vegf-b基因靶向sirna对人肝癌细胞hepg2细胞裸鼠皮下种植瘤的影响［ppt课件］

VEGF-BVEGF-B基因靶向基因靶向siRNAsiRNA对人肝对人肝 癌细胞癌细胞HepG2HepG2细胞裸鼠皮下种植细胞裸鼠皮下种植 瘤的影响瘤的影响 导 师 唐瑞峰 教授 研究生 吴剑飞 河北医科大学第四医院肝胆外科 前 言 原发性肝癌与VEGF-B n最常见的恶性肿瘤之一，发病率升高，恶性程度高，进 展迅速，易侵袭、转移、复发。 n肿瘤生长和转移依赖于肿瘤血管新生。 n血管内皮生长因子家族成员(vascular endothelial growth facter family members, VEGFs)是影响肿瘤血管新生的 关键因子之一。 nVEGF-B是VEGF家族新成员， 在原发性肝癌等恶性肿 瘤中存在高表达，目前研究表明VEGF-B可协同VEGF- A和其他血管生成因子，在肿瘤血管新生中发挥作用， 但具体机制仍知之甚少。 siRNA n n 19981998年由年由FireFire等人首次提出。概念：一种由双等人首次提出。概念：一种由双链RNA RNA (double-stranded RNA, dsRNA)(double-stranded RNA, dsRNA)诱导的抗双链反应，诱导的抗双链反应， 进进 而导致序列特异性的基因沉默而导致序列特异性的基因沉默 。 n n 一种由一种由2020多个核苷酸组成的短片段双链多个核苷酸组成的短片段双链RNARNA分子，按同分子，按同 源互补序列的源互补序列的mRNAmRNA为标靶从而使特定的为标靶从而使特定的mRNAmRNA降解。降解。 这种在转录后水平抑制基因表达的机制被称为这种在转录后水平抑制基因表达的机制被称为RNAiRNAi机机 制制 。 n n 一种研究基因功能的利器，目前广泛应用于医学遗传学一种研究基因功能的利器，目前广泛应用于医学遗传学 、分子生物学、疾病基因治疗等各方面的研究、分子生物学、疾病基因治疗等各方面的研究 。 n n 肿瘤基因治疗的新思路：肿瘤基因治疗的新思路：siRNAsiRNA。 n n siRNAsiRNA在恶性肿瘤基因治疗中的优点：高效性；高特异在恶性肿瘤基因治疗中的优点：高效性；高特异 性；高稳定性。性；高稳定性。 材材 料料 与与 方方 法法 材料材料 n n 人肝癌细胞株人肝癌细胞株HepG2HepG2细胞，由河北医细胞，由河北医 科大学第四医院科研中心提供科大学第四医院科研中心提供 。 n n 雌性无胸腺裸小鼠雌性无胸腺裸小鼠(45(45周龄，周龄，SPFSPF级级), ), 购于中国医学科学院动物研究所购于中国医学科学院动物研究所( (动物动物 合格证号：合格证号：0240722)0240722)，在河北医科大学，在河北医科大学 第四医院动物实验中心无特定病原菌第四医院动物实验中心无特定病原菌 (SPF)(SPF)级条件饲养。级条件饲养。 细胞培养试剂 nDMEM培养基 GIBCO公司 n胎牛血清(FCS) 杭州四季青公司 n胰蛋白酶(trypsin) 美国Sigma公司 nPBS液 参照细胞培养 n二甲基亚砜(DMSO) 天津市化学试剂厂 试剂试剂 n n VEGF-BVEGF-B靶向靶向siRNAsiRNA表达载体质粒表达载体质粒 Invitrogen Invitrogen公司公司 n n LipofectamineTM 2000 InvitrogenLipofectamineTM 2000 Invitrogen公司公司 n n 杀稻瘟菌素杀稻瘟菌素( (blasticidinblasticidin) ) Invitrogen Invitrogen公司公司 n n OPTI-MEM GIBCOOPTI-MEM GIBCO公司公司 基因转染试剂基因转染试剂 RNA提取和RT-PCR试剂 ndNTP Invitrogen公司 nM-MLV Invitrogen公司 nOligo Invitrogen公司 n5第一链合成缓冲液 Invitrogen公司 n溴酚兰 Invitrogen公司 n-actin引物 Invitrogen公司 nVEGF-B引物 Invitrogen公司 n TRIquick试剂 Solarbio公司 n氯仿 北京化学试剂厂 n异丙醇 北京化学试剂厂 n乙醇 北京化学试剂厂 n焦碳酸乙二酯(DEPC) 美国Amresco公司 n琼脂糖 美国promega公司 n DNA Maker(1100) 美国promega公司 n琼脂糖 美国promega公司 