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Patch clamp膜片钳实验学习资料Patch clamp膜片钳实验学习资料2011-06-03 10：26历史19761981年期间，两位德国细胞生物学家Erwin和Bert Sakmann所开创的膜片钳技术(patch clamp technique)为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化.两位科学家1991年荣获诺贝尔生理或医学奖.膜片钳技术是经微弱电流信号测量为基础的，利用玻璃微电极与细胞膜封接，可测量多种膜通道电流，其值可小到pA(10-12A)量级，是一种典型的低噪声测量技术.应当注意，为测量膜通道电流，必须将膜钳制于某一固定的电位上.理论生物电信号测量基础电路中，基本组成元件为电阻器(R)、电感器(L)和电容器(C).在生物系统中，电流的值很微弱(pA,10-12AnA,10-9A).当细胞膜Na+通道开放时，一毫秒有104Na+跨膜，相当于1.6pA.生物测量电路中存在两种导电机构(电子和离子)，需特制的电极和导电液体作为二者导电的接口.生物体中的电阻器和电容器等元件，可用欧姆定律描述，但呈严重非线性特性时，用曲线描述.几个基本定律：欧姆定律：电流I流经一电阻R时，将在其两端产生电位差V=IR基尔霍夫电流定律(KCL)：电路中，任何时刻，对任一节点，所以支路电流的代数和恒等于零.基尔霍夫电压定律(KVL)：电路中，任何时刻，沿任一回路内所有支路或元件电压的代数和等于零.电导器：电导是电导器对电流导电性能的电学量，用符号G表示，单位为西门子(S).而电阻是电路中电阻器对电流呈现阻力的电学量，用符号R表示，单位为欧姆(W).这两个电学量具有互补意义，互为倒数，即G=1/R.一个无穷大的电阻，其电导为零.电容器：电容是储存电荷的电容器的电学量，用符号C表示，单位为法拉(F).电容器的电容量与极板面积成正比，与极板之间的距离成反比，还与绝缘层的介电性质有关.当电容器两极板之间施加电压V时，则所存储的电荷Q=CV(单位：C-法拉，V-伏特，Q-库仑).细胞膜的电容常表示为每单位面积的电容量(比电容)，几乎所有的脂质双分子层约有1mF/cm2的电容量.在电容器两端外接电压时，两极板之间将产生电场.细胞膜厚度约为10nm，若电压为100mv，则在膜产生很大的电场强度105V/cm.可被电压门控型离子通道的敏感机构所检测.细胞膜电路参数特征表述：脂质双分子层的介电特性可用电容C表示，离子通道则用电导G表示.可兴奋细胞膜的等效电路：根据基尔霍夫电流定律(KCL)，可有Im=ic+Ii=Cm(dVm/dt)+(Vm-Er)/Rm=Cm(dVm/dt)+Gm(Vm-Er)其中，Vm-膜电位(V)；Im-总膜电流；ic-电容电流；Ii-离子通道电流(A/cm2)；Rm-膜的比电阻(W/cm2)；Gm-膜的比电导(S/cm2)；Cm-膜的比电容(F/cm2)；Er-静息电位，但某一离子形成Ii时，则Er被平衡电位Ei(对应于离子i)所替代.可见，离子电流Ii取决于总的膜电导Gm与驱动力(势)(Vm-Er)的乘积.一般来说，细胞膜的离子电流是单个电流之和，即Ii=INa+Ik+ICl+.每种离子产生的电流分量如INa=GNa(Vm-ENa).微电极与导电溶液微电极是生物测量中的传感器.从导电角度来看，某些含水的离子溶液，如血液，胞浆及海水均遵守欧姆定律.电流由两种离子运载，即阳离子和阴离子.当电流流过细胞膜离子通道时，选择性由一部分离子运载.电极上的电子与溶液中的离子进行变换可能会出现误差.常用电极为银/氯化银电极.