食品质量与安全专业论文17299.doc

学士学位毕业论文 乳酸菌增菌培养基的营养 因子优化 学生姓名：学生姓名：翟增滨 学学 号：号：20084063131 指导教师：指导教师：王颖 所在学院：所在学院：食品学院 专专 业：业：食品质量与安全 中中国国大大庆庆 2012 年年 7 月月 摘 要 以改良 mrs 发酵培养基为基础, 选择玉米浆、牛肉膏、乳糖、番茄汁、胰蛋白胨等 7 个营 养因子增菌培养乳酸菌进行优化。利用 l8 ( 27 ) 正交实验, 优化出培养基营养因子最佳组成 是: 玉米浆 3%、牛肉膏 1%、乳糖 1% 。研究结果表明, 嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利 亚乳杆菌、嗜酸乳酸菌, 在优化后的 mrs 培养基发酵液中, 37培养 20 h, 菌落数均高于原 mrs 培养基发酵液的菌落数, 达到 109 cfu/ ml 以上, 乳酸菌发酵液得到了浓缩, 大大降低了 乳酸菌发酵培养基的成本, 原料成本降低了约 40%。 关键词关键词：乳酸菌, 营养因子, 优化培养 abstract ethanol was used for extracting black rice pigment under ultrasound assistance. to maximize the extraction of black rice pigment, orthogonal array design was employed for investigating the effects of ethanol concentration, solid-to-liquid ratio,ultrasound power, extraction time on black rice pigment yield (represented by the absorbance at 543 nm wavelength of extract solution). results showed that the use of 80% ethanol for extracting black rice grains at 1:40 solid-to-liquid ratio (g/ml) with the assistance of 30 min ultrasound treatment at 350 w gave an optimal pigment extraction and the resulting pigment yield reached up to 2.07%. keywords: black rice；pigment；orthogonal array design；ultrasound-assisted extraction 目 录 i 1 前言.1 1.1 课题来源1 1.2 课题研究的目的及意义1 1.2.1 黑米中色素的应用.2 1.3 研究现状3 1.4 前景展望3 2 实验设计与方法.3 2.1 实验材料3 2.2 主要设备3 2.3 试验过程与方法3 2.3.1 工艺流程.3 2.4 浸提条件的选择4 2.4.1 乙醇浓度对黑米黑色素提取效果的影响.4 2.4.2 超声浸提时间的选择对黑米黑色素提取效果的影响.4 2.4.3 超声功率对黑米黑色素提取效果的影响.4 2.4.4 料液比对黑米皮色素提取效果的影响.4 2.4.5 最佳工艺条件的选择.4 3 结果与分析.5 3.1 影响黑米皮色素提取效果的单因素研究5 3.1.1 乙醇浓度对黑米皮色素提取效果的影响.5 3.1.2 超声浸提时间的选择对黑米黑色素提取效果的影响.5 3.1.3 超声功率对黑米皮色素提取效果的影响.6 3.1.4 料液比对黑米皮色素提取效果的影响.6 3.2 多因素试验6 3.2.1 正交试验.6 4.结论.7 致 谢9 黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 0 1前言 乳酸菌是有益于人体健康的益生菌, 主要存在于人体肠道, 其有助于宿主调整 正常菌群, 维持肠道微生态环境的平衡。乳酸菌的代谢产物能降低肠道内的 ph 值, 抑制肠道中腐败菌的生长和减弱腐败菌在肠道的产毒作用, 并有帮助消 化、防止便秘, 防止细胞老化,降低胆固醇, 抗肿瘤以及调节人体生理机能等保 健和医疗作用 1- 5。 本文以提供乳酸菌生长的 mrs 培养基为研究素材，通过单因素实验了解各种 营养因子对乳酸菌生长的影响，利用正交实验对原 mrs 培养基进行了优化及 选择廉价的原料为营养添加剂, 旨在选出适合的最佳营养因子组成。 1.1 课题来源 本课题来源于院内自选课题 1.2 乳酸菌培养基简介 俗乳酸菌工业产品为菌体本身细胞，因而设计出能增菌的培养基在工业上具有 重要意义。设计选用工业上佳美低廉的原料，便于降低成本，也有利于降低菌 种的适应期，利于增值。 乳酸菌增菌液配方设计中因营养要求复杂,影响生长的因素多,在实际工作中还 应做其他条件的优化,如增菌液氧化还原电势、ph 值、温度等,因工作量大而时 间有限,只能对配方作初步的优化设计。为了降低生产成本,在工业应用时可选 用乳清和脱脂乳经蛋白酶水解,用以提高增菌效果,再加入乳糖、啤酒酵母的自 溶水解物,在发酵罐内完成乳酸菌的增菌,罐内可以通入过滤除菌的 n2 和 co2 , 以降低反应液氧化还原电势(特别是保加利亚乳杆菌)。