山东地区HBeAg阴性慢性乙肝和肝硬化构成比和抗病毒治疗状况的变迁及病毒基因型分析.pdf

山东大学硕士学位论文山东地区hbeag阴性慢性乙肝和肝硬化构成比和抗病毒治疗状况的变迁及病毒基因型分析姓名：刘友德申请学位级别：硕士专业：内科学（传染病学）指导教师：王磊20080515山东大学硕士学位论文符号a l ta s tb c pc h be u s af d a叫h b e a gh b s a gh b vh c cl c bo r f英文名称符号说明中文名称砧a n i n ea i i l i n o t r a n s f e r a s e丙氨酸氨基转移酶舡p a n a t ea m i n o t r a n s f e r a s e天门冬氨酸氨基转移酶b a s i cc o r ep r o m o t e r基本核心启动子c h r o n i ch e p a t i t i sb慢性乙型肝炎e i l z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附反应f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n食品与药物管理局h e p a t i t i sa c t i v i t yi n d e xh e p a t i t i sbea n t 培e n肝炎活动指数乙型肝炎e 抗原h e p a t i t i sbs u r f a c ea n t i g e n乙型肝炎表面抗原h 印a t i t i sbv i m s乙型肝炎病毒h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a原发性肝细胞癌l i v e rc i 盯h o s i so f h e p a t i t i sb乙型肝炎肝硬化o p e nr e a d i n gf r a m e开放读码框架p c r r f l i pp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e s t r i c t i o n聚合酶链反应限制性片蠡阻g m e n tl e n g c hp o l y m o r p h i s m段长度多态性p e gr ts v ru l np o l y e t h y l e n e 寸y c o lr e v e r s et r a n s c r i p t a s e聚乙二醇逆转录酶s u s t a i n e dv i r o l o g i cr e s p 彻s e持续病毒学应答u p p e rl i m i t so fn o 咖a l正常上限7原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名盔：盘日期：进2关于学位论文使用授权的声明本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。( 保密论文在解密后应遵守此规定)者签诹新躲证日期：塑0 _ - = 上山东大学硕士学位论文山东地区h b e a g 阴性慢性乙肝和肝硬化构成比和抗病毒治疗状况的变迁及病毒基因型分析研究生刘友德导师王磊教授专业内科学( 传染病)中文摘要背景与目的：乙型肝炎病毒( h b v ) 是导致人类急性和慢性肝脏疾病的重要病原体，广泛分布于世界各地。据世界卫生组织统计，全球约2 0 亿人曾感染过h b v ，其中3 5 亿人为慢性h b v 感染者，每年约有1 0 0万人死于h b v 感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌( h c c ) 。我国属h b v 感染高流行区，一般人群的h b s a g 阳性率为9 0 9 ，其中慢性乙型肝炎患者超过3 0 0 0 万人。h b v 感染是肝硬化、肝癌的主要原因。在6 岁以前受感染的人群中，约2 5 在成年后将发展成肝硬化和原发性肝细胞癌。所以h b v 感染是我国也是世界的重要公共卫生问题。慢性乙型肝炎( 简称慢乙肝) 和乙型肝炎肝硬化( 乙肝肝硬化) 可分为h b e a g 阳性和h b e a g 阴性两类。慢乙肝和乙肝肝硬化患者出现h b e a g 血清学转换、h b vd n a 阴转及肝功能改善后，一般病情趋于稳定：但部分患者h b e a g 血清学转换后，h b vd n a 水平仍较高，肝组织病变仍继续进展，成为h b e a g 阴性的慢乙肝和乙肝肝硬化。近年来，有关h b e a g 阴性慢乙肝所占构成比的研究逐渐增多，但结果差别较大。另外，根据h b v 全基因序列差异8 或s 基因序列4 ，目前将h b v 分为a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 、h8 个基因型。研究h b e a g 阴性慢性h b v 感染者h b v 的基因型对了解h b e a g 阴性慢性h b v 感染者的流行病学特点、发病机理、疾病演变过程临床诊治及其预后等特征也有重要的意义。为了解本地区h b e a g 阴性慢乙肝和乙肝肝硬化住院患者所占构成比1 0 年间的变化和采取抗病毒治疗的情况，以及h b e a g 阴性慢乙肝和乙肝肝硬化患者与h b e a g 阳性慢乙肝和乙肝肝硬化患者病毒基因型的差异，我们进行了本研究。