肺结核实验室诊断

结核分枝杆菌的试验室诊断 1 结核疫情及诊断进展 2 l黛玉脸色苍白， 瘦骨嶙峋，经不断 咳嗽及吐血后，香消玉殒，结束了一场 哀怨凄绝的爱情故事。 3 我国结核病疫情 全球结核病第二高负担国家，结核病疫情表现有“六多” 。 一、感染人数多5.5亿人感染过结核菌，约占全国人口 的45，高于全球平均水平。 二、患病人数多活动性肺结核、传染性肺结核患病率 分别为367/10万和122/10万， 三、新发患者多全国每年新发活动性肺结核患者145 万， 其中传染性 肺结核患者65万。 四、死亡人数多全国每年约有13万人死于结核病。 五、农村患者多全国约有80的结核病人集中在农村， 主要在经济不发达的中西部地 区。 六、耐药患者多全国结核病耐药率高达28。 4 结核病实验室 诊断方法介绍 5 概 述 l结核病人的细菌学检查不仅是发现传染源 的主要途径和手段，也是结核病确诊和制 订抗痨方案，考核疗效、评价治疗效果的 可靠标准。 l由于结核菌的遗传特性决定其生长周期长 ，致使常规细菌学检查方法存在着灵敏度 低、操作复杂，需时间较长和影响因素较 多，不易标准化等缺陷，使细菌学诊断发 展缓慢，无法充分满足临床诊断的需要。 6 实验室诊断方法 l病原学诊断 l辅助诊断 7 病原学诊断 一、涂片抗酸染色镜检法， 二、液基夹层杯结核杆菌检验 三、荧光染色法 四、培养法 五、液体培养显微镜观察药敏试验液体培养显微镜观察药敏试验 六、快速培养检测法， 七、色谱法 八、分子生物学法 九、噬菌体生物扩增法九、噬菌体生物扩增法 8 一、涂片抗酸染色镜检法： l国内大多采用厚涂片，比薄涂片法可提高 阳性率；涂片萎尼抗酸染色法能保存较久 ，可备复查； l因费时、繁琐，综合医疗单位常因重视不 够，致涂阳检出率低于5%，专业机构涂阳 率可达到30%。 l国外痰涂片阳性率可达30%40%，反复 多次查，可增加到65%75%； 9 涂片优点：简便、快速、价廉 10 涂片的缺点 l l 敏感性低：敏感性低：500050001000010000条菌条菌mlml l l 特异性差：所有分枝杆菌均可着色特异性差：所有分枝杆菌均可着色 l l 无法区别死菌与活菌：结果均为阳性无法区别死菌与活菌：结果均为阳性 11 痰菌假阴性原因 l病变是封闭或开放； l病变性质和其中能够排出的菌量和排出 时间间歇； l结核分枝杆菌形态多样性； 12 二、液基夹层杯结核杆菌检验工作原理 将经过消化灭活处理液处理的痰液、或其他体液标本混悬 液置于具有符合光学要求基片的夹层杯中，经过专业离心机 离心将混悬液中细菌或细胞牢固附着基片上，并在夹层杯中 直接染色后取出基片在载波片上封片，置显微镜下观察。 13 优点： 1、操作方便，易于掌握。 2、片中结核菌分布均匀，染色效果清晰 3、液基结核菌制片技术较离心浓缩集菌法有显著提 高： 该方法将所有消化后标本的抗酸杆菌均完整 地保留于液基薄片中，从而显著提高了检出率。 4、安全性有所提高： 消化，制片，烤片，染色均在 彭氏杯中完成，操作人员不直接接触标本。 采用 结核专用消化液，可有效杀灭结核分支杆菌，更好 的提高了操作的安全性。 14 三、荧光染色法： l是涂片法中阳性率较高，较快速的方法， l集菌与荧光染色相结合，则荧光显微镜下的抗 酸杆菌阳性率可达50%， l荧光法的缺点： 假阳性率较高， 保存时间短，不到4个月 15 四、培养法 l一般都用改良罗氏固体培养基 l接种后第3第7天观察，以后每周观察一 次菌落生长情况，第8周若仍无生长，报 告为阴性。 l优点：准确，灵敏度略高于涂片法；可灵敏度略高于涂片法；可 以鉴定死菌与活菌；可进一步进行菌种以鉴定死菌与活菌；可进一步进行菌种 鉴定和药敏试验鉴定和药敏试验. . l缺点：诊断周期长，最快也需要6周。 