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天津大学 硕士学位论文 全自动化学发光免疫分析仪 姓名：张建鹏 申请学位级别：硕士 专业：生物医学工程 指导教师：李刚 20050501 中文摘要 免疫诊断( i m m u n o d i a g n o s 惋) 技术是现代临床检验和生命科学研究的重 要手段之一，为肿瘤，糖尿病，性腺分泌异常，甲状腺功能障碍等疾病提供了 有力的诊断工具。传统使用的放射性免疫分析技术由于其手工操作复杂，反应 时间长，对环境污染性强而逐步被新兴的化学发光免疫分析技术所取代。而全 自动化学发光免疫分析仪的研制涉及到电子，机械，光学，计算机技术，生物 化学等多方面的高科技技术，仪器结构复杂，前期需要巨大的研发费用，目前 国内相关产品的研制尚处于起步阶段。 本文参照国外的相关化学发光免疫分析产品及技术，并针对国内目前状 况，进行了化学发光免疫分析仪的整体设计，并对加样系统、温度控制系统这 两个核心模块进行了具体的设计与实现。 化学发光免疫分析原理：以碱性磷酸酶标记的抗原或抗体为液相载体，以 抗原或抗体包被的塑料珠为固相载体，用底物( a m p p d ) 作为发光物质，进行 化学发光反应。 化学发光免疫分析系统由以下子系统构成：反应杯传送系统，测试包被珠 装载系统，样本装载系统，条码读取系统，试剂装载系统，加样系统，温育系 统，离心清洗系统，发光计数测量系统，计算机控制系统。 作者设计的化学发光免疫分析仪中的加样系统，采用了l 2 9 7 控制芯片与 l 6 2 0 2 电流驱动芯片进行电机控制，与传统的由口线直接模拟时序的控制方式 相比，在省去了复杂的相序编程控制的同时也获得更灵活和精确的控制；在与 加样系统相连的管路设计中，采用新颖的电磁阀流体控制技术实行液体的换向 控制，同时完成探针的加样与清洗，节省了时间，提高了效率；温度采集系统 采用1 8 位精度a d 转换芯片m a x l3 2 ，并采用p i d 算法对测温模块进行控 制，使温度控制精度可达到0 0 5 。 关键词：免疫诊断、化学发光、酶标记、加样、温度控制、p i d 算法。 a b s t r a c t i m m u n o d i a g n o s t i ct e c h n o l o g yi so n eo ft h em o s ts i g n i f i c a n tm e t h o d sa p p l i e di n t h em o d e mc l i n i c a ll a ba n dl i f e s c i e n t i f i cr e s e a r c h t h ei m m t m o d i a g n o s t i ci st h e p o w e r f u lt 0 0 1t od i a g n o s es u c hd i s e a s e sa st h et u m o r , d i 如e t e s r e p r o d u c t i v e a n d t h y r o i dg l a n d ，e t c t r a d i t i o n a lr a d i o a c t i v ei r m n u n o a s s a yi sg r a d u a l l yr e p l a c e db yn e w e m e r g e dc h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a yt e c h n o l o g yi nt h el a t e s td e c a d ey e a r sd u e t oi t sc o m p l i c a t e dh a n d w o r kp r o c e d u r e ，l o n gr e a c t i o nt i m e ( u pt o4 8h o u r s ) ，d i s p u t e d e n v i r o n m e n tp o l l u t i o n t h ef u l l a u t o m a t i cj n s t r u m e n td e s i g nj n v o l v e sm a n yh i 吐。t e c h a n di ns t r u c t u r e - c o m p l i c a t e df i e l d sl i k ee l e c t r o n s ，m a c h i n e r y , o p t i c s ，t h et e c h n o l o g yo f t h ec o m p u t e r , b i o c h e m i s t r y , e t c ，o t h e r w i s e ，e n o r m o u sr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n t e x p e n s e sw i l lh a v et ob ec o n s i d e r e di nt h ee a r l i e rs t a g e t h er e s e a r c ho fd o m e s t i c