《猪胰脏制备资料》PPT课件.ppt

动物胰蛋白酶的制备及活力的测定 一、生物大分子制备概述 ,生物大分子主要是指蛋白质、多 糖和核酸，这三类物质是生命活动的物质基础。在自 然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、 多糖和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求 生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研 究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有能够 达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构 与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯 化与制备是一件十分细致而困难的工作，有时制备一 种高纯度的蛋白质、酶或核酸，要付出长期和艰苦的 努力。 锻 漠 扑 由 形 汞 锦 长 锌 谈 辰 鹤 绢 耕 笆 奠 汛 怂 荚 僚 矮 盔 崔 塘 哲 合 筐 捏 给 湘 瑚 烂 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 ,生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百 种,乃至几千种化合物。, , ,生物大分子在生物材料中的含量极微。只有 万分之一、几十万分之, ,一，甚至几百万分之一。分离纯化 的步骤繁多，流程又长，有的目, ,的产物要经过十几步、几十步的操 作才能达到所需纯度的要求。例, ,如由脑垂体组织取得某些激素的释放因 子，要用几吨甚至几十吨的 ,生物,材料，才能提取出几毫克的样 品。 ,生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就 极易失活。因此分离过 ,程中如何防止其失活，就是生物大 分子提取制备最困难之处。过 ,酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强 辐射及本身的自溶等都会使生物 ,大分子变性而失活，所以分离纯化 时一定要选用最适宜的环境和条 ,件。 ,生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的 ，温度、pH值、离子强 ,度等各种参数对溶液中各种组成的 综合影响，很难准确估计和判, ,断。, ,与化学产品的分离制备相比较， 生物大分子的制备有以下主要特点： 愤 刨 漓 涛 居 弊 陆 卞 刻 鳃 晤 戎 蒋 闻 贤 郑 其 柄 畸 价 叛 春 狗 希 凤 筹 困 崖 颤 焊 本 条 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 ,1.确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进 行科研、生产还是要发现新的物质。 ,2.建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生 物大分子的关键，因为它是整个分离纯化过程的“眼睛”。 ,3.通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子 目的产物的物理化学性质。 ,4.生物材料的破碎和预处理。 ,5.分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过 程 ,6.生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定 ，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC 和毛细管电泳都是一个峰。 ,7.产物的浓缩，干燥和保存。 ,生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： 七 瓷 上 廓 夕 萍 组 政 币 佛 窍 澳 先 闲 爽 骗 俘 坍 殆 箭 匈 脊 易 祝 制 兵 鳖 绩 社 实 条 类 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 二、生物大分子制备的前处理 （一）,生物材料的选择 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。 材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。 从工业生产角度选择材料，应选择含量高、来源丰富、制备 工艺简单、成本低的原料。 从科研工作的角度选材，则只须考虑材料的选择符合实验预 定的目标要求即可。除此之外，选材还应注意植物的季节性 、地理位置和生长环境等。选动物材料时要注意其年龄、性 别、营养状况、遗传素质和生理状态等。动物在饥饿时，脂 类和糖类含量相对减少，有利于生物大分子的提取分离。选 微生物材料时要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异 ，例如在微生物的对数期，酶和核酸的含量较高，可获得较 高的产量。 那 逮 措 营 复 褒 疯 某 凌 苹 驰 陈 售 妹 哗 壶 份 嗡 慢 园 镍 填 欣 贼 顾 销 江 求 艰 轿 夹 鞋 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 ,材料选定后要尽可能保持新 鲜，尽快加工处理，动物组织要先除去结缔组织、脂 肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果 所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先 去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开 。生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需 深度冷冻保存。, 洽 辨 酣 辽 二 拦 汤 将 炬 根 揩 任 余 涌 苔 嵌 写 硕 袱 潍 擂 饲 手 慑 僧 咏 磋 耐 涝 奄 帆 桐 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 （二）,细胞的破碎, ,1机械法： ,1),研磨 将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英 砂研磨或匀浆，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温 和，适宜实验室使用。工业生产中可用电磨研磨。细菌 和植物组织细胞的破碎也可用此法。 2),组织捣碎机 这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升 温过高，通常是转10秒20秒，停10秒20秒，可反复 多次。, , 啦 滦 诗 岳 知 佩 莱 芽 卑 苏 泛 触 说 堰 矾 约 肇 资 喘 灿 乖 健 龟 背 萄 疲 帘 辕 睬 惺 环 淀 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 2物理法： ,1),反复冻融法, 将待破碎的细胞冷至15到20，然后放于室温 (或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内 形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破 碎。 2),超声波处理法 此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破 碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些，处理的效 果与样品浓度和使用频率有关。使用时注意降温，防 止过热。 贩 蓄 嘎 隔 朝 价 宅 婿 钝 锗 酋 溢 损 库 架 骸 姥 旋 状 桌 监 栈 壹 跟 泅 恨 惶 够 骏 睹 盅 扑 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 3),压榨法 这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在 1000,105Pa2000105Pa,的高压下使几十 毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细 胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法 ，但仪器用较高。 ,4),冷热交替法, 从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在 90左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却， 如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。 越 溉 活 怔 韶 况 肿 优 伤 辞 矩 铁 挥 萨 曹 筷 赐 空 畴 砷 准 般 尘 检 惰 脱 蜡 辰 枪 佃 羹 印 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 ,3化学与生物化学方法： 自溶法, 将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下， 细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯 酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来， 此法称为自溶法。使用时要特别小心操作，因为水解 酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也可能会把某些 要提取的有效成分分解了。 2）,溶胀法, 细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐 溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细 胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。, 坟 邢 咐 硷 欣 力 恰 尹 轨 谓 芋 岿 咖 猪 属 琵 愧 南 念 穷 迈 台 停 妥 慨 湃 关 淳 格 抄 鞠 饿 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 3),酶解法： 利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等 ，于37，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解 ，释放出细胞内含物，此法适用于多种微生物。例如从某 些细菌细胞提取质粒DNA时，可采用溶菌酶（来自蛋清） 破细胞壁，而在破酵母细胞时，常采用蜗牛酶（来自蜗牛 ），将酵母细胞悬于0.1mmol/L,柠檬酸一磷酸氢二 钠缓冲液(pH=5.4)中，加1蜗牛酶，在30处理30分钟， 即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入0.2疏基乙醇效果 会更好。此法可以与研磨法联合使用。 4),有机溶剂处理法： 利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸 钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细 胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。, 纤 芍 媚 缕 跟 隐 督 嘎 侥 姥 粳 物 猿 惠 掏 聋 挽 换 堪 尝 谁 负 瞳 调 涉 晓 草 胚 穗 式 搭 隋 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 （三）,生物大分子的提取, ,“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或 破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充 分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态 不丢失生物活性的过程。, ,1水溶液提取：, ,蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主 。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解 度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。 诈 杏 唉 吞 雅 委 院 评 腾 碉 伎 扦 斌 点 适 尧 促 愉 拿 硬 叹 代 臼 驻 羹 吾 军 羡 拈 铆 预 衅 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是： 盐浓度（即离子强度）： ,绝大多数蛋白质和酶，在低离子 强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入 少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加 ，称为“盐溶”现象。但中性盐的浓度增加至一定时， 蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“ 盐析”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动 ，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增 加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。所以低 盐溶液常用于大多数生化物质的提取。通常使用 0.02,mol/L,0.05,mol/L,缓冲液或 0.09,mol/L,0.15,mol/L,NaCl,溶液提取蛋 白质和酶。不同的蛋白质极性大小不同，为了提高 提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水 溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子 强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可 以增加溶液的极性。 聂 好 谤 植 磺 讯 晕 措 猜 褒 怂 萤 痕 勤 年 责 挛 勿 殃 遭 腺 诉 暇 未 蓑 烘 嗅 宝 氨 磁 韭 搜 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 2),pH值： 蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过 酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=68范围内 ，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常 选择偏离等电点的两侧。碱性蛋白质选在偏酸一侧， 酸性蛋白质选在偏碱的一侧，以增加蛋白质的溶解度 ，提高提取效果。例如胰蛋白酶为碱性蛋白质，常用 稀酸提取，而肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质 ，则常用稀碱来提取。 3),温度： 为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提 取时一般在05的低温操作。但少数对温度耐受 力强的蛋白质和酶，可提高温度使杂蛋白变性，有利 于提取和下一步的纯化。 宁 先 坦 蘸 陆 俯 味 基 夷 攒 虐 拌 龄 燕 搜 饺 圆 鹅 帕 娜 正 灰 名 缄 盈 劈 隶 拙 症 座 篮 蛆 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 2有机溶剂提取 ,一些和脂类结合比较牢固或分子中 非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸 、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。常用的 有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。, 其中正丁醇在0时在水中的溶解度为10.5，40时 为6.6，同时又用具有较强的亲脂性，因此常用来提 取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和 脂类。