山东大学硕士学位论文材料和方法：采用横断面回顾性研究方法，统计了济南市传染病医院19 9 6 、2 0 0 1 和2 0 0 6 年1 6 月住院的全部慢乙肝和乙肝肝硬化患者2 5 6 1例。采用型特异性引物巢式p c r 法，检测了济南市传染病医院7 0 低温冰箱冻存的2 0 0 4 年7 月2 0 0 6 年9 月门诊和住院山东籍慢乙肝和乙肝肝硬化患者2 2 0 例血清标本的h b v 基因型。采用s p s s 统计软件对各组资料进行分析。结果：2 5 6 1 例住院患者中，男女比例2 0 2 4 ：5 3 7 ；年龄1 7 9 岁，中位数3 8 岁。在慢乙肝中，h b e a g 阴性患者占2 3 8 ；在乙肝肝硬化中，h b e a g 阴性患者占到5 0 ，高于慢乙肝中h b e a g 阴性患者比例，p o 0 1 。纵向比较，19 9 6 年与2 0 0 1 年h b e a g 阴性乙肝肝硬化患者所占构成比无差异( 4 6 1 ，s4 4 4 ) ，2 0 0 6 年h b e a g 阴性乙肝肝硬化患者所占构成比( 5 4 4 ) 高于1 9 9 6 和2 0 0 1 年，p = o 0 1 4 。1 0 年间慢乙肝和乙肝肝硬化患者的抗病毒治疗率均呈上升趋势，均p o 0 1 。慢乙肝患者抗病毒治疗率( 6 1 9 ) 高于乙肝肝硬化患者( 4 6 0 ) ，p o 0 1 ；h b e a g 阴性慢乙肝患者抗病毒治疗率为5 0 o ，高于h b e a g 阴性乙肝肝硬化患者抗病毒治疗率( 3 8 8 ) ，p = 0 0 0 2 ，二者均低于h b e a g 阳性患者( 6 5 7 ，5 3 2 ) ，均p 0 0 1 。1 8 5 例慢乙肝患者，1 6 6 例( 8 9 7 3 ) 检测出基因型；3 5 例乙肝肝硬化患者，2 7 例( 7 7 1 4 ) 检测出基因型。在可检测出基因型的19 3 例患者中，存在c 、b 和b c 基因型，未见a 、d 、e 和f 基因型。h b e a g 阴性慢乙肝和乙肝肝硬化患者的c 、b c 基因型分别为9 4 7 、5 3 和9 0 0 、1 0 o ，与h b e a g 阳性患者无差异；未见单一b 基因型和其他基因型。结论：本地区慢乙肝住院患者中，仍以h b e a g 阳性患者为主。在乙肝肝硬化住院患者中，h b e a g 阴性患者比例高于慢乙肝中h b e a g 阴性患者比例，且近年来呈升高趋势并已超过h b e a g 阳性患者的比例。本地区的慢乙肝和乙肝肝硬化患者，无论是h b e a g 阴性还是阳性，h b v 基因型均以c 型为主；在h b e a g 阴性慢乙肝和乙肝肝硬化中，未见单一基因b型。1 0 年来c h b 和l c b 患者的抗病毒治疗率均呈上升趋势，但h b e a g阴性患者抗病毒治疗率均低于h b e a g 阳性患者。由于h b e a g 阴性患者年龄偏大，自发缓解率低，更易进展为失代偿肝硬化和原发性肝细胞癌，2山东大学硕士学位论文故应重视h b e a g 阴性c h b 和l c b ，尤其是h b e a g 阴性l c b 的抗病毒治疗。专业医生应该有抗病毒治疗的观念，应该熟悉各种抗病毒药物的作用特点和最新进展，同时还应该了解病人的疾病和经济状况，根据循证医学的资料为患者量身定做治疗方案，即在循证医学的前提下采用个体化治疗。关键词：乙型肝炎，慢性；肝硬化，乙型肝炎：e 抗原，乙型肝炎；肝炎病毒，乙型；基因型。3山东大学硕士学位论文p r o p o r t i o n a lc h a n g ea n da n t i v i r a lt h e r a p yi n1 0y e a r sa n dt h eh e p a t i t i sbv i r u sg e n o t y p e so fh b e a gn e g a t i v ec h r o n i ch e i ，a t i t i sba n dl i v e rc i r r h o s i sbi ns h a n do n ga l 姒p o s t g r a d u a t e ：l i uy 0 u d es u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rw a n gl e im a j o r ：i n t e r n a lm e d i c i n e ( i n f e c t i o u sd i s e a s e )a b s t r a c tb a c k g r o u n da n da i m sh e p a t i t i sbv i r u s( h b v )i saw e l l k n o w na g e n to fa c u t ea n dc h r o n i ch e p a t i t i s ，i td i s t r i b u t e sa l l0 v e rt h ew o r l d i ti ss a i db yt h ew o r l dh e a l l ho r g a n i z a t i o n ( w h o ) ，h b vh a si n f e c t e da b o u t2 b i l l i