r e l e v a n tp r o d u c t si ss t i l la tt h es t a r t i n gs t a g ea tp r e s e n t t h i sp a d e rc o n s u l t sf o r e i g nr e l e v a n tp r o d u c t sa n dt e c h n o l o g y , a i m sa tt h ec u r r e n t d o m e s t i c s i t u a t i o n ，p r o p o s e s t h e i n t e g r i t yd e s i g n o ft h ec h e m i l u m i n e s c e n c e i m m u n o a s s a y t w ok e ym o d u l e s ，t h ep i p e t t i n gs y s t e ma n dt h et e m p e r a t u r ec o n t r o l s y s t e m ，a r ec o n c r e t e l yd e s i g n e da n dr e a l i z e d 强es y s t e mr e a c t i o np r i n c i p l e ：r e g a r d sa l k a l i n ep h o s p h a t e se n z y m ec o n j u g a t e d t op o l y e l o n a la n t i b o d yo ra n t i g e na st h el i q u i dp h a s ec a r r i e r , t h ea n t i g e no ra n t i b o d y c o a t e d p l a s t i cp e a r l a st h es o l i dc a r r i e r , t h es u b s t r a t e m p p d1 a st h e c h e m i l u m i n e s c e n c em a t e r i a l s ，t or u nt h ec l i n i c a la s s a y s t h ec h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e mi sm a i n l ym a d eo ff o l l o w i n gs u b s y s t e m ：t h e r e a c t i o nt u b ec o n v e y a n c es y s t e m ；t e s tu n i tl o a d i n gs y s t e m ；t h es a m p l el o a d i n gs y s t e m ； t h eb a rc o d es c a n n i n gs y s t e m ；t h er e a g e n tl o a d i n gs y s t e m ；p i p e t t i n gs y s t e m ；w a s h s y s t e m ；c h e m i l u m i n e s c e n c ec o u n t i n gs y s t e m ，c o m p u t e rc o n t r o ls y s t e m t h ep i p e t t i n gs y s t e ma d o p t st h ec o n t r o lc h i p l 2 9 7a n dt h ee l e c t r i cc u r r e n td r i v e r c h i p l 6 2 0 2t od r i v et h es t e pm o t o r s ，o t h e rt h a na p p l y i n gt h ec o m p l i c a t e dp r o g r a m c o n t r o lu s e dw i t hd s p ( d i g i t a ls i g n a lp r o c e s s i n g ) t h ep i p e l i n et h a ti sl i n k e dt ot h e p i p e t t i n gs y s t e ma d o p t st h ee l e c t r o m a g n e t i cv a l v et oc o n t r o lt h ed i r e c t i o no f t h ef l u i d ， t h ep i p e t t i n gs y s t e mc a na c c o m p l i s ht h ep i p e t t i n ga n dw a s h i n gp r o c e d u r ei no n ec y c l e ； t 1 1 c18 - b i t sh i g hp r e c i s i o na dc h i pm a x l3 2i su s e di nt h et e m p e r a t u r ec o l l