92号菌株mspi酶切图 第 3 章 实验结果分析 30 图3-22 胶州湾a5站位hzo基因89-112号菌株mspi酶切图 图3-23 胶州湾a5站位hzo基因113-136号菌株mspi酶切图 图3-24 胶州湾