o ni n d i v i d u a l sw o r l d w i d ea n dc a u s e dc h r o n i cl i v e rd i s e a s e sa b o u t3 5 0m i l l i o n ，o v e r1m i l l i o nh a sd i e d 0 fh b v r e l a t e dl i v e rf a i l u r e ，l i v e rc i r r h o s i s ( l c - b ) o rh e p a t o c e l l u a rc a r c i n o m a ( h c c ) a n n u a l l y c h i n ai sah y p e r e p i d e m i ca r e a0 fh b vi n f e c t i o n t h ep r e v e l a n c e0 fh b s a gc a r r i e r si sa sh i g ha s9 0 9 a m o n gt h eg e n e r a lp o p u l a t i o ni nc h i n a ，a n dt h en u m b e ro fc h r o n i ch e p t i t i sbp a t i e n t si sm o r et h a n 2 0m i l l i o n t h ep r o b a b i l i t yi sa r o u n d2 5 t 0a d v a n c e dt ob el co rh c cw h 0w a si n f e c t e db e l o w6y e a r so l d t h e r e f o r e ，v i r a lh e p a t i t i sbi sam a j o rp u b l i ch e a l t hp r o b l e mi nc h i n aa n dh a sas u b s t a n t i a li m p a c t0 nt h eh e a l t h0 fp e o p l e t h o s ew “hc h r o n i ch b vm a yp r e s e n ti n1o f4p h a s e so fi n f e c t i o n ：( 1 )i nas t a t eo fi m m u n et o l e r a n c e ，( 2 )w j t hh e p a t i t i sbea n t i g e n( h b e a g ) p o s i t i v ec h r o n i ch e p a t i t i s ，( 3 ) a sa ni n a c t i v eh e p a t i t i sbs u r f a c ea n t i g e nc a r r i e r ，o r ( 4 ) w i t hh b e a g - n e g a t i v ec h r o n i ch e p a t i t i s r e c e n t l y ，m o r ea n dm o r es t u d i e sa b o u th b e a g - n e g a t i v ec h r o n i ch e p a t i t i sb ( c h b )a p p e a r e d ，b u tt h e r ea r em a n yd i f f e r e n c e si nt h er e s u l t s a tp r e s e n t ，e i g h tg e n o t y p e so fh b vh a v eb e e nd e t e r m i n e db a s e do nad i v e r g e n c eo v e rt h ee n t i r eg e n o m i cs e q u e n c e = 8 o ro v e rt h esg e n es e q u e n c e = 4 ，a n dt h e ya r en a m e dw i t hc a p i t a ll e t t e r sf r o mat oh t h e r ei si m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ei n4山东大学硕士学位论文r e s e r c h i n gt h eh b vg e n o t y p e si nh b e a gn e g a t i y ec h r o n i ch b vi n f e c t i o n1 0u n d e r s t a n di t sc h a r a c t e r i s t i c so ft h ee p i d e m i o l o g y ，p a t h o g e n e s i s ，p r o g n o s i s ，d i a g n o s i sa n dt r e a t m e n t t bi n v e s t i g a t et h ep r o p o r t i o n a lc h a n g e ，t h ea n t i v i r a lt h e r a p ya n dt