mir21在白血病发病过程中的作用研究(1)

miR21miR21 在白血病发病过程中的作用研究在白血病发病过程中的作用研究 (1)(1) 这篇miR21 在白血病发病过程中的作用研究论文是由系 统蜘蛛程序自动抓取于互联网上，需要查看更多精品论文 请点击：论文频道：lwxz/ 作者：张帅王 萍玉尹娟李有杰马颖谢书阳 【摘要】 目的本实验旨在研究 miR21 在白血病细胞 中表达情况，探讨 miR21 基因与白血病发病的关系。方 法提取组织中的小于 200bp 的 RNA,用 poly 聚合酶在其 3 末端加尾，再用 5带 40nt 延伸序列的单碱基锚定 OligdT 引物进行反转录，然后用特异引物进行 realtimePCR 扩增，从而检测部分 miRNAs 在白血病细胞 株 K562 中的表达，并与正常人骨髓表达情况相对比。结果 通过 realtimePCR 分析，癌基因 miR21 在 K562 细胞中 的表达量约为是近几年在真核生物中发现的一类具有调控 功能的非编码 RNA，大小约为 2125 个碱基的单链小分子 RNA。miRNA 能调节生物体生长、发育和疾病发生过程中有 关基因的表达1，2 ，推测这种小分子调控人类近 1/3 的 基因，平均每个 miRNA 可调节人类 200 种不同的 mRNA 表达， 并且多个 miRNA 能够协调调节一些特殊的靶基因3 。研 究发现 miRNAs 在正常血细胞分化过程中发挥着重要作用， 因此 miRNAs 的异常表达可能与血液系统疾病的发生和发展 密切相关。 目前，随着生物信息学的发展和靶基因实验的确定，有 助于揭示 miRNAs 在调控正常血细胞分化以及相关血液系统 肿瘤中的详细分子机制，miRNAs 的检测有望成为某些血液 系统肿瘤的诊断方法，miRNAs 及其靶基因的表达控制也可 能成为治疗某些血液系统肿瘤的手段。本研究旨在应用 realtimePCR 研究 miR21 在白血病细胞中表达情况，探 讨其与白血病发病的关系。 1 材料与方法 细胞培养 K562 细胞用 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，于 5%CO2、37条件下培养。正常人的骨髓细胞由山东省烟台 山医院提供。 小 RNA 的提取 用 mirVanaTMmiRNA 提取分离试剂盒从白 血病细胞株 K562 细胞中分离小片断 RNA。按说明书步骤， 从 1106 个细胞中提取出小片段 RNA 溶解在 30l 的无 RNA 酶水中，紫外分光光度计定量。 miRNA 的克隆和逆转录 取 g RNA 和 5U 多聚（poly） 腺苷酸聚合酶置于 50l 反应管中，37条件下 30min 进 行小 RNA 的多聚腺苷酸化。将带有 poly 尾的小 RNA 溶于适 量无 RNA 酶 H2O 中，在 20l 体积中，应用 GeneRacer 试 剂盒 SuperScriptTMRT 部分进行反转录：10l 带有 poly 尾的小 RNA 在 1l 反转录引物5 GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG243 、 1ldNTP 混合物和 1l 无菌蒸馏水的孵育作用下，65条 件下 5min，冰浴 1min，加入 5buffer4 l，mol/LDTT1l，200U/l 反转录酶 1l，加水至 20l，42，1h。最后，反转录酶在 70 条件下孵育 15min 灭活。准备 cDNA 扩增。 PCR 检测目的 miRNA 取上述逆转录得到的 cDNA 进行 PCR 扩增：引物：上游引物 P1：5 TAGCTTATCAGACTGATGT3 ；下游引物 P2：5 CGACAGTTGCTATGCGATGCA3 。反应条件：94预变性 3min，1 个循环；94变性 30s，60退火 30 s，72延伸 20s，30 个循环；72延伸 10min，1 个循环，琼脂糖凝胶 分离 DNA 片段。 realtimePCR 反应 标准品制备：将上述 PCR 产物连 接到 T 载体上（Invitrogen 公司） ，筛选含有插入片段的载 体，将标准品稀释至 1107、1106、1105、1104、1103copies/l， 使用 realtimePCR 仪测定定量曲线和标准曲线。反应 条件：realtimePCR 使用 RG3000system，变性:95 10min，延伸 9530s，6830s，72 30s，40 个循环， 测定吸光值。 2 结果 RTPCR 检测 miR21 在 K562 细胞中的表达 结果发现 miR21 在 K562 细胞中表达量相对较高，见图 1。 克隆的质粒 DNA 鉴定 提取经筛选的用于制作标准曲线模 板的质粒 DNA,经过 PCR 及酶切证实,目的片段已连接至 T 载 体上（图 2） 。 realtimePCR 检测 miR21 在 K562 细胞中的表达 检测 癌基因 miR21 的表达量约为，microarray6等，这些 基于分子杂交的方法敏感性低，需要的 RNA 量较大。 RTPCR 方法是目前检测基因表达最灵敏、可靠的方法，但 miRNAs 分子太小，用常规的 RTPCR 检测有局限，需要特 殊的设计。 实时荧光定量 PCR 技术是在 PCR 反应体系中加入荧光试 剂，利用荧光信号实时检测 PCR 进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析的方法。1991 年 Holland 等7 首先报道了运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针与模板相结 合，然后利用 DNA 聚合酶 53核酸外切酶的活性将探 针切断，使探针的能量传递结构破坏发出荧光来定量 PCR 产物。1996 年 PE 公司在 Holland 等运用