e c t i n g ， t h ep i d ( p r o p o r t i o n a l i n t e g r a l d i f f e r e n t i a l ) a l g o r i t h mi sa p p l i e dt ot h et e m p e r a t u r e c o n t r o ls y s t e m ，t h et e m p e r a t u r ec o n t r o lp r e c i s i o nc a nb eu pt o0 0 5 k e yw o r d s ： i m m u n o d i a g n o s t i c ，c h e m i l u m i n e s c e n c e ， e n z y m e c o n j u g a t e d ，p i p e t t i n g ，t e m p e r a t u r ec o n t r o l ，p i da l g o r i t h m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特剐加以标注和致谢之处外，论文中刁i 包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁壅盘芏或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：孑南) 毛廊扬签字日期：埘年十月1 1 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘茔有关保塑、使用学位论文的规 定。特授权盘注盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同 意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：凇，曷 导师签名 签字日期：训年，月为日 签字目期：z 舢夕年夕月z 莎日 移 天津大学硕士论文 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 免疫诊断技术是现代临床检验和生命科学研究的重要手段之一。免疫诊断 学( i m m u n o d i 8 , g n o s i s ) 基于抗原一抗体免疫反应原理，是诊断肿瘤、糖尿 病、性腺系统疾病、甲状腺疾病等疾患的有力工具。 抗原一抗体的特异性结合反应是免疫学诊断的基础。许多动物在受到外来抗 原的刺激后便会产生相应的抗体，利用已知抗原或已知抗体可与其对应的抗体 或抗原特异性结合，如果反应结果在体外可直接被观察到，如反应中有沉淀、 浑浊等现象出现，便可直接用于临床抗体的检验诊断，一些早期的免疫诊断技 术就以此为理论基础建立起来的。在早期的免疫诊断技术当中，有些项目由于 操作上的简便易行而仍在广泛使用，如血型鉴定、抗精子抗体检查等。但是， 大多数已被敏感性更高的标记免疫技术所代替。由于更多的抗原一抗体的特异性 结合反应人们无法直接探知，于是便出现了通过对抗原或抗体进行各种各样的 标记来显示有无抗原一抗体的特异性结合反应的发生，这就是近年来被广泛使用 的标记免疫检测技术，如放射免疫技术、酶标记免疫技术、荧光免疫技术等 等。通过使用标记物不但使许多原来无法直接探测到的免疫反应可被探知，而 且使免疫检测技术的敏感性得到提高。此后单克隆抗体技术的出现使抗原一抗体 结合反应的特异性检测技术有了进一步大幅度提高。近年来随着计算机技术高 速发展及各种新型传感器的应用使自动化、智能化、高效率、高精度及多参数 测量等成为免疫检测技术发展的方向发展。 化学发光放大技术同样利用抗原抗体反应原理，将酶或其他非放射性标记 物标记于抗原或抗体，然后与已知抗原或抗体反应，标记的酶使反应底物进行 发光，经光电倍增管测量后可得到被测样本的每秒钟发光计数( c p s ) ，再根 据内置的标准曲线将c p s 转换为样本的浓度值。由于这项技术的应用，使抗 原抗体的反应时间缩短，特异性程度和灵敏度得到提高，同时辅以单克隆技术 的应用，使整个反应的全自动化实现成为可能，并一改过去依赖于手工加样， 再交由仪器测量的半自动化技术的局面，也是近十年来免疫检验技术的一个飞 跃。目前国内尚无自主研制的全自动免疫发光仪的成熟产品，此类仪器长期被 国外公司如b e c k m a n ，b a y e r ，r o c h e 以及d p c 等公司垄断。本文在参照一 些国外同类仪器的基础上，设计了一套全自动化学发光系统，并对部分核心模 块的功能进行了模拟实验，经在机实验证实可完全满足临床检验实验要求，同 时相信对国内同类全自动免疫分析仪的开发有参考价值。 天津大学硕士论文 第一章绪论 1 2 免疫诊断技术的发展历程 1 2 1 放射免疫测定( 鼬a ) 由于化学发光免疫分析技术是由放射免疫技术来的，在谈到化学发光免疫 技术之前，让我们首先回顾一下放射免疫测定技术的发展历程、测试方法及特 点。 放射免疫测定( r a d i oi m m u n o a s s a y ，r i a ) 是1 9 5 9 年y a l o w 和b e r s o n 首 先创建的经典放射免疫分析技术，用于血清中胰岛素含量的测定，其原理框图 如图1 1 所示。