h eh b vg e n o t y p eo fh b e a gn e g a t i v ec h ba n dl c - bi nt h i sa r e ad u r i n gt h ep a s t1 0y e a r s ，t h es t u d yw a sc o n d u c t e d m e t h o d s2 5 6 1h o s p i t a l i z e dc h ba n dl c bc a s e sf r o m1 9 9 6 ，2 0 0 la n d2 0 0 6w e r ea n a l y z e dr e t r o s p e c t i v e l y h b vg e n o t y p e sw e r ed e t e r m i n e di n2 2 0p a t i e n t sw i t hc h bo rl c bb yu s i n gn e s t e dp o i y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nb a s e do ng e n o t y p es p e c i f i cp r i m e r s t h es t a t i s t i c sw e r em a d eb ys p s sf o rw i n d o w s d i f e r e n c ew e r ec o n s i d e r e ds t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n ta tapv l a u eo f 0 0 5 ( t w os i d e s ) r e s u l t sa m o n gt h e2 5 6 1c a s e s ，2 0 2 4w e r em a l e s ，t h em e d i a na g ej s3 8y e a r so l d ( 1 7 9 ) t h ep r o p o r t i o no fh b e a g n e g a t i v el c - b ( 5 0 0 ) w a sh i g h e rt h a nc h b ( 2 3 8 ) ，p 0 0 1 i tw a sr i s i n gf r o m4 6 1 i n1 9 9 6t o5 4 4 i n2 0 0 6d u r i n gt h ep a s t1 0y e a r s ，尸= 0 0 1 4 t h er a t eo fa n t i v i r a lt h e r a p yw a sa l s or i s i n gd u r i n gt h ep a s t1 0y e a r si nb o t hh b e a gn e g a t i v ea n dh b e a gp o s i t i v ec a s e s ，n om a t t e ri nc h bo rl c - b ，p o 0 1 i tw a sh i g h e ri nc h bt h a ni nl c b ( 6 1 9 v s4 6 0 ，尸 0 0 1 ) i nt h eh b e a gn e g a t i v ep a t i e n t s ，t h ea n t i v i r a l t h e r a p yr a t eo fc h b ( 5 0 0 ) w a sh i g h e rt h a nt h a to fl c - b ( 3 8 8 ) ，p = o 0 0 2 ；b o t ho fw h i c hw e r el o w e rt h a nt h a ti nh b e a gp o s i t i v ep a t i e n t s ( 6 5 7 i nc h ba n d5 3 2 i nl c - b ) ，p o 0 1 1 6 6 ( 8 9 7 3 )w e r ei d e n t i f i e df o rh b vg e n o t y p e sa m o n gt h e1 8 5c h bc a s e s ，w h i l e2 7 ( 7 7 1 4 ) i nl c - bc a s e s t h e r ew e r eg e n o t y p ec ，ba n db ci nt h e1 9 3c a s e sw h i c hc a nb ei d e n t i f i e df o rh b vg e n o t y p e s g e n o t y p ea ，d ，ea n dfw e r en o tf o u n d t h ep e r c e n t a g eo fg e n o t y p eca n db cm i x e dg e n o t y p ei nh b e a gn e g a t i v ec h ba n dl c - ba r e9 4 7 ，5 3 a n d9 0 0 ，1 0 o r e s p e c t i v e l yi nt h i sa r e a ，w h i c ha r en o ts t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n