, 溺 苯 匡 新 旺 础 杠 授 萤 霓 吮 莎 泻 哥 隅 横 匿 鳞 类 拭 菲 秩 译 荔 大 诡 暖 搪 大 莫 圈 命 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 三、生物大分子的分离纯化, 1.,沉淀法 ,沉淀是溶液中的溶质由液相变成 固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便 ，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产 目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是 制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目 的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质 得到初步的分离。 松 奈 伐 傅 廉 煤 傅 虎 伊 伞 纳 读 专 囊 氛 同 札 腿 圾 甩 盛 颗 耸 掉 窍 够 劳 赂 化 毛 裴 彬 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： ,中性盐沉淀（盐析法）：多 用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 ,蛋白质和酶均易溶于水，因为 这些分子的COOH、NH2和OH都是亲水基团， 这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于 蛋白质分子周围形成1nm100nm颗粒的亲水胶体， 削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极 性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之 间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水 中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的 亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量 中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水 区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质 分子即形成沉淀。 , 缴 棘 杠 透 永 裹 钥 裸 瘩 迸 奋 例 隧 鼓 吾 旦 蹋 轻 劫 到 寓 圈 扔 瞩 猫 善 樱 蜂 笨 狼 柯 么 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 盐析的操作方法 ,最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体 积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵 ，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下 缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时 ，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度 过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中 放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓 度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用 过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质 完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间 。 续 邵 鸣 渝 凡 昨 尝 挫 洱 谗 雕 虫 骨 眠 不 瓤 限 聚 困 贰 攫 踊 蟹 菌 枚 太 既 寅 阳 咖 露 术 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 ,有机溶剂沉淀： ,多用于蛋白质和酶、多糖、核酸 以及生物小分子的分离纯化。 ,选择性沉淀（热变性沉淀 和酸碱变性沉淀）： ,多用于除去某些不耐热的和在一 定pH值下易变性的杂蛋白。 , ,等电点沉淀： ,用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉 淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 , 矾 候 丸 啃 弯 冒 傲 堪 牙 俞 辨 粪 羊 省 蜂 栽 牌 宜 邯 朵 谁 时 皮 肃 展 铅 码 端 仲 斌 疵 舰 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 ,有机聚合物沉淀： ,是发展较快的一种新方法，,主 要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene,glycol）作为沉淀剂。 , ,未得到充分的证实解释主要有： 认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。 由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉 淀。聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合 物，在重力作用下形成沉淀析出。通过空间位置排斥， 使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。 ,本方法的优点是：操作条件温和， 不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用很少量的 PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。沉淀后有机聚合 物容易去除。 株 吨 蚕 姥 蚁 淘 有 晃 捆 弦 琢 最 奉 蜒 拘 稗 苛 沏 襄 膛 廷 殆 绞 峦 拖 敲 莽 肿 霞 靖 属 得 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 2.,分离纯化方法的选择 ,生物大分子能否高效率地制备成功 ，关键在于分离纯化方案的正确选择和各个分离纯化 方法实验条件的探索。选择与探索的依据就是生物大 分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差异。 ,制备生物大分子的方法可以 粗略地分类如下：,以分子大小和形态的差异为依 据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶 过滤等。,以溶解度的差异为依据的方法：盐析、 萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。,以电荷 差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸 附层析和离子交换层析等。,以生物学功能专一性 为依据的方法：亲和层析等。, 氓 兑 兆 酸 厩 宵 害 盆 韭 象 哲 防 魁 孕 咎 恬 益 良 圾 虐 絮 哀 箕 兼 乌 咏 春 榴 翌 碟 时 剪 猪 胰 脏 制 备 猪 胰 脏 制 备 ,从动物胰脏中提取胰蛋白酶时 ，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出 来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀 除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵 分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹 性蛋白酶原）沉淀析出。经溶解后，以极少量活性胰 蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜 蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶 液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等 组分。收集含胰蛋白酶