四十多年来，由于此项技术灵敏度高、特异性好、并已制成多 种标准试剂盒，使用方便而得到了十分广泛的应用。目前国外已成功地应用 r i a 检测的物质多达3 0 0 余种，国内研究的被测物质也达百余种，试制的r i a 试剂盒已有6 0 余种，是测定各种微量物质不可缺少的手段。 r i a 是标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合或竞争性抑制反 应。在r i a 反应系统中，标记抗原( a g ) 、末标记抗原( a g ) 和特异性抗体( a b ) 三 者同时存在时，由于两种抗原具有相同的决定簇，互相竞争结合抗体的能力相 同，结果形成a g * - a b 和a g - a b 复合物。 图1 1 抗原- 抗体结合反应示意图 当a g 和a b 的量固定时，二者结合形成免疫复合物就受到a g 含量的制 约。如反应系统中a g 含量高时，对a b 的竞争结合能力就强，a g - a b 复合物 的形成量就增加，a g - a b 复合物则相对减少：反之，当a g 含量低时，对a b 的竞争结合能力弱，a g + - a b 复合物的形成量即增多。因此，a g + 一a b 复合物的 形成量与a g 含量之间呈一定的负相关函数关系。 天津大学硕士论文 第章绪论 r i a 的优点： 成本底、灵敏度高； 不受周围环境和样本干扰物质的影响： 与小颗粒同位素的结合不影响免疫反应和； 具有完善的放射测量体系； - 但其缺点也是显而易见的： 同位素的半衰期使货架期短，试剂盒不易储存； 反应时间过长，并且反应时间不，不易实现自动化； 结合于抗原或抗体分子上的1 1 2 5 碘分子数量有限，过高会引起结合物的 自照射雨分解，影确试裁的使弼；购买以及废物处理等均引起一定的辐射安全 问题，虽然r i a 涉及的放射性较小，但仍会面临公众的反核的负面的影响；同 时，临床医学要求快速诊断的呼声不断增高，使r i a 面临进一步挑战。 1 2 2 化学发光技术的建立 l 、化学发光技术的定义 化学发光技术是近十几年来发展起来的一种测定方式，利用化学反应释放 的自由能激发中间体( 常用碱性磷酸酶一金刚烷胺) ，使其从激发态回到基态， 当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子，通过对光子进行测定而进 行定量分析。化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，从而避免了荧 光分析中激发光杂数光的影响，有很高的灵敏度：并且不象放射分析那样存在 强烈的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。 2 、化学发光免疫技术的前身 化学发光免疫技术的前身可以称为酶免疫分析技术，酶作为催化特异反应 的一种生物蛋白，由于其催化作用，使反应物得以高度转换，具有很大的放大 效应。酶探测频率颇高，平均个酶分子一秒内产生一千分子的有色荧光或发 光物质。19 6 6 年a v r a m e a s 和u r i e l 首先将酶偶联应用于抗原和抗体；随后在 1 9 7 4 年，s y v a c o 首先报道了e i a 分析，即均相“酶测免疫分析”( e n z y m e m o n i t o r e di m m u n o a s s a y ) ，开创了酶免疫分析的临床应用。虽然酶免疫技术 不是真正的化学发光技术，但其为化学发光技术的应用奠定了良好基础。 3 、化学发光技术的应用 1 9 7 8 年s c h r p e d e r 在r i a 和e i a 基本理论的基础上，以化学发光信号示 踪，建立了化学发光免疫分析( c l i a ，c h e m i l u m i n e s e n ti m m u n o a s s a y ) 技术。 因其具有和r i a 相似的灵敏度和特异性，受到国内外学者的重视，并投入了相 当的人力和资金对该方法进行研究，并制造测量仪器。大量的实验结果证明， 大津大学硕十论文第一章绪论 r l a 的优点： 成本底、灵敏度高； 不受周围环境和样本干扰物质的影响； 与小颗粒同位索的结合不影响免疫反应和； 具有完善的放射测量体系； 但其缺点也是显而易见的： 同位素的半衰期使货架期短，试剂盒不易储存： 反应时闻过长，并且反应时间不一，不易实现自动化； 结合丁抗原或抗体分子上的l ”5 碘分子数量有限，过高会引起结合物的 自照射而分解，影响试剂的使用；购买以及废物处理等均引起一定的辐射安全 问题，虽然r i a 涉及的放射性较小，但仍会面临公众的反核的负面的影响；同 时临床医学要求快速诊断的呼声不断增高，使r i a 面i 擒进一步挑战。 1 2 2 化学发光技术的建立 l 、化学发光技术的定义 化学发光技术是近十几年来发展起来的一种测定方式，利用化学反应释放 的自由能激发中间体( 常用碱性磷酸酶一金刚烷胺) ，使其从激发态回到基态， 当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子，通过对光子进行测定而进 行定量分析。化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，从而避免了荧 光分析中激发光杂散光的影响，有很高的灵敏度；并且不象放射分析那样存在 强烈的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。 