tf r o mt h eh b e a gp o s i t i v ep a t i e n t s n og e n o t y p eba n do t h e rg e n o t y p e sw e r ef o u n d c o n c l u s i o n si nt h i sa r e a ，h b e a g - p o s j j v ei ss t i l lt h e5山东大学硕士学位论文p r e d o m i n a n tf o r mo fh o s p i t a l i z e dc h b ，t h ep r o p o t i o no fh b e a g n e g a t i v el c bi sm o r et h a n5 0 r e c e n t l ya n di sh i g h e rt h a n5 1 0y e a r sa g o g e n o t y p ecp r e d o m i n a t e st h eg e n o t y p e si nb o t hh b e a gn e g a t i v ea n dh b e a gp o s i t i v ep a t i e n t s n 0g e n o t y p ebw a sf o u n di nh b e a gn e g a t i v ep a t i e n t s t h er a t eo fa n t i v i r a lt h e r a p yw a sr i s i n gd u r i n gt h ep a s t1 0y e a r s ，i ti ss t i l ll o w e ri nh b e a gn e g a t i v ep a t i e n t st h a ni nh b e a gp o s i t i v ep a t i e n t s t h ea n t i v i r a lt h e r a p yo fh b e a gn e g a t i v ec h ba n dl c bs h o u l db et h o u g h tm o r e ，e s p e c i a l l yo fl c b k e yw o r d sh e p a t i t i sbc h r o n i c ，l i v e rc i r r h o s i so fh e p a t i t i sb ，h e p a t i t i sb ea n t i g e n ，h e p a t i t i sbv i r u s ，g e n o t y p e6山东大学硕士学位论文山东地区h b e a g 阴性慢性乙肝和肝硬化构成比和抗病毒治疗状况的变迁及病毒基因型分析研究生刘友德导师王磊教授专业内科学( 传染病)1 上l刚吾乙型肝炎病毒( h e p a t i t i sbv i r u s ，h b v ) 感染呈世界性流行，据世界卫生组织报道，全球约2 0 亿人曾感染过h b v ，其中3 5 亿人为慢性h b v感染者，每年约有1 0 0 万人死于h b v 感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌( h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ，h c c ) 。我国属h b v 感染高流行区，一般人群的乙型肝炎表面抗原( h e p a t i t i sbs u r f a c ea n t i g e n ，h b s a g )阳性率为9 0 9 。接种与未接种乙型肝炎疫苗的人群h b s a g 阳性率分别为4 5 1 和9 5 1 。h b v 感染是h c c 的重要相关因素，中国台湾c h e n等的一项研究显示，血清h b vd n a 水平可预测h c c 风险，h b vd n a高水平是h c c 的独立危险因素。慢性h b v 感染按自然史可分为四期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活动的携带状态期和再次激活期。h b v感染有多种临床类型，包括慢性乙型肝炎( c h r o n i ch e p a t i t i sb ，c h b ) 、乙型肝炎肝硬化( 1 i v e rc i r r h o s i so fh e p a t i t i sb ，l c b ) 、慢性h b v 携带者和隐匿性慢性乙型肝炎。c h b 和l c b 患者出现乙型肝炎e 抗原( h e p a t i t i sbea n t i g e n ，h b e a g ) 血清学转换、h b vd n a 阴转及肝功能改善后，一般进入非活动的携带状态期，病情趋于稳定；但部分患者h b e a g 血清学转换后，h b vd n a 水平仍较高，肝组织病变仍继续进展，成为h b e a g 阴性的c h b 和l c b 。