细胞膜离子通道分类电压门控通道：膜受体门控通道：胞内第二信使激活的通道：通道电流的记录模式(recording configuration)细胞贴附式：用于单通道记录全细胞记录式：研究胞内第二信使时有着特殊的优势(但破膜后细胞变形，影响记录结果，可用穿孔膜片钳技术)膜外朝外式：用于单通道记录膜内朝外式：用于单通道记录膜片钳实验系统的组成机械部件：防震工作台，屏蔽罩，仪器设备架光学部件：显微镜，视频监视器，单色光系统电子部件：膜片钳放大器，刺激器，数据采集设备，计算机系统微操纵器：机械式，机电式，液压式玻璃微电极工艺玻璃毛坯管：有软玻璃(苏打玻璃，电石玻璃)和硬玻璃(硼硅玻璃，铝硅玻璃，石英玻璃)之分.软玻璃熔点低，易抛光，但1KHz的电导率是膜片记录的主要热噪声源(有较大的介电松弛特性)硬玻璃拉制后有较窄的末梢(较高的电阻)；硼硅和硅硅玻璃有较好的噪声和介电松弛特性；石英玻璃特别适用于低噪声记录，但需激光源拉制.玻璃微电极拉制工艺：垂直式拉制仪，水平拉制仪电极熔锻仪和优化处理：一是为减小电极内部与溶液之间的电容(电极末梢数微米涂敷疏水材料硅酮树脂，以阻止液膜上爬)；二是为了对电极尖端作优化处理(热抛光使电极尖端光滑，以提高封接成功率).电极流灌：为防止灰尘污染，置有盖容器内并需23小时内使用；电极内液充灌前最好用滤纸过滤.电极夹持器：可用甲醇清洗保持清洁浴池电极：浴池电极应该有一个稳定的电极电位并且不扰乱浴液成分.通常裸露的Ag/AgCl丝作为一种良好的浴池电极.然而Ag+仅能为某些细胞所承受，需用琼脂盐桥改善.技术膜片钳的工作模式(operating mode)电压钳模式(voltage clamp,VC)：电流钳模式(current clamp,CC)：用已知恒定的或者时变的电流作用于细胞，测量作用电流引起的膜电位的变化.实验前准备工作细胞活性状态：活细胞寿命比较短溶液准备：一般来说，浴液模仿自然的胞外环境，电极内液取代细胞溶质(胞液).胞外用浴液以公升为单位存放于冰箱，胞内用液以小容量(510ml)为单位冻存，实验前解冻.必须注意pH值和渗透压，亦需过滤.某些实验前的短时间内，需要向小容积(100500ml)的电极充灌液中补加冻存物(如ATP,GTP,荧光染料，多种第二信使等)到一个Eppendorf管.实验步骤：两个重要环节高阻封接：电极与细胞膜形成封接的过程，可用示波器来观测当对电极施加一脉冲电压时的电极电流.在电极未入液前，可观测到一平坦的电流波形，混杂有电极和夹持器的杂散电容所形成的瞬态电流；当电极入液后，2mV的脉冲将产生1mA的电流通过约2MW的电极.当电极趋近细胞膜，并形成吉欧封接，将进一步增加电极电阻和减小电极电流.为证实吉欧封接的形成，可增加放大器的增益，观察到除脉冲电压的首尾两端电容性脉冲尖端电流外，电流波形仍呈平坦状.数据记录：以全细胞记录为例吸破膜片：负压或高电压脉冲参数补偿：从电路角度观察，当施加脉冲电压时，电极入口处因电极电容，入口电阻和膜电容的存在，构成一个较复杂的RC网络.当外加测试脉冲电压或命令电压时，将产生瞬态电流响应，严重干扰预期的测试结果.因此实验记录之前需要进行参数补偿，以获得实际的结果.为了消除这些参数的瞬态影响，膜片钳放大器均设有补偿电路.快电容补偿：电极电容Cp极小，仅几个pF，相应的电路时间常数很小，故对于Cp瞬态补偿称之.慢电容补偿：细胞膜电容约为1mF/cm2，此时的充电电流需流经串联电阻Rs(约几MW)，时间常数较大(约100mS)，故Cm的补偿称为慢电容补偿.串联电阻补偿：串联电阻跨接于Cp与Cm之间，当有电流经过时，产生可观的压降(如Rs=5MW，Ip=2mA，其导致钳制电位误差达10mV).因此需要消除这种误差的电路措施.数据记录：设置适当的放大器的带宽注意事项溶液：浴池和电极溶液渗透压和pH值；浴液中的二价离子具有屏蔽表面膜电荷的作用；许多有机化合物不易溶于水；氯离子Cl-是水溶液和Ag/AgCl丝电极之间的主要电荷传递离子(电子导电和离子导电的接口作用)；失调电压(放大器的失调电压，电极电位，液结电位等)；电极流灌液补加ATP等以维持细胞信号转导或某些离子电流的衰减；来自于容器，注射器，管子，针具及非高纯度化学试剂的污染.