2 、化学发光免疫技术的前身 化学发光免疫技术的前身可以称为酶免疫分析技术，酶作为催化特异反应 的一种生物蛋白，由于其催化作用，使反应物得以高度转换，具有很大的放大 效应。酶探测频率颇高，平均个酶分子一秒内产生一千分子的有色荧光或发 光物质。1 9 6 6 年a v r a m e a s 和u r i e l 首先将酶偶联应用于抗原和抗体；随后在 1 9 7 4 年，s y v a c o 首先报道了e i a 分析，即均捌“酶测免疫分析”( e n z y m e m o n i t o r e di m m u n o a s s a y ) ，开创了酶免疫分析的临床应用。虽然酶免疫技术 不是真正的化学发光技术，但其为化学发光技术的应用奠定了良好基础。 3 、化学发光技术的应用 1 9 7 8 年s c h r p e d e r 在r i a 和e i a 基本理论的基础上，以化学发光信号示 踪，建立了化学发光免疫分析( c l i a ，c h e m i l u m i n e s e n ti m m u n o a s s a y ) 技术。 因其具有和r i a 相似的灵敏度和特异性，受到国内外学者的重视，并投入了相 当的人力和资金对该方法进行研究，并制造测量仪器。大量的实验结果证明， 当的人力和资金对该方法进行研究，并制造测量仪器。大量的实验结果证明， 天泮大学硕十论文 第一章绪论 c l i a 因光信号持续时间太短，达不到i 临床应用水平。为解决测量方法上的缺 点，一些学者进行了发光稳定剂的研究，9 0 年代初首先由英国a m e r s h a m 公 司研究人员发现在h r p 催化的l u m i n o l 发光反应中加微量对一碘酚，可以使发 光信号持续2 0 3 0 分钟。随后生产出试剂盒。标示了化学发光技术进入了临 床应用的开端。 4 、标准曲线 标准曲线是免疫反应中一个基本概念。它是一个线性方程式，能够最佳反 映c p s 信号与待测物浓度之间的相互关系。 每一个批号试剂提供的主标准曲线是在单一仪器上通过下列方式完成的： 因分析物和检测范围的不同，选择不同的标准点数量，如t 4 试剂盒( 检测范 围1 2 4 u g d l ) 设置6 个标准点，而t s h ( 检测范围0 0 0 2 7 5 u l u m l ) 设置 1 5 个标准点；每一个标准点随机选取大数量的复制品进行多次运行，每次运行 均同时运行质控血清和低、高浓度校正液的复制品。 绝大多数免疫检测标准曲线都能够与四参数l o g l o g i t 方程式相适应，通 过对检测标准物得到每一个标准水平的光信号进行计算，拟和出一条主机c p s 信号与待测物浓度相关的曲线，即标准曲线。计算机运算法则使用公认的曲线 适应程序以达到最佳的曲线拟和。 在实际的测量中，待测样本和标记的已知抗原或抗体结合后，促使底物发 光，由p m t ( 光电倍增管) 得到发光计数，然后参照标准曲线计算即可得到待 测样本的浓度值。 1 3 国际主流化学发光免疫分析仪的原理、技术及特点 随着免疫学的不断发展，新的免疫学技术不断出现，如化学发光技术、时 间分辨荧光免疫测定技术、荧光偏振免疫分析测定技术等，促进了免疫检测的 自动化，一大批先进的自动化免疫分析仪应运而生，它们的出现不仅减轻了工 作人员的劳动强度，而且缩短了分析流程，提高了实验结果的精确度和准确 性，灵敏度更是达到n g 甚至p g 水平，在内分泌激素、血浆特种蛋白、肿瘤标 志物、维生素、体内药物浓度的快速测定中起着重要作用。 各种现代化免疫分析仪都使用一种或两种新的免疫分析技术，如：酶联免 疫分析技术、生物素一亲和素技术、化学发光分析技术、荧光偏振技术、时间 分辨荧光免疫测定技术、电化学发光技术等，使免疫检验手段更先进、方法更 可靠、结果更准确、可与放射免疫分析技术相媲美。下面就国内外常见的自动 化免疫分析仪采用的分析原理作一介绍。 天津大学硕士论文 第一章绪论 1 3 ，1 微粒子捕捉酶免疫分析技术( m e i a ) 下面以双抗体夹心法为例介绍微粒子捕捉酶免疫分析技术：已包被了抗体 的塑料微珠试剂中，加入待测标本后，经温育，再加入碱性磷酸酶标记的抗 体、形成抗体一抗原一酶标记抗体复合物。然后将其转移到玻璃纤维柱上，p 日 缓冲液洗涤，没有结合的抗原、酶标抗体被洗掉，结合抗原抗体的塑料微珠则 被保留在纤维柱滤膜的上方。这时再加入底物，4 甲基伞型酣磷酸盐( 4 一m u p ) 。 酶标抗体上的碱性磷酸酶将4 m u p 分解，脱磷酸后形成甲基伞型酣( 4 m u ) ，在 3 6 5 n m 激发光的照射下，发出4 4 8 n m 的荧光，经过荧光读数仪的记录、放 大，计算出所测物质的含量。 1 3 2 荧光偏振免疫分析技术( f p i a ) 这是一种均相荧光免疫分析法，主要用于测定小分子量物质，如药物浓度 测定。原理是：标记在小分子抗原上的荧光素经4 8 5 n m 的激发偏振光照射 后，吸收光能，越入激发状态，激发状态的荧光素不稳定，很快以发出光子的 形式释放能量而还原。