若有自动化发酵罐还可 通过监测 ph 值,发酵罐自动注入灭菌的 1 mol - 1naoh 或 nh4oh 液,以中和代 谢乳酸。 培养基（medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养 料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素 和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定。 培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不 同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基 必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基） ， 较长时间的贮存，必须放在 26的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管， 现在均改制成粉末。 化学分类：天然培养基（指一类利用动、植物或微生物体包括其提取物制成的 培养基。如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等 ） ；组合培养基（又称为合 成培养基或综合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化 学试剂配制成的培养基。如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。 ） ；半 组合培养基（指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的 培养基。例如，马铃薯蔗糖培养基。 ） 物理分类：液体培养基（一类呈液态的培养基。 ） ； 固体培养基（一类外观呈 黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 1 固态的培养基。根据性质又分为固化培养基、非可逆性固化培养基、天然固态 培养基、滤膜。 ） ； 半固体培养基（指在液体培养基中加入少量的凝固剂而配 制成的半固体状态的培养基。 ） ； 脱水培养基（又称预制干燥培养基，指含有 除水分外的一切成分的商品培养基。) 微生物分类：选择性培养基（一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、 物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功 能，广泛用于菌种筛选等领域。 ） ；鉴别培养基（一类在成分中加有能与目的 菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能 方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。例如，伊红美蓝乳糖培养基 （emb） 。 ） 另外一种就是天然培养基。天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取 的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早 期，体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、 批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血 清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也 是必不可少。 1.2.1 存在的问题 目前的培养基虽能进行乳酸菌生产，但是，其有操作复杂、产量小、资源 浪费、成本过高等不足之处。 1.2.2 培养基优化的重要意义 合理配置的培养基中各种营养物质成分达到最适比例，ph 达到最适，溶解氧也 达到了最适浓度，这样就给微生物创造了最适宜生长的环境条件，并且对环境 产生的污染降到最低，实现了资源的循环利用。又能单位时间内生长最多的菌 量。同时减少了动力设备与加压设备，大大减少了成本，这对于一个生产企业 来说无疑意义重大。 1.3 研究现状 食品加工行业应充分利用、开发、加工现有黑米黑色素，使之应用于食品 中成为广大城乡人民乐于消费的食品。医疗保健营养研究部门应对黑米黑色素 的特殊药用保健功能作更深入的研究，进一步揭示我国黑米对人体健康的作用 机理。随着人民购买力的提高，将从单一粮食转向多样化的优质食品来改进膳 食结构，而既具营养,又有保健功能的食品将是人们所关注和喜爱的食品。特别 是随着我国逐步进入老龄社会，老龄食物应重点发展抗衰老食品。因此在今后 一段时期内,在人类开发自然、回归自然的浪潮中，作为人民生活的主要必需品 之一的中国黑米也必将有着广阔的开发应用前景20-21。 1.4 前景展望 目前国内外植物天然色素的产品种类与产量甚少飞远远满足不了食品饮料 黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 2 加工业的需求。