l有一定的污染率 16 17 培养假阴性的原因 l个别细菌营养要求的特异性； l细菌和细菌营养代谢异质性； l细菌培养前处理对细菌活性影响； 18 分枝杆菌药物敏感性试验 l绝对浓度法检测分枝杆菌药敏实验是采用含药罗氏培养基进行的。常用药物终浓度（g/ml） l _表 1 绝对浓度法含药培养基中的药物终浓度_ l 药 物 浓 度（g/ml） l 低浓度 高浓度 l异烟肼 1g/ml 10g/ml l利福平 1g/ml 10g/ml l链霉素 10g/ml 100g/ml l乙胺丁醇 5g/ml 50g/ml l对氨基水杨酸 1g/ml 10g/ml l氨硫脲 10g/ml 100g/ml l乙硫异烟胺 25g/ml 100g/ml l卡那霉素 10g/ml 100g/ml l卷曲霉素 10g/ml 100g/ml l 紫霉素 10g/ml 100g/ml l氧氟沙星 5g/ml 50g/ml l左氧氟沙星 5g/ml 50g/ml l环丙沙星 5g/ml 50g/ml l司帕沙星 5g/ml 50g/ml l力克肺疾 1g/ml 10g/ml l丁胺卡那 10g/ml 100g/ml l 19 检测方法 l 1菌悬液的制备 l 2.接种及培养 l3.结果判定与报告 l敏感（一）： 含药培养基上无菌落生长。 l 报告菌落数：当含药培养基上菌落数在20个以下时， 报告菌落个数。 l耐药（1+）： 含药培养基上菌落数约占斜面面积1/4； l耐药（2+）： 含药培养基上菌落数约占斜面面积1/2； l耐药（3+）： 含药培养基上菌落数约占斜面面积3/4； l耐药 (4+)： 含药培养基上菌落呈菌苔样生长。 20 本法弊端 l l 操作繁琐操作繁琐 l l 需时久，需时久，4 4周周 l l 结果准确性差结果准确性差 21 五、液体培养 显微镜观察药敏试验 l l 是是20002000年建立的一种痰标本液体培养结合显微镜观察技年建立的一种痰标本液体培养结合显微镜观察技 术。其原理是术。其原理是MTBMTB含有索状因子，因此其在液体培养基含有索状因子，因此其在液体培养基 中生长时分泌索状因子，形成索状特征性结构，利用倒中生长时分泌索状因子，形成索状特征性结构，利用倒 置显微镜观察索状结构可用于置显微镜观察索状结构可用于MTBMTB的快速诊断。由于液的快速诊断。由于液 体培养基营养丰富，因此体培养基营养丰富，因此MTBMTB生长迅速，使生长迅速，使MTBMTB的培的培 养时间显著缩短，培养阳性率显著增加。该法还能在培养时间显著缩短，培养阳性率显著增加。该法还能在培 养的同时直接进行临床标本的直接药敏试验，因此能显养的同时直接进行临床标本的直接药敏试验，因此能显 著缩短从临床标本到耐药性测定的所需时间，这是其它著缩短从临床标本到耐药性测定的所需时间，这是其它 传统方法所不具有的，也是传统方法所不具有的，也是MODSMODS的最大优点。的最大优点。 22 液体培养 + 显微镜观察 23 结 论 l l 本试剂检测简便，快速，本试剂检测简便，快速，3 3天就可获得多耐药结天就可获得多耐药结 核杆菌的检测结果，同时具有较高的敏感性和核杆菌的检测结果，同时具有较高的敏感性和 特异性，与常规方法符合率较高，可用于多耐特异性，与常规方法符合率较高，可用于多耐 药结核病的快速检测。药结核病的快速检测。 l l 痰标本直接药敏试验比常规方法提早痰标本直接药敏试验比常规方法提早6 68 8周，周， 更具有快速诊断价值。更具有快速诊断价值。 l l 本试剂费用低廉，不需特殊仪器设备，适合基本试剂费用低廉，不需特殊仪器设备，适合基 层推广应用。层推广应用。 l l 本法安全、对预防耐药结核病的流行与传播、本法安全、对预防耐药结核病的流行与传播、 防止实验室工作人员的感染具有重要意义。防止实验室工作人员的感染具有重要意义。 