发射出的光子经过偏振仪形成5 2 5 5 5 0 n m 的偏振光， 这一偏振光的强度与荧光素受激发时分子转动的速度呈反比，游离的荧光素标 记抗原，分子小，转动速度快，激发后发射的光子散向四面八方，因此通向偏 振仪的光信号很弱，而与抗体大分子结合的荧光素标记抗原，因分子大，分子 的转动慢，激发后产生的荧光比较集中，因此偏振光信号比未结合时强得多。 在测定过程中待测抗原小分子、荧光标记抗原小分子和特异性抗体大分子同时 加入到一反应杯中，经过温育，待测抗原和荧光标记抗原竞争性地与抗体结 合，待测抗原越少，与抗体竞争结合的量越少，而荧光标记抗原与抗体结合量 就越多，当激发光照射时，荧光偏振的程度与荧光标记物分子转动的速度成反 比，而荧光标记的小分子抗原与大分子抗体结合后，其分子的转动速度减慢， 因此荧光偏振信号强。结果是待测抗原的浓度低，可以通过计算获得其含量。 1 3 3 利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术相结合 此方法以吖啶酶为发光的标记物，固相载体为极细小的磁性颗粒。其测定 原理与放射免疫和酶联免疫中的双抗体夹心法和竞争结合法相似。 1 3 4 采用酶联免疫技术、生物素亲和素技术和增强化学发光技术 此方法是用辣根过氧化物酶( h r p ) 标记抗原或抗体、以子弹头型塑料小孔 管为固相载体，鲁米诺为化学发光剂，并加入化学发光增强剂，可使化学发光 天津大学硕士论文 第章绪论 强度增强、时问延长而且稳定。下面简单介绍其u t 作原理。 在链霉亲和素包被的子弹头型塑料小孔管中，加入生物素标记的特异性抗 体和待测标本，经过3 7 。c 温育，链霉亲和素与生物素结合，特异性抗体与标本 中的抗原结合，形成链霉亲和素一生物素一抗体一抗原复合物，经过洗涤，将 多余的标本和生物素标记抗体除去。 加入辣根过氧化物酶标记抗体，经3 7 温育，形成链霉亲和素一生物素一 抗体一抗原一酶标抗体复合物，并固定在小孔管壁上。 加入氧化剂h 2 0 2 ，增强化学发光剂和鲁米诺，这时结合在固相载体上的辣 根过氧化物酶在强氧化剂的作用下将增强化学发光剂亚铁原吟琳激活，接着它 催化并激活鲁米诺发光，这种化学发光强渡比单独鲁米诺发光强，持续时间 长，而且稳定，易于测定。 鲁米诺发光强度经光量子记录系统记录，经计算从标准曲线上得出待测抗 原含量。 1 4 本课题的内容与研究意义 传统使用的放射性免疫分析技术由于其手工操作复杂，反应时间长，对环 境污染性强而逐步被新兴的化学发光免疫分析技术所取代。而化学发光免疫分 析技术作为近十n - - 十年新起步的技术，涉及到电子、机械、光学、计算机技 术及生物化学等多方面的高科技技术，仪器结构复杂，前期需要巨大的研发费 用。目前国内对本系统的研制尚处于起步阶段。 本课题针对以上现状，旨在研究并设计出一种成熟的全自动化学免疫分析 仪，但由于化学免疫分析仪结构复杂与时间限制，本文主要针对其进行整体方 案设计，并对系统核心模块一加样系统、温度控制系统，进行了硬件设计与软 件设计。 本文第一章介绍了免疫反应的特点和应用领域，回顾了传统的放射免疫测 定技术的发展历程、测试方法及特点，并简单介绍了当前先进的化学发光免疫 分析技术的特点及发展，以及当前几种国际流行的化学发光检测原理。第二章 对化学免疫分析仪的整体模块设计与控制进行了详细说明，并介绍了如何通过 计算机控制系统完成各模块之间的协调与配合。第三章研究了加样系统的控 制，并重点介绍了采用l 2 9 7 控制芯片与l 6 2 0 2 电流驱动芯片的协同工作，对 加样电机进行控制，阐述了液面探测原理并完成液面探测电路的设计。第四章 主要是对温度控制系统的研制。设计开发了一套制冷系统，将其用于试剂的制 冷中；温育室温度的采集采用1 8 位精度n d 转换芯片m a x l 3 2 ，并采用p i d 算法对温度模块进行控制。第五章对系统整体软件构架进行设计。第六章主要 6 - 天津大学硕士论文第一章绪论 是对本设计的总结以及对后续的开发工作提出建议。 天津大学硕士论文 第二章化学发光免疫分析仪的整体设计与控制 第二章化学发光免疫分析仪的整体设计与控制 2 1 化学发光免疫分析仪的原理 本文采用的技术是基于固相的化学发光免疫方法。固相是基于聚苯乙烯材 质的小圆珠，包被上抗原或抗体，然后装入小测试杯中。病人血清( 含有待测 项目的抗原或抗体) 和碱性磷酸酶标记的试剂同时加入到测试杯中，在3 7 的环境中进行3 0 分钟( 或6 0 分钟) 的温育，并伴有间歇振荡。在这期间中，血 清中抗原( 或抗体) 和试剂中的碱性磷酸酶标记的抗原( 或抗体) 与包被珠上 的定量的抗体( 和抗原) 进行竞争( 或夹心) 结合反应。没有结合的反应物经 过离心后被分离出去。然后将底物加入，进行第二次温育。 化学发光底物( c h e m i l u m i n e s c e n c es u b s t r a t e ) ，在有碱性磷酸酶存在的 情况下发生水解( h y d r o l y s i s ) 进入不稳定态。这种持续的不稳定态使能量以 光子的形式释放出来。水解反应化学反应如图2 1 所示。 o 0 碱性礴酸酶赶一0 娟! ：蛳 札 嚼_ 繁 a m p p da m p d 垒刚靛光 图2 - 1 化学发光水解反应化学反应方程式 温育约1 0 分钟后，水解反应基本完成，光电倍增管将释放的光子读取出 来，然后根据标准曲线转换成浓度值。从而完成对参加反应的抗原( 或抗体) 的定量测定。 