h b e a g 阳性c h b 和l c b 血清h b s a g 、h b vd n a 和h b e a g 阳性，抗h b e 阴性，血清丙氨酸氨基转移酶( a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s e ，a l t ) 持续或反复升高，或肝组织学检查存在炎症坏死和纤维增生；h b e a g 阴性c h b 和l c - b 血清h b s a g 和h b vd n a 阳性，h b e a g 持续阴性，抗h b e 阳性或阴性，血清a l t 持续或反复升高，或肝组织学检查存在炎症坏死和纤维增生【2 1 。上世纪8 0 年代初，地中海地区发现部分hb e a g 阴性c h b 患者：1 9 8 9r山东大学硕士学位论文年确定为由h b v 核酸变异所致。随着时间的推移和分子生物学技术的发展，原本视h b e a g 阴性c h b 为不典型或只局限于地中海地区的少数病例，实际上呈全球性分布，且发病率逐渐增加。而且在分子病毒学、流行病学、发病机制、自然进程和转归方面都与h b e a g 阳性c h b 有着显著的不同。本学位论文对本地区h b e a g 阴性c h b 和l c b 的构成比、抗病毒治疗状况和基因型等进行了研究，虽然采用横断面回顾性研究方法了解h b e a g 阴性c h b 和l c b 住院患者所占构成比1 0 年间的变化不能完全代表h b e a g 阴性慢性h b v 感染者发病率的变化，但从医院住院患者这一侧面，仍能一定程度反映h b e a g 阴性c h b 和l c b 患者的增加趋势，为深入做好传染病的预防工作、为制定乙型肝炎的防治对策提供参考依据。h b v 是目前发现最小的人类d n a 病毒，其完整的病毒颗粒被称为d a n e 颗粒。完整病毒颗粒呈球形，直径4 2 n m ，负染后在电镜下有双层外壳。外膜由h b s a g 、前s 1 和前s 2 蛋白构成，无其他病毒外膜的球形或尖钉状突起。核心颗粒直径3 4 n m ，由多个h b c 蛋白形成2 0 面体的核衣壳，内含3 o 一3 2 k b 环形、部分双链d n a 基因组和d n a 聚合酶。h b v基因组结构独特而精密，由不完全的环状双链d n a 组成。其两条核酸链的长短不一，长链因为与病毒m r n a 互补，按惯例将其定为负链，有固定的长度，约为3 2 0 0 个碱基；而短链即正链，有可变的长度，约为长链的5 0 一1 0 0 ，仅5 端固定，3 端位置不定，故在病毒群体中有不同长度的正链与负链匹配，仅有部分长度为双链。由于2 条d n a 链5 粘性末端的重叠，使双链d n a 能保持环状的构象。它的负链约有3 2 0 0 个碱基，包括4 个开放读码框架( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) ，即s 区、c区、p 区和x 区。最初人们根据h b s a g 分子所具有的共同抗原决定簇和两个互相排斥的抗原决定簇d y 和w r 将h b v 分为9 个血清型：a y w l ，a y w 2 ，a y w 3 ，a y w 4 ，a y r ，a d w 2 ，a d w 4 ，a d r g + ，a d r g 。随着分子生物学和免疫学理论与技术的发展，h b v 的基础研究也取得了显著的进展，人们逐渐认识到血清型并不能完全反映其核酸变异程度。近1 0 年来的研究表明，h b v 血清型与病毒复制能力、临床表现类型、疾病谱、治疗效果以及预后等似无明显相关性；而h b v 基因型与病毒致病性、变异、疗效9山东大学硕士学位论文及预后则有一定的相关性，因此，目前对h b v 分型的研究逐渐集中于基因型的探索。根据h b v 全基因序列差异8 或s 基因序列4 ，目前将h b v 分为a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 、h 8 个基因型。现有的研究表明h b v 基因型的分布有明显的地区差异【3 巧】。a 型主要分布于欧洲北部、西部及北美洲和非洲中部；b 型主要发现于亚洲的中国、印度尼西亚和越南，它是变异最多的一种基因型；c 型主要流行于东亚，如中国、韩国、日本、玻里尼西亚和越南、泰国；d 型分布最广泛，是地中海地区和中东地区的优势基因型，也发现于亚洲少数地区；e 型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地带；f 型主要分布于北美洲的美国和中美洲；g 型发现于法国和美国；h型已在尼加拉瓜、墨西哥、美国的加利福尼亚等地发现。我国主要以b基因型和c 基因型为主，其中北方c 型为主，而南方b 型多见；d 型多见于我国西北等地的少数民族地区；a 型及f 型较少见，未发现其他基因型。感染h b v 后的临床经过与不同基因型有关，感染h b v 人群的基因型别可能与其感染途径、疾病的感染谱、疾病的进展有一定的相关性。在基因型主要为b 型和c 型的亚洲，大量的资料表明【6 1 3 】：c 基因型与严重肝病相关，和b 型相比预后较差。按慢性h b v 携带、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的顺序，b 基因型的出现频率逐渐减少，而c 型逐渐增多【 。c h u 等【“l 对3 3 2 名中国慢性h b v 感染者进行随访调查( 平均4 8个月，12 9 8 个月) ，发现b 型患者有较低的h b e a g 阳性率和显著高的h b e a g 向抗h b e 自发性血清转换率，并且h b e a g 阳性的b 型患者比c型患者年龄偏小，b 型患者自发性h b e a g 血清转换发生比c 型大约早1 0年。