24 六、快速培养检测法 1. BD BACTEC MGIT 960培养系统 2. BacT ALERT 3D培养系统 25 1. BD BACTEC MGIT 960 培养系统 基本原理 l 培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，由于该显 示剂为氧抑制性，当分支杆菌生长使氧消耗后，荧光显 示剂被激活，而发出荧光。检测仪测试荧光强度，并判 定结果。 l优点：快速 7-14天培养阳性 简便 比常规法操作简便， 培养阳性率高于L-J法 l缺点：无法观察菌落形态，无法观察菌落形态，污染率略高于L-J法，产品依 赖进口，价格较贵 26 2BacT ALERT 3D培养系统 l原理：该系统采用产色检测技术检测培养系统中分支杆菌 生长情况。因其所用的培养瓶底部有颜色感应器，当培养 瓶中有细菌生长，C02产生、pH下降时，颜色感应器由绿 色变成黄色。仪器自动连续检测，检测的数据输入计算机 ，根据计算结果自动显示培养瓶中有无分支杆菌生长。 l优点：快速 7-14天培养阳性 简便 比常规法操作简便， 培养阳性率高于L-J法 l缺点：无法观察菌落形态，无法观察菌落形态，污染率略高于L-J法， 产品依赖进口，价格较贵。 27 七、色谱法 l分为气相色谱(GC)、气液相色谱、高效液相色谱 (HPLC)等 lGC等能检测分枝杆菌代谢过程中的挥发性物质如脂肪 酸所产生的CO2含量，出现不同的色谱峰，从而可鉴 定结核杆菌和大部分NTM菌种，且可测药敏。 l优点：简单、快速、定量、重复性好，GC与质谱(MS) 联用更好； l缺点：仪器昂贵，维护不易，无法普及。 28 八、分子生物学法 利用分子生物学检测方法来检测结核杆菌特异性基 因片断，从而为结核病的快速诊断提供依据。 l1、聚合酶链反应(PCR)： l2、核酸探针(DNA-probe) l3、染色体核酸指纹法： l4、16s23srDNA(rRNA)序列法 l5、耐药基因的检则： l6、其它分子生物学方法 29 1、聚合酶链反应(PCR)： lPCR能快速扩增结核分枝杆菌DNA， lPCR检测假阳性和假阴性问题是影响其应用的关 键问题。 l对于存在的问题对策如下： l扩增产物特异性鉴定探针杂交 l高质量试剂（建立国家级检定考评） l规范化操作（培训操作人员） l质量控制 （标准实验室） 30 2、核酸探针(DNA-probe) lDNA探针是一小段带标记而能识别特异 性核苷酸序列的单链分子。 3 3 、染色体核酸指纹法：染色体核酸指纹法： l有多种方法， l如限制性内切酶图谱(REA)和限制性酶切片段长 度多态性(RFLP)分析等， lRFLP用于菌株菌种鉴定和流行病学调查研究。 31 4、16s23srDNA(rRNA)序列法 l用于分枝杆菌的菌种鉴定，差不多所有 种的分枝杆菌都可鉴定出来。 5、耐药基因的检则： l已查出的结核杆菌耐药基因有rpoB(对利福平) ，Kat、inhA、ahpC(对异烟肼)，embl(对乙胺丁 醇)，rpsL、rrs(对链霉素)，pncA(对吡嗪酰胺)和 gyrA(对氟喹诺酮类，gyrB则为低度耐药)等。 32 九、噬菌体生物扩增法（PhaB） 该法该法19971997建立，并用于结核建立，并用于结核 分枝杆菌耐药性测定。近年来分枝杆菌耐药性测定。近年来 进展很快。进展很快。 33 检测原理 分枝杆菌噬菌体能感染活的分枝杆菌，并分枝杆菌噬菌体能感染活的分枝杆菌，并 在菌体内增殖，裂解菌体，释放出的子代噬菌在菌体内增殖，裂解菌体，释放出的子代噬菌 体，即可感染随后加入的指示细胞（也是一种体，即可感染随后加入的指示细胞（也是一种 分枝杆菌），并使指示细胞裂解，在培养皿上分枝杆菌），并使指示细胞裂解，在培养皿上 出现噬菌斑。出现噬菌斑。 若先将待检菌株与某种药物作用一段时间若先将待检菌株与某种药物作用一段时间 后在加噬菌体检测，并以不加药管为对照，根后在加噬菌体检测，并以不加药管为对照，根 据含药管和不含药管出现的噬菌斑情况即可判据含药管和不含药管出现的噬菌斑情况即可判 断细菌的耐药性。