电极：电极本身的AgCl涂层受损；电极与生理盐水之间的电位问题(电极有气泡?电极与探头虚接?浴池电极未接通等)数据采集：存在问题有泄漏校正，保持电位的选择和刺激方案，采样频率的正确选择和滤波器设置.应用单通道电流记录技术细胞贴附式记录模式：细胞贴附式是最早使用的记录模式.由于单通道电流非常微弱，因此抑制噪声非常重要.膜片钳系统中的噪声成分除电子仪器噪声，电极噪声外，尚有封接噪声.因此高阻封接或吉欧封接是技术关键.为实现高阻封接，必须注意：细胞膜表面光洁，浴液干净无杂质和灰尘污染；电极材料宜用硬质玻璃，最好抛光并涂硅酮树脂以改良介电特性，降低噪声；具体封接技术经验非常重要(电极尖粘污灰尘；电极仅用一次；酶处理细胞浴液表面残渣；电极内液含Ca2+，则必须用HEPES缓冲液，以防止其与磷酸盐形成结晶；低渗透的(10%)电极溶液比较容易形成高阻封接).离体膜片的单通道电流记录在细胞贴附式记录模式基础上，派生出的膜外朝外式和膜内朝外式，因只剩下一个微小而独立的膜片，故称之为离体膜片(cell-free patch).此时细胞内，外环境均可人工控制，自由地对膜片上的单一离子通道进行调控和实验研究.离子通道的辨识可以通过门控机制，药物激活或阻塞来辨识.单一离子电流的记录数据所有的离子通道的开放和关闭处于一种随机和突变性的状态.也就是说，通道在导通和非导通两种状态下随机变化，其开放(关闭)概率由跨膜电压或配体结合所控制.从数学观点来看，这种特性是非确定的，不能用确切的明显的数学方程来描述.而只有用随机分析方法来处理(阈值检测法；直方图-幅度直方图和开关持续时间直方图).全细胞记录技术基本实验步骤：进行全细胞记录(whole-cell recording,WCR)时，电极内液应是低Ca2+的.电极尖端与细胞膜接触并形成吉欧封接使膜吸穿后，电极电位随即变为负值.将幅值几毫伏的阶跃电压通过电极作用于细胞膜，立即出现电容暂态响应.调节C-fast以消除电极电容(快电容)引起的暂态误差.对电极内腔施加一脉冲负压，直到细胞膜封接区吸破，以至电流大增，噪声也加大.进行膜电容补偿.一旦WCR模式形成之后，可将微电极稍微提升以减轻对细胞的压力.WCR实验可持续至少1小时而无衰变现象.若细胞紧贴培养皿，移开微电极时，有可能形成膜外朝外式.可以开拓应用：1.此方法对所选定细胞产生最少的膜损伤，而达到改变细胞内液目的；2.仅需更换微电极对某一细胞进行连续的不同内液的全细胞记录；3.借助此方法可以在一个实验中获得宏观的和单通道的数据.全细胞记录模式中的电极充灌：标准的电极内液：pH缓冲液(10mMHEPES，调节pH2.4)；Ca缓冲液(10mM EGTA+1mM Ca，给定Cai 10nM)；MgATP(2mM；使ATP酶保持活性)；自由Mg2+(1mM，在许多胞液过程中，作为一种辅助因子)；GTP(0.1mM)用于涉及研究G蛋白的实验.ATP和GTP是不稳定的.电极内液含有核苷酸时应将其保持在冰冻状态，实验过程中，融化了液体必须置于冰块上.对于长程记录(30min)，应使用ATP再生式系统，以避免ATP在电极中衰减.细胞通常含有谷胱甘肽，K+和Na+通道的失活依赖于电极内液的氧化还原电位，应当灌注5mM谷胱甘肽以防止产生异常现象.谷氨酸盐，MOPS和羟乙磺酸盐可替代胞内标准阴离子(Cl-)以保持负平衡电位.F-也可作为胞内阴离子，也穿透Cl-可通透的通道.F-优于Cl-地方在于形成封接和记录的稳定性.F-与Al3+形成AlF4，它是一种G蛋白有效激活剂；F-也是一种Ca2+缓冲剂，干涉Ca依赖性过程.因此对于涉及G蛋白和胞内信使的过程，使用F-是不合适的.