为解决这一问题, 各国都在积极致力于植物天然色素的研究与 开发。黑米在品种中属于名贵珍奇的特种类型,古为皇家专用贡品, 世人誉称“ 米中皇” , 是高营养多功能滋补保健食品。黑米不仅含有比普通稻米丰富得多 的蛋白质, 氨基酸组成也相当齐全高含种必需氨基酸, 还含有多种微量已素特 别是高含铁、维生素等, 而民在果皮中和部分品种的颖壳中含有大量天然黑紫 色素是黑紫色素的重要来源22。因此, 研究利用黑米开发天然黑紫色素, 对食 品、医药加工和化妆行业都具有重要意义。 2 实验设计与方法 2.1 实验材料 实验原料：黑米，柠檬酸、na2hpo4、无水乙醇均为分析纯。 2.2 主要设备 sk8200hp 超声波清洗器南京昕航科学仪器有限 公司；722n 可见分光光度计杭州天钊科技有限公司； fa1604n 电子天平上海精密科学仪器有限公司；shb- 循环水式多用真空泵上海金鹏分析仪器有限公司； re-52a 型旋转蒸发器上海青浦沪西仪器厂；sq2119 多功能食品加工机上海帅佳电子科技有限公司；zk- 82b 型真空干燥箱型号西安唯信检测设备有限公司。 2.3 试验过程与方法 2.3.1 工艺流程 黑米洗净烘干 粉碎 加入提取剂 超声浸泡提取 过滤黑色澄 清透明液体 减压浓缩回收提取剂 真空干燥产物 计算提取率 2.4 浸提条件的选择 研究超声波功率、乙醇浓度、料液比(黑米:乙醇溶液，m/v)及浸提时间对 黑米黑色提取率的影响，首先做单因素试验考察以上条件对提取率的影响，然 后采用正交试验法优化最佳工艺条件。用分光光度计测定吸光度，作为色素提 取率的标准。 2.4.1 乙醇浓度对黑米黑色素提取效果的影响 准确称取 2.5g 粉碎的黑米，在常温条件下，在超声功率 300w，料液比为 130，提取时间为 30min，乙醇浓度分别为 20%、40%、60%、80%、100%， 研究其对黑色素提取率的影响，在波长 543nm 处测定吸光度作为指标。 2.4.2 超声浸提时间的选择对黑米黑色素提取效果的影响 准确称取2.50g 粉碎的黑米，在常温条件下，取80%的乙醇溶液作为浸提 剂，料液比1:30，超声波频率300w，浸提时间分别为 10、20、30、40、50、60min，研究不同超声浸提时间对黑色素提取率的影响， 在波长543nm处测量吸光度作为提取指标。 2.4.3 超声功率对黑米黑色素提取效果的影响 准确称取 2.50g 粉碎的黑米，在常温条件下，在乙醇浓度为 80%，料液比 黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 3 为 130，提取时间为 30min，超声功率分别为 150w、200w、250w、300w、350w，在波长 543nm 处测量吸光度作为提取 指标。 2.4.4 料液比对黑米皮色素提取效果的影响 准确称取 2.50g 粉碎的黑米，在常温条件下，在超声功率 300w，乙醇浓 度 80%，提取时间为 30min，料液比分别为 1:10、1:20、1:30、1:40、1:50，研 究不同料液比对黑色素提取率的影响，在波长 543nm 处测量吸光度作为提取指 标。 2.4.5 最佳工艺条件的选择 在单因素试验的基础上，为了获得以乙醇作为浸提剂，超声波辅助提取黑 米中黑色素的最佳工艺条件，利用正交法“均衡分散”和“整齐可比”的特点， 以乙醇浓度、浸提时间、料液比、超声波功率 4 个因素为考察因素，以浸取样 品中的黑色素提取率为主要考察目标，采用 l9(34)正交表进行正交试验设计， 以确定最佳提取条件，测定浸提液吸光度作为提取指标。 3 结果与分析 3.1 影响黑米皮色素提取效果的单因素研究 3.1.1 乙醇浓度对黑米皮色素提取效果的影响 0 0.1 0.2 0.3 0.4 20406080100 乙醇浓度(%) 吸光光度值 图 1 乙醇浓度对黑米皮色素提取效果 由图 1 可见，乙醇浓度对提取率的影响较大，浓度为 80%的乙醇提取率最 高，其次是 60%，乙醇浓度较高或较低提取率都不佳。这主要是由于黑米黑色 素是由苷元与糖基构成，具有较强的极性，不同浓度的乙醇极性不同，根据 “相似相溶”原理，乙醇浓度为 80%时对黑米皮色素的溶解能力最强。 3.1.2 超声浸提时间的选择对黑米黑色素提取效果的影响 黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 4 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 102030405060 超声浸提时间(min) 吸光光度值 图 2 超声浸提时间的选择对黑米黑色素提取效果 由图 2 可见，随着超声浸提时间的延长，黑色素提取率随之升高，但时间 超过 30min 后，变化缓慢。因此选定浸提时间 30、40、50min 作为正交试验的 3 个水平。 3.1.3 超声功率对黑米皮色素提取效果的影响 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 150200250300350 超声功率(w) 吸光光度值 图 3 超声功率对黑米皮色素提取效果 由图 3 可见，随着功率增加，黑米皮色素吸光度值逐渐升高，而后略有下 降。