n溴化乙锭 (EB) sigma公司 仪器仪器 n n CO2CO2恒温培养箱恒温培养箱MCO-18AICMCO-18AIC型型 n n 超净工作台超净工作台SW-CJ-IFSW-CJ-IF型型 n n 倒置相差显微镜倒置相差显微镜XD-101XD-101型型 n n 普通光学显微镜普通光学显微镜 n n 核酸蛋白测定仪核酸蛋白测定仪NANODROP1000NANODROP1000 n n PCRPCR仪仪VERITIVERITI型型 n n 凝胶成像系统凝胶成像系统FOTODYNE60-2107FOTODYNE60-2107型型 n n 小型瞬时离心器小型瞬时离心器CT10CT10型型 n n 低温超速离心机低温超速离心机TTICH-400TTICH-400型型 n n 超低温冰箱超低温冰箱MDF-V50VMDF-V50V型型 n电子分析天平JA 5003型 n移液器 n涡旋混匀器XH-B型 n电泳仪DYY-6C型 n电泳槽DYCZ-38B型 n倒置荧光显微镜TE2000-U型 n电热恒温干燥箱 n恒温水浴箱HXS-H型 n裸鼠饲养笼(美国克罗多拉州生产) 实验方法实验方法 n n 杀稻瘟菌素稳定筛选杀稻瘟菌素稳定筛选VEGF-BVEGF-B靶向靶向siRNAsiRNA转染的转染的 HepG2HepG2细胞细胞(HepG2-siRNA)(HepG2-siRNA)，扩增细胞，扩增细胞 n n 注射足量注射足量HepG2-siRNAHepG2-siRNA细胞入裸鼠肋部皮下，成细胞入裸鼠肋部皮下，成 瘤瘤5 5周。期间观察瘤体体积，测量重量。周。期间观察瘤体体积，测量重量。 n n RT-PCRRT-PCR两步法检测实验组和对照组裸鼠皮下瘤两步法检测实验组和对照组裸鼠皮下瘤 VEGF-B mRNAVEGF-B mRNA的表达的表达 统计学方法统计学方法 n采用SPSS 13.0统计软件进行分析。 n计量资料均采用均数标准差表示，采用方 差分析 nP0.05为差异有统计学意义 结结 果果 Fig.1 Image of fluorescence microscopy in HepG2 cell at 48h after transfected with control of pcDNATM6.2- GW/ EmGFP-miR. a: in nomal field, 100; b: in fluorescent field, 100; c: in nomal field, 100; d: in fluorescent field, 100. empty plasmid group experimental group a c d b Fig.2 Nude mice on day 35 after inoculated with HepG2 cells transfected stably with VEGF-B siRNA expression plasmid. Fig.4 subcutaneous implanted tumor of nude mice. a: control group, b: experimental group. a b Fig.3 The bar charts are expressed as the average tumor volume and tumor weight in every group. *compared with Ps0 group, P0.05. Fig.4 Expression of VEGF-B mRNA in different transfected groupings was detected by RT-PCR. M: Marker; 0: Ps0 group; 1: Ps1 group; 2: Ps2 proup; 3: Ps3 group. Fig.5 The bar charts are expressed as the IOD ratio of VEGF-B and -actin in every group. *compared with Ps0 group, P0.05. Table1 The effect of VEGF-B siRNA on the growth of HepG2 cells implanted tumor in nude mice(s) *compared with Ps0 group, P0.05 Table2 The VEGF-B mRNA expression of VEGF-B