断细菌的耐药性。 34 噬菌体 病毒 核酸 衣壳 只能在活的易感細胞內生長 溶原性感染和溶菌性感染 35 M.tuberculosis cell 特异性噬菌体识别MTB,并 与之结合 36 噬菌体DNA进入MTB细 胞,并在其内扩增;同时生 产蛋白外壳,开始产生新 的病毒颗粒 DNA 37 添加特异性杀病毒剂去 除所有MTB胞外的噬菌 体,胞内噬菌体不受损伤 。 38 终止杀病毒反应，添加非致 病性，快生长分枝杆菌（敏 感细胞） 39 结核分枝杆菌破裂，释 放噬菌体。 40 MTB细胞周围的敏感细 胞，并在其胞内增殖 41 经过多个“感染增殖细胞消融 ”循环，在琼脂培养基中的菌苔上 形成肉眼可见，清晰的噬菌斑 42 43 结核分枝杆菌 杀病毒剂杀灭未感 染MTB的噬菌体 敏感细胞敏感细胞 敏感细胞 敏感细胞 MTB裂解, 释放出来的 噬菌体感染敏感细胞 噬菌体感染结 核分枝杆菌 产生噬菌斑 先以特异性噬菌体感染、裂解标本中的结核分枝杆 菌，再用杀病毒剂清除所有未感染MTB的噬菌体，而结 核分枝杆菌胞内的噬菌体继续扩增，进而裂解细胞，释 放噬菌体。裂解释放的噬菌体感染随即添加的敏感细胞 ，在其胞内扩增并裂解敏感细胞，敏感细胞菌苔上肉眼 可见的噬菌斑。如待检标本不含结核分枝杆菌，噬菌体 被杀病毒剂完全清除，故无噬菌体感染敏感细胞，敏感 细胞菌苔上无噬菌斑出现。 44 质控 阳性对照 20个噬菌斑 阴性对照 10个噬菌斑 结果判断标准 标本 阳性结果 20个噬菌斑 阴性结果 19个噬菌斑 阴性： 无噬菌斑 阳性： 可数噬菌斑 阳性： 噬菌斑部分融 合 阳性： 噬菌斑完全融 合 45 适用范围 可检测痰液、胸水、腹水、脑脊液、尿、骨髓等多种标本 用于结核病的实验诊断 抗痨治疗效果的评价 尤其是初诊病人的鉴别诊断 用于结核菌耐药性的快速检测 用于HIV高危人群的鉴别诊断 46 药敏试验 47 M. tb bacillus Sensor cell Sensor cell Sensor cell Sensor cell Sensor cell 指示细胞 指示细胞 指示细胞 指示细胞 指示细胞 l 室温5分钟 37 1小时 18-24小时 加入杀毒剂 加入培养基和指示细胞 药物细菌 24-48小时 加入噬菌体 MTB MTB 48 RFP 敏感株结果 无 RIF 含RIF 49 RFP耐药株结果 无 RIF 含 RIF 50 上上 海海 市市 结结 核核 （肺）（肺） 重重 点点 实实 验验 室室 方法评价优点 l l 快速：快速：24244848小时小时 l l 比较灵敏：比较灵敏：200200300300条条/ml/ml l l 检测活菌：检测活菌： l l 相对定量：相对定量： l l 安全：安全： 51 上上 海海 市市 结结 核核 （肺）（肺） 重重 点点 实实 验验 室室 方法评价缺点 l l 操作步骤多操作步骤多 l l 影响因素多影响因素多 l l 有假阳性和假阴性有假阳性和假阴性 假阴性率假阴性率10108888 假阳性率假阳性率2 24848 52 上上 海海 市市 结结 核核 （肺）（肺） 重重 点点 实实 验验 室室 假阳性和假阴性原因 l l 噬菌体的交叉感染噬菌体的交叉感染 6 6种种NTMNTM检测结果阳性检测结果阳性 （偶然、胞内、金色、丁酸、耻垢、草分枝） l l 操作因素对结果的影响操作因素对结果的影响 53 辅助诊断 一、免疫学诊断方法 二、血清学诊断 三、酶学诊断 54 一、免疫学诊断方法 lPPD皮试，用于鉴别诊断有参考意义。 lT细胞亚群和一些细胞因子：CD3、 CD4/CD8、IL-2(R)、干扰素、肿瘤坏死 因子等检查，以了解细胞免疫状态，或作 为考核指标前后对比。 55 二.血清学诊断结核抗体检测 (1)结