系统主要采用的核心技术为高速离心清洗技术与化学发光免疫分析技术。 下面分别进行详细说明： 1 、 高速离心清洗技术 设计包被珠直径为o 2 5 英寸，反应杯直径稍大于包被珠。将反应杯进行 一8 天津大学硕士论文 第一章化学发光免疫分析仪的整体设计与控伟f 高速离心旋转，如图2 - 2 所示。 图2 - 2高速离心示意图 采用以上设计，当角度越大或离心转速越快时施加与液体的压力越大：当 转速大于3 5 0 0 r p m 时，施加与液体的压力开始等于液体的重力，液体开始上 升：当转速大于1 0 0 0 0 r p m 时，施加与液体的压力突破了液体的表面张力开始 上升，进入到废液槽内，实现了竞争反应中未反应抗原( 或抗体) 的分离。然 后再加入发光底物，进行水解反应，通过测量光子计数，计算血清中抗原( 或 抗体) 含量。 2 、 化学发光免疫分析技术 采用酶放大的化学发光计数，反应原理如图2 ，3 所示。 e n z y m ea m p l i f i e dc h e m i l u m i n e s c e n c e 厦尸为羁r 。气 山 ，i 硝毪 t h o u s o n d so f l i g h te v e n t s p e rb i n d i n ge v e n t 图2 - 3酶放大的化学发光计数示意图 金刚烷与碱性磷酸酶结合后，金刚烷脱去磷酸根，空间结构变得不稳定， 在3 7 环境下，氧共价键断裂，能量以光子形式释放出来。这种依靠碱性磷 酸酶及发光底物的检测方式使可检测的下限低至1 0 - 2 1 m o l e s ，这比直接标记 更有意义。如果利用吖啶酯直接作标记，每一个标记的抗原抗体的结合只会产 【 天津人学硕士论文第二章化学发光免疫分析仪的整体、设计与控制 生一个到二个光子，并且发光时间较短，最k 只能达到1 秒钟，随后急剧衰 减，大大增加了测量的误差；而采用酶标记做方法，每个抗原抗体的结合可广 生几千个光子，并且可持续稳定的发光长达2 0 分钟，便于仪器的多次测量以 提高测量的精度。 2 2 化学发光免疫分析系统设计框架 基于化学发光的基本原理，本节对化学免疫分析系统进行总体设计，并定 义各个功能模块的设计要求与工作方式。下面从化学发光免疫分析系统组成， 系统框图，与各个子系统详细功能设计三方面进行讨论。 2 2 1 化学发光免疫分析仪组成 本文在设计的化学发光免疫分析仪时，主要从以下几个方面进行考虑。 1 、提高自动化程度 自动化程度是指在人发出指令后，仪器能够独立完成工作的程度。例如半 自动化分析仪器可以自动完成温育，测量以及打印结果等步骤；全自动化仪器 可以完成从加样到结果打印的全部过程。除此以外，全自动化程度还包括许多 其他的内容，例如单位时间内能够处理样本的能力，可以同步分析的项目数目 等。总之，对于一台免疫分析仪器来说，自动化程度越高，仪器的功能也就越 强。 2 、提高分析效率 分析效率是指在测定方法相同的前提下，分析仪的分析速度。分析速度取 决于每次测定中可测样品的多少和可测项目的多少。一次可以测量多个样本以 及多个项目，则大大节约了更换样本和试剂的时间，提高了分析效率。 对于不同类型的全自动化学发光免疫分析仪，由于其反应原理不同，仪器 结构存在差异，造成的自动化程度有相当大的差异。全自动化学发光免疫分析 仪的分析速度一般用“t e s t h ( 测试j 、时) ，如果要考证它的实际速度，同时也 要考虑到仪器一次可容纳的样品数以及可测试项目的多少。当前一台全自动化 学发光免疫分析仪器的测定速度为9 0 t e s t h 到2 4 0 t e s t h 。 3 、提高精度和准确度 全自动化学发光免疫分析仅的测定精度和准确度取决于仪器各个模块( 如 加样模块，温度控制模块，洗涤模块，以及测量模块等) 的加工精度和精确的 工作状态。例如分析仪采用的液体加样探针，一般采用电容式感应液面，准确 吸样，使样品的携带率低于5 ，不仅仅能准确的吸取微量样品，同时具有样 天津大学硕士论文第二章化学发光免疫分析仪的整体设计与控制 本堵塞探测功能，这也提高了加样的精度。此外，各个厂家为了提高抗交义污 染的能力，采用了许多新型的设计。加样探针内壁采用特弗龙( t e f l o n ) 材 料，可以减少样本的携带，注射器采用双精度注射器，大大提高了加样精度。 另外，不同清洗方法的使用，也对提高测量精度有极大的促进作用。 针对以上考虑，本文设计的全自动化学发光免疫分析仪主要有以下几个子 系统构成： l 、条码系统 样本和试剂的自动条码识别系统，是完成实验室自动化不可缺少的一个环 节，它不但能够保证样本检验的正确性，提高系统的工作效率，而且是实验室 管理网络化的必要条件 2 、试剂冷却槽 由于试剂对温度的变化较为敏感，一般情况下试剂保存的温度为4 - 8 。c ， 并且实验室要求试剂能够在机稳定保存9 0 天，2 4 小时在机保存。 3 、样本装载系统 一般要求同时装载样本6 0 个以上，加样探针可以随时进入任意一个位置 加样，每个样本位置可以适应不同规格的样本试管。 4 、 反应杯装载系统 一般要求装载反应杯容量在1 0 0 0 个以上，反应杯可根据加样需要随时供 给系统使用，并将反应杯传送到需要的位置上去。 5 、加样系统 是实现系统全自动化的基础。如果仪器缺少加样系统，则不能称之为全自 动化系统。加样系统由加样探针，x 轴及y 轴向电机，管路，流向控制阀门 以及注射器组成，是整个仪器中较为复杂的部分。 