knockdown with siRNA on the invasion of HepG2 cells implanted tumor in nude mice (s) *compared with Ps0 group, P0.05 讨讨 论论 VEGF-BVEGF-B n n 有两种存在形式，即有两种存在形式，即VEGFVEGF-B167B167和和VEGF-B186,VEGF-B186, 二者都是以二硫键相连的同源二聚体二者都是以二硫键相连的同源二聚体 n n 其单体可以与其单体可以与VEGF-AVEGF-A的单体形成二硫键连接的的单体形成二硫键连接的 异源二聚体，协同促进肿瘤血管生成异源二聚体，协同促进肿瘤血管生成 n n VEGF-BVEGF-B主要通过与其受体主要通过与其受体Flt-1Flt-1结合，发挥促血结合，发挥促血 管内皮生长和迁移作用管内皮生长和迁移作用 n n KandaKanda等研究发现肝癌组织中等研究发现肝癌组织中VEGF-BVEGF-B的表达水的表达水 平高于正常肝组织平高于正常肝组织 n唐瑞峰等研究发现VEGF-B蛋白在肝癌组织中阳性表达 率最高，而在癌旁组织、正常肝组织中阳性表达率呈逐 渐下降趋势；VEGF-B受体Flt-1的表达率与VEGF-B成 正相关 nVEGF-B可能在肝细胞癌的发生发展过程中是一个关键 的作用靶点 n为此，我们引入世界上较为先进siRNA技术，通过构建 VEGF-B基因的siRNA载体质粒，转染至肝癌细胞中， 导致VEGF-B的RNA干扰（RNAi）效应 siRNAsiRNA技术技术 n n 一种新的基因阻断技术，能够高效、简单的阻断某一特一种新的基因阻断技术，能够高效、简单的阻断某一特 定基因的表达，它不仅是研究基因功能的有力工具，而定基因的表达，它不仅是研究基因功能的有力工具，而 且为特异性基因治疗提供了新的技术手段且为特异性基因治疗提供了新的技术手段 n n 具体干扰机制分为：起始阶段和效应阶段具体干扰机制分为：起始阶段和效应阶段 n n 在起始阶段，在起始阶段，DicerDicer酶与双链酶与双链RNARNA特异性结合，双链特异性结合，双链 RNARNA被切割成被切割成2123nt2123nt长度的小干扰长度的小干扰RNARNA n n 在效应阶段，在效应阶段，siRNAsiRNA与核酶复合体参与合成与核酶复合体参与合成RNARNA诱导的诱导的 沉默复合体沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)(RNA-induced silencing complex, RISC)并被并被 激活，激活的激活，激活的RISCRISC在胞浆解旋双链在胞浆解旋双链siRNAsiRNA，RISCRISC内部内部 核酸内切酶负责催化其内部的单链核酸内切酶负责催化其内部的单链siRNAsiRNA去识别与之互去识别与之互 补的补的mRNAmRNA链，并对其进行切割，最终在核酸外切酶的链，并对其进行切割，最终在核酸外切酶的 作用下降解切断后的作用下降解切断后的mRNAmRNA，从而阻止靶基因的表达。，从而阻止靶基因的表达。 RNAi模式图 RNAiRNAi技术在现代肿瘤技术在现代肿瘤 基因治疗中的应用基因治疗中的应用 n n 沉默与肿瘤侵袭转移相关的基因表达，如血管内皮生长沉默与肿瘤侵袭转移相关的基因表达，如血管内皮生长 因子信号通路相关的各种基因因子信号通路相关的各种基因 n n 可封闭由原癌基因突变激活的癌基因，由于可封闭由原癌基因突变激活的癌基因，由于RNAiRNAi具有具有 高特异性的优点，可利用高特异性的优点，可利用RNAiRNAi技术特异性阻断癌基因技术特异性阻断癌基因 的表达，而对其他正常基因没有沉默作用的表达，而对其他正常基因没有沉默作用 n n 可抑制细胞周期相关基因的过表达可抑制细胞周期相关基因的过表达 n n 可下调细胞凋亡调控机制紊乱导致相关基因的过表达可下调细胞凋亡调控机制紊乱导致相关基因的过表达 n n 可抑制与肿瘤细胞无限增殖有关的端粒酶的表达可抑制与肿瘤细胞无限增殖有关的端粒酶的表达 n有研究表明，通过siRNA技术阻断VEGF-A165的生成， 可显著抑制包括肝癌细胞、Hela细胞、卵巢癌细胞等多 种癌细胞的生长 nWu X等构建趋化因子受体1基因靶向siRNA质粒载体介 导入肝癌细胞HCCLM3中，使该癌细胞的侵袭能力降 低 n陆彬彬等把VEGF靶向siRNA质粒载体转染肝癌细胞 (SMMC-7721)，可阻断大部分VEGF