velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株u266细胞凋亡研究(1)

VelcadeVelcade 诱导多发性骨髓瘤细胞株诱导多发性骨髓瘤细胞株 U266U266 细胞凋亡研究细胞凋亡研究(1)(1) 作者：陈丽娟，李建勇，钱思轩，朱广荣，郑文娟 【摘要】 为了研究 velcade 诱导多发性骨髓瘤细 胞株 U266 细胞凋亡效应及机制，采用台盼蓝拒染法检测 2、10、50 和 100nmol/Lvelcade 处理 U266 细胞活率，用流 式细胞术分析 Annexin-V、线粒体跨膜电位和氧自由基 （ROS） ，用半定量 RT-PCR 法检测 bcl-2mRNA 的表达。结果 表明：velcade 抑制 U266 细胞增殖；诱导 U266 细胞凋亡， 24 小时 Annexin-V 阳性细胞比例增高，M 降低；12 小 时时活性氧明显增高，荧光强度增强；抗凋亡基因 bcl-2 表达降低。结论：velcade 对 U266 细胞具有增殖抑制和杀 伤作用，其可通过内源性细胞凋亡信号通路诱导 U266 细胞 凋亡。 【关键词】velcade;多发性骨髓瘤;细胞凋亡 MultipleMyelomaCellLineU266ApoptosisInducedbyVelcad e AbstractToinvestigatetheeffectofvelcadeonmultiplemy elomacelllineU266apoptosisanditsmechanism，cellviab ilitywasestimatedbytrypanbluedyeexclusion.Annexin- V，mitochondrialtransmembranepotentialandreactiveox ygenspecieslabeledbyDCFHDAwereexaminedbyflowcytomet ry，theexpressionofbcl-2mRNAwasdetectedbysemi- quatitativeRT- PCR.Theresultsshowedthatthevelcadeinhibitedthegrowt hofU266cellsandreducedcellviabilityaccompaniedbyapp earanceofmorphologiccharacteristicsofapoptosis.Velc adeat50nmol/LincreasedAnnexinVpositivityandfluoresc enceintensityofDCFbecauseofROSgenerationwhileitdecr easedthemofU266cells.Expressionofanti- apoptoticgenebcl- 2mRNAalsodecreased.Itisconcludedthatvelcadeinhibite thegrowthandreducecellviabilityofU266cells.Velcadec aninduceU266cellsapoptosisbyintrinsiccellapoptoticp athway. Keywordsvelcade;multiplemyeloma;apoptosis 多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞克隆性增生的血液 系统恶性肿瘤，多发生于老年人。随着社会人口的老龄化， 其发病率呈逐渐增高的趋势。几十年来对 MM 一直采用激素 和细胞毒性药物联合治疗，尽管近年来加用反应停抑制血 管新生治疗或采用自体骨髓移植治疗，但其仍是一种不可 治愈的血液系统肿瘤。由此可见，开发新的治疗方法有重 要的临床价值。蛋白酶体抑制剂近年来作为 MM 新的治疗制 剂用于临床试验，本研究就临床新药蛋白酶体抑制剂 velcade 诱导多发性骨髓瘤细胞株 U266 细胞的凋亡作用进 行探讨。 材料和方法 细胞培养 U266 细胞置于含 10%的热灭活胎牛血清的 RPMI1640 培 养液（Gibco 公司产品）中，于 37、5%CO2 和 95%空气湿 度条件下进行培养。实验过程中，细胞以（2-5）105 细 胞/毫升的密度接种培养，并与不同浓度 velcade 一起进行 孵育，对照加 DMSO。细胞活率由台盼蓝拒染法检测，根据 处理组存活细胞数与死细胞数的比例来计算。形态学观察， 细胞用 cytospin 收集至载玻片，用瑞氏染液染色并置于光 学显微镜下观察。每次试验重复 3 次。生长抑制率及细胞 活率按如下公式计算： 生长抑制率对照组细胞数100% 存活率 活细胞数100% Annexin-V、线粒体跨膜电位和氧自由基（ROS） 的流式细胞仪分析 Annexin-V 分析 使用 FITC 标记的 AnnexinV 和 PI 双染法检测细胞凋亡， 根据 BectonDickinsonBiosciences 公司提供的说明书进行 操作。简单地说，取（1-2）105 细胞，经 PBS 漂洗后加 100l 结合缓冲液，重悬细胞，加 5lAnnexinV- FITC，10lPI 避光孵育 15 分钟后加 400l 结合缓冲液， 用流式细胞仪检测。 线粒体跨膜电位检测 取 5105 细胞，用 PBS 清洗 1 次，加入 10g/mlRh123（Sigma 公司产品）37孵育 30 分钟，用 PBS 漂洗 1 次，加入终浓度 10g/mlPI4暗处放置 30 分 钟，用流式细胞仪检测。 活性氧测定细胞内活性氧测定方法参照文献1方法进行， DCFHDA 自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成 DCFH，在活性 氧存在下被氧化成 DCF，DCF 荧光强度与细胞内活性氧水平 呈正比。DCF 的激发波长为 485nm，吸收波长为 530nm。将 药物处理的细胞（1105）经过 PBS 洗涤，重悬于 1ml 含 有 10mol/LDCFHDA 的 PBS 中，以未加染料的样品作为对 照，37孵育 20 分钟，以 PBS 洗涤 2 次，用流式细胞仪检 测 5000 个活细胞的荧光强度。 velcade 诱导多发性骨髓瘤细胞株 U266bcl-2mRNA 表达的半定量 RT-PCR 检测 细胞总 RNA 抽提收集 3106 细胞，用 TRIzoL 试剂 （GibcoBRL 产品）按说明书抽提细胞总 RNA。 cDNA 合成及 PCR 扩增方法参见文献2 ，PCR 引物： GAPDH：有义链 5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3；反义链 5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3。bcl-2:有义链 5- ACTTGTGGCCCAGATAGG-3，反义链为 5- CGACTTCGCCGAGATGTC-3。PCR 产物用 6%聚丙烯酰胺凝胶 电泳分析照相，在双波长色谱扫描仪上扫描电泳带。GAPDH 片段长度 216bp，bcl-2 片段 389bp。 结果 velcade 对 U266 细胞增殖抑制和杀伤作用 研究结果表明，velcade 可以抑制 U266 细胞的生长， 同时伴有细胞活率的降低。U266 细胞经 2、10、50 和 100nmol/L 浓度 velcade24 小时处理后生长抑制率的 3 次均 值分别为、和，48 小时时分别为、%、和 ；在 0、2、10、50 和 100nmol/L 浓度时 24 小时活率分别 为、和，48 小时时分别为、 和%。根据活率 48 小时时下降 70-80选择药物浓度，因 此选择 velcade50nmol/L 作为药物处理浓度（图 1） 。 velcade 对 U266 细胞凋亡作用 50nmol/Lvelcade 处理的 U266 细胞呈现出细胞形态学 改变，表现为染色体凝聚、细胞核破裂而细胞膜保持完整 及出现多个凋亡小体等（图 2A） 。24 小时 AnnexinV