6 、温育系统 保证抗原抗原在要求的温度下进行反应，一般情况下抗原抗体的反应温 度为3 7 。 7 、洗涤系统 抗原一抗体反应完毕后，在加入发光底物之前，需要将多余的血清以及未 反应的抗原一抗体洗掉，以免其影响后续的发光计数的测量。 8 、测量系统 由p m t ( 光电倍增管) 直接测量，无需外界光源，无本底计数的干扰， 测量精度较高。 9 、l i s 接口 可以将测量的实验结果直接根据l i s 协议，直接经由串口传输到实验室中 天津大学硕士论文 第二章化学发光免疫分析仪的整体设计与控匍 心网络系统。 2 2 2 系统结构框图 图2 - 4 给出了化学免疫分析仪设计的整体框图。 匿 一样本杯传送系统卜 条形码扫 描系统 试剂转载系统( 古 制冷) 包被珠装载系统 譬囊k 甍犁璺| n 厂i 磊漾 h 厂i i 鬲 包。笔翟吩到e | 4 磊8f = v l 震篆磊 反应杯| l 轨 l ! ! 竺：! ! f 显示器 r _ 厶= i _ 一1 匣应杯进入系统1l 竺兰 图2 4化学发光免疫分析仪系统设计框图 2 2 3 各部分实现功能与设计简介 发光计数i 测量系统i 耍 接口部仲i 卫二 p c 1 、反应杯进样模块 反应杯进样模块从储存槽中取出反应杯，并对它们调整方向，然后将它们 传送到加样位置。进样模块执行如下功能： 在加样期间，需要有空的反应杯不断供给加样模块，并通过电机带动链条 将反应杯传送到相对应的加样位置。进样模块的储物槽能够存储一定量的反应 杯( 通常最大量为1 0 0 0 个测试左右) ，然后反应杯通过由直流电机带动的升 降梯将反应杯逐个送入反应杯输送滑道，滚轮毛刷( 由直流电机带动) 将进入 滑道的反应杯调整位置，然后通过步进电机驱动的转盘，将反应杯停靠在包被 珠加样位置，包被珠随后被释放入反应杯，在转盘电机的带动下，将反应杯放 置在进样链条上，由进样链条将反应杯传送到样本及试剂加样位置。 2 、加样模块 加样模块是仪器实现由半自动化向全自动化转化的关键部分，其功能实现 的完善直接影响到实验室的工作效率。 加样模块由x 轴电机，z 轴电机以及注射器等模块组成，同时加上液面探 测电路，探针堵塞电路，加样臂阻塞电路等。是本课题的重点设计部分。 1 ) 试剂加样：z 轴电机在h o m e 位置将探针向上移动一段距离，x 轴电 机转动加样臂由h o m e 位置移至试剂位置，探针在注射器的带动下吸取一定 量试剂后( 根据内设参数表，不同种类测试需吸取不同的试剂量) ，随后再将 探针在x 轴方向转动到b l i n d 位置对探针外壁进行清洗，接着将探针移动到反 天津大学硕士论文第二章化学发光免疫分析仪的整体设计与控甫 应杯位置将试剂加入到反应杯中去，最后探针在x 轴电机的驱动下移动到清 洗位置将探针进行清洗。 2 ) 样本加样：z 轴电机在h o m e 位置将探针向上移动一段距离后，x 轴 电机转动加样臂由h o m e 位置至样本位置，探针在注射器的带动下吸取一定 量样本后( 根据内设参数表，不同种类测试需吸取不同的样本量) ，随后再将 探针在x 轴方向转动到b l i n d 位置对探针外臂进行清洗，接着将探针移动到 反应杯位置将试剂加入到反应杯中去，最后探针在x 轴电机的驱动下移动到 清洗位置将探针进行清洗。 3 、样本转盘 样本转盘上放置6 个可移动的托架，每个托架可放置1 5 个样本管。转盘 可旋转3 6 0 度，并能被条码扫描器识别每个样本管的条码，并根据需要，可 将任意位置的血清管转到加样位置，并具有“刹车”装置。样本条码扫描器可 识别多种制式的条码。操作者可在任意时间随意更换样本托架。 样本托架可适应以下两种类型的样本管： 原采血管； 次级采血管( 将血凝脂去掉，只保留血清) 。 4 、试剂转盘 可同时装载2 4 种试剂。由于试剂对温度的变化较为敏感，试剂转盘放置 在冷却仓内，仓内有内置的冷藏冰箱将试剂保存4 8 。c ，试剂在机可稳定9 0 天；探针加样时转盘在驱动电机的带动下可移动到任意的位置；外置的条码扫 描器( 与样本转盘共用) 可将条码信息扫描出并存储于计算机内，可方便操作 者随时将试剂取出或更换新的试剂。图2 - 5 给出了试剂转盘图示。 图2 - 5试剂转盘 5 、包被珠托盘 可同时装载2 4 种测试包被珠，设计上类似于试剂转盘。由于包被珠为包 被在玻璃珠上的抗体或抗原，对湿度较为敏感，长期在潮湿环境存放下容易变 性，故将包被珠转盘放在除湿仓内( 2 4 小时保持湿度小于2 0 ) 。每种包被珠 犬津大学硕士论文 第二章化学发光免疫分析仪的整体设计与控制 都封装在楔形的塑料盒内，然后环形摆放在包被珠托盘上。安装在包被珠转盘 旁的c c d 条码扫描器将条码扫描后储存到计算机中。根据需要，在加样前， 包被珠会转动到相应的位置，在直流电机的推动下，将包被珠加到反应杯中 去。 6 、离心模块 当样本中的抗原( 或抗体) 以及试剂中的抗原( 或抗体) 与包被珠上的抗 体( 或抗原) 反应完毕后，未参与反应的物质需要被分离出去，通常采用的与 法是用蠕动泵将未反应物直接吸掉，这种方法的缺点是不能将反应物吸干净， 大大降低了实验的灵敏度。本文在设计中采用高速离心的方式，将包被珠在反 应杯中高速离心，离心过程中加水清洗，然后再离心，此过程反复5 次。实验 证明这是种非常高效的方法，用t s h 进行实验，测量精度，