日本的0 r i t o 等【1 4 】研究发现：基本核心启动子( b a s i cc o r ep r o m o t e r ，b c p ) 变异在c 基因型中明显比b 基因型多见；与h b e a g 阳性c h b 和l c b 相比，h b e a g 阴性患者中c 基因型比b 基因型常见。以上研究结果提示基因b 型和c 型患者在h b e a g 血清转换率方面的差异及在h b e a g 阴性慢性hb v 感染者和h b e a g 阳性慢性h b v 感染者之间构成比的差异，可能是导致h b e a g 阴性慢性h b v 感染者与h b e a g阳性慢性h b v 感染者临床特征和预后不同的原因之一。1 0山东大学硕士学位论文人感染不同基因型的h b v 可能与感染途径、疾病的感染谱及疾病的进展有一定的关系；不同的h b v 基因型与患者的肝脏病变程度有关；不同的基因型对抗病毒治疗的反应也不同；h b v 基因型还与某些热点变异出现的频率有关。研究h b e a g 阴性慢性h b v 感染者的h b v 基因型对了解h b e a g 阴性慢性h b v 感染者的流行病学特点、发病机理、疾病演变过程临床诊治及其预后等特征均有重要的意义。本研究主要从临床流行病学角度采用横断面回顾性研究方法，了解了济南市传染病医院h b e a g 阴性c h b 和l c b 住院患者所占构成比1 0年间的变化和采取抗病毒治疗的情况，并采用特异性引物巢式p c r 法，检测了2 2 0 例山东籍c h b 和l c b 患者的基因型，比较了h b e a g 阴性c h b 和l c b 患者与h b e a g 阳性c h b 和l c b 患者病毒基因型的差异。山东大学硕士学位论文材料和方法一、研究对象( 一) 济南市传染病医院1 9 9 6 、2 0 0 1 和2 0 0 6 年1 6 月住院的全部c h b 和l c b 患者2 5 6 1 例。分别为1 9 9 6 年3 3 5 例( 1 3 1 ) ，2 0 0 1 年7 4 0例( 2 8 9 ) ，2 0 0 6 年1 4 8 6 例( 5 8 o ) 。其中，c h b 患者1 8 8 1 例( 7 3 4 ) ，h b e a g 阴性患者( 包括c h b 和l c b ) 7 8 8 例( 3 0 8 ) ，男女比例2 0 2 4 ：5 3 7 ；年龄1 7 9 岁，中位数3 8 岁。( 二) 济南传染病医院7 0 低温冰箱冻存的2 0 0 4 年7 月2 0 0 6 年9月门诊和住院山东籍c h b 和l c b 患者血清标本2 2 0 例。其中，c h b 患者18 5 例，男女比例1 5 6 ：2 9 ，年龄1 0 6 2 岁，中位数3 3 岁；l c b 患者3 5 例，男女比例1 9 ：1 6 ，年龄3 6 7 0 岁，中位数5 4 岁。入选病例均符合2 0 0 0 年( 西安) 全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的诊断标准，明确诊断为慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化并排除其它原因导致的肝损害及肝硬化。所有患者均有h b v 血清学标志检测结果，h b s a g 阳性、a l t 和( 或) 天门冬氨酸氨基转移酶( a s p a r t a t ea m i n o t r a n s f e r a s e ，a s t ) 升高。h b e a g 阴性c h b 和l c - b 符合2 0 0 5 年慢性乙型肝炎防治指南的诊断标准。二、观察指标( 一) 肝脏生化学指标：采用美国贝克曼公司生产的c x 7 型全自动生化分析仪，检测试剂由贝克曼公司提供，检测a l t 指。( 二) h b v 血清学标志：1 9 9 6 年采用酶联免疫吸附反应( e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a v ，e l i s a ) 法，试剂为上海科华生物工程股份有限公司提供的乙型肝炎病毒诊断试剂盒；2 0 0 1 和2 0 0 6 年采用微粒子酶免疫分析技术，试剂为美国a b b o t t ( 雅培) 乙型肝炎病毒诊断试剂盒。三、试剂和仪器( ) 核酸提取试剂盒购自美国p r o m e g a 公司。( 二) d n t p 和t a qd n a 聚合酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司。( 三) 琼脂糖购自上海华美生物工程公司。( 四) d n a 分子量标志g e n e r u l e rd n al a d d e r 购自m b if e r m e n t a s1 2山东大学硕士学位论文公司。( 五) 台式高速离心机为德国h e r a e u s 公司b i o f u g e2 8 r 5 。( 六) p c r 热循环仪和凝胶成像仪为美国b i o r a d 公司生产。( 七) h b v 基因型特异性引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，序列见表1 。