超声波功率小，不能使物料充分受到超声波的作用，黑米皮色素提取不完 全，但在超声波功率高于 350w 后，变化趋势不再明显，甚至出现提取率下降， 这主要是由于超声波功率太大可能造成黑米皮色素降解，含量下降，因此选择 超声波功率 350w 为最佳。 黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 5 3.1.4 料液比对黑米皮色素提取效果的影响 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 1:101:201:301:401:50 液料比 吸光光度值 图 4 料液比对黑米皮色素提取效果 料液比的提高必然会在较大的程度上提高传质推动力。由图 4 可以看出， 随着液固比的增大，提取率也随之增大，当液固比增大到一定值后，提取率的 增加趋于平缓。同时液液比的增大也提高了生产成本及后续处理的难度，所以 料液比不宜太高，因此选择 1：40 比较合适。 3.2 多因素试验 3.2.1 正交试验 根据单因素试验的结果，选取影响黑米黑色素提取效果各因素中有意义的 水平做正交试验，对结果进行极差分析，以确定最佳的提取条件。采用l9(34)正 交表，以乙醇浓度a、超声浸提时间b、超声功率c、料液比d作为4个考察因素， 选取3个水平进行试验，其因素水平表见表1。按表1的正交因子水平设计l9(34) 正交试验，试验结果及分析见表2。 表1 正交试验因素与水平的设定 因素/水平 a 乙醇浓度 （%） b 超声浸提时间 (min) c 超声功率 (w) d 料液比 140302501：20 260403001：30 380503501：40 表2 黑米黑色素提取正交实验的结果l9（34） 因素乙醇浓度 （%） 浸提时间 （min） 超声功率 （w） 料液比吸光度值 111110.283 212220.365 313330.323 423230.237 521310.392 黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 6 622120.266 732320.373 833130.384 931210.272 k10.3240.5370.3110.316 k20.3280.5170.3210.335 k30.3430.5000.3630.345 r0.0190.0370.0520.029 从正交实验表的试验结果可知，影响黑米黑色素提取效果的主次顺序是超 声功率(c) 超声浸提时间(b) 料液比(d) 乙醇浓度(a)。因此得到的提取黑米 皮色素的最佳条件a3b1c3d3，即乙醇浓度为80%，超声浸提时间为30min，超 声功率为350 w，料液比为1：40。 3.2.2 黑米中黑色素含量的测定黑米中黑色素含量的测定 称取黑米 2.000g，用最佳条件进行提取，将提取液浓缩、干燥，从而得到 黑米中黑色素的粗品质量，进行 3 次平行试验。结果如下表 3。 表 3 黑米黑色素含量表 序号123 重量(g)252.52.5 料液比（g/ml）1:401:401:40 功率（w）350350350 时间（min）303030 乙醇浓度（%）808080 黑色素粗质量(g)0.0510.0490.046 得率(%)2.41.961.84 得率为： y=w/g100%=2.07% 其中：y-黑米黑色素的得率（%） ；g-黑米的质量（g） ；w-为黑米中提取 出来的黑色素的粗质量（g） 。 3.2.3 最佳工艺条件试验最佳工艺条件试验 按 a3b1c3d3条件进行 3 次平行试验，结果见表 4 所示。 表 4 a3b1c3d3条件下的得率（%） 试验123平均值 得率2.41.961.842.07 4.结论 首先进行了单因素试验，对影响超声波法黑米黑色素得率的四个因素：液 料比、乙醇浓度、超声时间、超声功率进行了研究。在单因素试验的基础上， 黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 7 用正交试验对黑米黑色素的提取工艺进行了优化设计。 正交试验设计采用四因素三水平的正交表l9(34)，确定了超声波法黑米黑色 素提取的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度：80%，超声浸提时间：60，超声功 率：128 w，料液比：1:40（gml） 。此时，多糖得率达到2.07%，结果还表明， 四个因素中超声功率(c) 超声浸提时间(b) 料液比(d) 乙醇浓度(a)。 黑龙江八一农垦大学本科毕业论文 8 参考文献 1温广宇,朱文学,天然植物色素的提取与开发应用j .河南科技大学学报，2003（6） ； 6865. 2张奇志,赖来展廖均元黑色食品的营养与功能研究进展j. 粮油食品科技,2006 ,14 (6) :11 14. 3赵肃清,孙远明.天然黑色素的研究进展j.广州食品工业科技,5355. 4江友兴,刘希贞,龙小黎.黑米成分分析与功能利用j.1999(8) . 5钟丽玉,胡秋林.黑米色素分子结构解析j .无锡轻工大学学报,1996 ,(1) :33 - 38. 6陆国权,吴小荣.黑豆皮色素的提取及理化性质的研究j.中国粮油学报,1997, (3) :53 - 58. 7王新平,李加新.黑糯米中黑色素提取方法的研究j .食品科学,1997,(2) :44 - 46.