穿孔膜片钳技术：为克服某未知因子进入电极而使细胞功能被冲洗的缺点，在细胞贴附模式下，应用穿孔剂而形成穿孔膜片钳(perforated patch clamp).胞内的关键扩散分子不能跨越膜上生成的孔道以避免冲洗现象的发生.常用穿孔剂：制霉菌素(Nystatin)和两性霉素(Amphotericin B)Nystatin是一种多烯抗生素类药物.Nystatin孔道具有特殊的性质.Nystatin对细胞封接的抑制作用(封接时电极尖端不能有穿孔剂).Nystatin不溶于水，对光线敏感(溶液必须进行超声处理和光屏蔽).全细胞记录技术的应用：离子通道宏观性质的分析(离子通道的性质和分类-电压门控通道，膜受体激活通道，配体门控通道，胞内第二信使激活通道等)；离子通道微观性质分析(单一离子通道活动的测定，离子通道的构造，分布和机能分布等)；膜电容的测量及其对细胞分泌活动的研究；胞内钙离子浓度和钙通道电流的同时定量检测；组织切片的全细胞记录；植物细胞的电生理研究.重要概念小结：全细胞记录技术是四种记录模式中应用最广泛的一种.建立全细胞模式的电路模型，可以对其功能进行电学分析，包括暂态分析，其时间常数近似为t=RsCm.对于复杂的神经细胞分析，可以采用分段建模的概念来解决.在全细胞记录模式中，电极内液与胞液之间的物质扩散与平衡，同样可以用分段建模的化学方法来分析.穿孔膜片钳是全细胞记录的派生模式，可以防止细胞内物质的流失而影响其功能.脑切片膜片钳技术优点：无需酶处理；应用高分辨率的记录技术在可分辨的神经元进行试验(组织结构相对完整)；可与其它方法结合(胞内离子荧光测量，常规荧光成像，共聚焦激光扫描成象，多光子激光扫描成像)脑切片脑切片的制备与维护断头开颅切脑区置冰冷充氧盐水(1min)组织冷却(10min)修剪组织粘贴到切片台，并冰液覆盖振动切片(60400mm,10min)切片孵育(备用(25以下，10h以内)，实验用(3237孵育约30min)(也可37孵育约30min后转入25备用)脑组织的不同部位制备切片原则-保持神经元活性和树突不受损伤；依据所要研究的神经细胞确定切片的定位方向动物的品种与年龄新生动物-颅骨软，方便快速取出脑组织；脑组织小，置入冰冷生理盐水冷却快成年动物-脑组织坚韧，对缺氧敏感；组织髓鞘质多易致切片损伤脑切片膜片钳记录技术仪器设备样品器皿，记录腔，铂金丝，显微镜(差分干涉对比度显微镜DIC differential interference contrast或亮场光学显微镜BFO bright-field optics)(采用长波长的红外线可提高分辨率)电极内液和外液的配制标准电极外液：(mM,NaCl 125,KCl 2.5,CaCl2 2,MgCl2 1,NaH2PO4 1.25,NaHCO3 26,葡萄糖20)标准电极内液：依据实验目的(mM,KCl 140,MgCl2 2,CaCl2 1,EGTA 10,ATP 2,HEPES 10)切片上神经元和神经蚀质细胞的辨识视觉辨识：浅表细胞-显微镜下直接辨识；深层细胞-IR-DIC显微镜观察(也局限于4-050mm)荧光染料标记：染料从全细胞记录微电极注入；也可细胞浴液渗入.记录前的准备工作细胞清洗：对较深在的细胞，可用流体冲洗方法.选择细胞：好的细胞表面光滑，对比度好.记录用电极：电极相对细长以避免与物镜相触.电极阻值过大难于破膜，入口电阻(串联电阻Rs)大，也限制电极内液与细胞内部之间的物质交换.几种记录模式举例细胞贴附式：全细胞记录：膜外朝外式：双电极记录：脑切片膜片钳技术与其它方法的结合常规成像技术紫外光源(UV)照射到切片的某一区域.细胞载入荧光染料(Fura-2)后，其反射光特性发生变化.检测器可用CCD摄像机或光电倍增管PMT，均可测量细胞内钙离子浓度，荧光强度与钙通道电流.CCD的优点在于可以获得被测细胞(神经元)各个部分的