表lh b v 基因分型引物及序列基因型正义链序列反义链序列】s t a f2 n dabcdefp l ：5 t c ac c a t a t t c t t g gg a a c a a g a 3 b 2 ：5 g g ct c ma ( 玎t c mg g a a c ag _ t 3 b 2 ：5 一g g ct c ma ( 玎t c mg g a a c ag r 3 b 2 ：5 g g ct c ma g t t a mg g aa c ag 1 乙3 b d l ：5 o c ca a ca a g g t ag g ag c r 3 b e l ：5 c a cc a g a a at c ca g at t gg g ac c a - 3 b f l ：5 g y t a c gg t cc a gg g t t c a c a 3 s 4 r ：5 a g aa g at g a g g ca t a g c ag c 3 b a l r ：5 c r cg c gg a g a t tg a cg a g a t gt 3 b b l r ：5 c a g ( 、1 tg g tg a gt g a ( 了gg a g a 3 b c l r ：5 g g tc c ta g g a a tc c tg a tg t tg 3 b 2 r ：5 g g ag g cg g at r rg c rg g ca a 3 b 2 r ：5 g g ag g cg g at y tg c t g g ca a 3 b 2 r ：5 g g ag g cg g at y tg ( t g g ca a 31 s t ：第一轮p c r ；2 n d ：第二轮p c r 。m ：a 或c ；y ：c 或t四、试验方法【1 5 】( 一) h b vd n a 的提取：按照美国p r o m e g a 公司试剂盒说明书操作，具体步骤如下：将5 0 l 待检血清加人到6 0 l 裂解液中，混匀，3 7水浴1 0 分钟，加人3 0 肛l 的t r i s 饱和酚和3 0 l 的氯仿：异戊醇( 4 9 ：1 )溶液，充分混匀后，1 4 0 0 0 转分( r m i n ) 离心1 0 分钟，取上清液，加人等体积的异戊醇和1 0 “l 的醋酸钠( n a a c ) 溶液，2 0 沉淀2 小时，1 4 0 0 0 r m i n 离心1 5 分钟，弃上清液，加人7 5 预冷乙醇5 0 0 i ，1 4 0 0 0 r m j n离心1 0 分钟，弃上清液，沉淀于5 0 干燥后，溶于2 0 肛l 的d e p c ( 焦碳酸二乙酯) 水中，保存在2 0 备用，作为p c r 反应的模板。( 二) 配置2 琼脂糖凝胶：琼脂糖2 克、1xt a e1 0 0 m l 至烧瓶中，微波炉中火2 分钟至完全溶解，在加入1 0 m g m l 溴化乙啶1 2 肛l 充分混匀，待冷至5 0 6 0 倒入电泳板中，凝固备用。( 三) h b v 基因型检测扩增前s 和s 基因区进行h b v 基因分型。第一轮p c r 反应体系4 0 l ( 1 0 缓冲液劬l ，2 m m o l l4 d n t p s4 l ，2 5m m o l lm g c l 22 4 肛l ，3 0m m o l l 外引物正义链p 10 5 l ，3 0m m o l l外引物反义链s 4 ro 5 l ，h b v d n a 模板4 l ，5 u lt a q 酶0 2 肛l ，h 二02 4 4 肛i ) ，按9 5 1 0 分钟：9 4 2 0 秒，5 5 2 0 秒，7 2 1 分钟，扩l3山东大学硕士学位论文增4 0 个循环：7 2 延伸7 分钟。然后取第一轮p c r 产物作为模板进行第二轮扩增。第二轮p c r 分为a 组和b 组进行反应( a 组体系4 0 l ：1 0 x缓冲液4 l ，2 m m o l l4 d n t p s4 l ，2 5m m o l lm g c l 22 4 l ，3 0m m o l l内引物正义链b 2o 5 l ，3 0m m o l l 内引物反义链b a l r 、b b l r 、b c lr各0 5 l ，第一轮p c r 产物5 l ，5 u lt a q 酶0 4 肛l ，h 2 0 2 2 2 l ，可扩增基因a 型、b 型和c 型；b 组体系同样为4 0 l ：1 0 缓冲液4 肛l ，2 m m o l l4 d n t p s4 i ，2 5m m o l lm g c l 22 4 l ，3 0m m o l l 内引物正义链b d l 、b e l 、b f l 各0 5 肛l ，3 0m m o l l 内引物反义链b 2 r0 5 l ，第一轮p c r产物5 l ，5 u lt a q 酶0 4 l ，h 2 02 2 2 l ，可扩增基因d 型、e 型和f 型) ，按9 5 1 0 分钟；9 4 2 0 秒，6 5 2 0 秒，7 2 3 0 秒，扩增4 0 个循环；7 2 延伸7 分钟。然后取第二轮p c r 产物1 0 肛l ，经2 琼脂糖凝胶1 0 0 v 电泳2 0 分钟，用凝胶成像仪观察电泳条带的大小。h b v 各基因型p c r 产物大小为：a 基因型为6 8 b p ，b 基因型为2 8 1 b p ，c 基因型为1 2 2 b p ，d 基因型为1 1 9 b p ，e 基因型为1 6 7 b