tem116型esbl天然酶与重组酶的动力学特性研究(1)

TEM116TEM116 型型 ESBLESBL 天然酶与重组酶的动天然酶与重组酶的动 力学特性研究力学特性研究(1)(1) 作者：曾贤铭陈秀枢王震吕建新楼永良孙长贵陆永绥 【摘要】目的研究 TEM116 型 ESBL 天然酶与重组酶 的动力学特性，并比较它们的差异。方法采用紫外分光光 度法检测酶促抗生素水解反应，以 LeeWilson 改良双倒 数方程数据处理法进行数据处理，测定天然酶与重组酶的 Km、Vmax 及 kcat。观察温度和 pH 对酶促反应的影响。结 果以 LeeWilson 改良双倒数方程数据处理法进行数据处 理方便而准确地测定了天然酶与重组酶的 Km 与 Vmax 并计 算出 kcat。温度和 pH 对天然酶与重组酶酶促反应效应相似。 天然酶与重组酶最优先的底物均为头孢哌酮，其次是头孢 氨苄；对氨苄西林、阿莫西林、青霉素和哌拉西林有最高 的催化效率。结论天然酶与重组酶的动力学参数无显著差 异。 【关键词】动力学 内酰胺酶重组蛋白 内酰胺类 抗生素 KineticcharacteristicsofnativeandrecombinantTEM11 6betalactamases ABSTRACTObjectiveToinvestigateandcomparethekineticc haracteristicsofnativeandrecombinantTEM116betal actamases.MethodsHydrolysisreactionsofbetalactama ntibioticsweredetectedbyultravioletphotometry.Dataw asprocessedaccordingtoLeeandWilsonsimproveddouble reciprocalequation.Kineticparametersofnativeandre combinantTEM116betalactamases,includingKm,Vmaxa ndkcat,weredetermined.EffectsoftemperatureandpHonen zymaticreactionwereobserved.ResultsMichaelesconstan tandmaximalvelocitywereobtainedbymeansofLeeandWilso nsimproveddoublereciprocalequation,andthecataly ticconstantwascalculated.ThereweresimilarpH or temp eratureeffectsoneithernative or recombinantbetala ctamases.Themostpreferentialsubstrateforbothnativea ndrecombinantTEM116betalactamasesiscefoperazone andfollowedbythenextcephalexin.Amongthehighestcatal yticefficiencyareampicillin,amoxicillin,penicillina ndpiperacillin.ConclusionThereisnodifferenceofkinet iccharacteristicsbetweennativeandrecombinantTEM11 6betalactamases. KEYWORDSKinetics;Betalactamases;Recombinantprotei ns;Betalactamantibiotics ESBLs 的产生机制是细菌在抗生素选择压力下，由 TEM1 或 TEM2 型酶的活性中心发生一个或数个位点的突 变，导致底物谱的超广谱化1 。XX 年首先分离自 Klebsiellapneumonia 和 Escherichiacoli 临床株的 TEM116 型超广谱 内酰胺酶是病原菌产生的一种耐药 酶，能够催化水解青霉素类、第一三代头孢菌素等 内酰胺抗生素的内酰胺环，使之失去抗菌活性。TEM 型 ESBLs 是在亚洲地区具有流行趋势的超广谱酶，与 TEM1 相比，它在第 84 位点由 Ile 置换 Val，在 184 位点由 Val 置换 Ala，由于这两个氨基酸位点的突变，导致它对青霉素 类药物保持高催化效率的同时，还能够水解绝大部分的第 一三代头孢菌素2，3 。该酶属于 Bush 功能分类 2be 群，Ambler 结构分类 A 类4，5 。 基因水平的分子生物学特征和以底物谱为基础的酶动 力学特性是研究新型 ESBLs 的两个重要途径，也是新型 内酰胺药物开发和酶抑制剂研究的标志性参考指标 6，7 。由于高纯度酶的获取十分困难，我们认为以往大 多以部分纯化或粗制酶为材料所进行的有关动力学研究结 果在文献间的可比性和实际引用中的参考性等方面存在一 定缺陷8 。在动力学特征研究中，准确和精密的 Km 和 kcat 是最重要的动力学参数9，10 ，前者表示酶与底物 的亲和能力，后者是酶完全被底物饱和时单位时间内每个 酶活性中心所能催化底物转变为产物的分子数，又称酶的 催化常数。为此，我们以高纯度 TEM116 型天然酶和重组 酶为材料，对 16 种 内酰胺药物进行动力学特性和其它 生物化学参数进行比较性研究，报告如下。 1 材料与方法 仪器与器材 发酵罐；AKTA 蛋白质分离纯化系统；十万分之一电子 天平；UV2201/Visrecording；CEQTm8800 基因测序系统； 测定等电点的预制 IEFpolyacrylamidegel；SephacrylS100 柱； SephadexG25 柱。 抗生素与试剂 氨曲南购自上海施贵宝制药有限公司；头孢西丁海南 海药股份公司产品；亚胺培南杭州默沙东公司生产；呈色 头孢菌素头孢硝噻吩购自 Oxoid。以下抗生素均为中国药品 生物制品检定所化学对照品：头孢氨苄；头孢羟氨苄；头 孢拉定；头孢唑林；头孢呋新；头孢哌酮；头孢噻肟；头 孢曲松；头孢他啶；氨苄西林；阿莫西林；哌拉西林；苯 唑西林；氯唑西林；青霉素；克拉维酸。其它化学试剂均 为分析纯。 菌株与高纯度 TEM116 型天然酶和重组酶 高产 TEM116 型 ESBL 的 Escherichiacoli 临床株分 离自尿路感染的尿样本，经 API20E 系统鉴定。工程菌的重 组、测序与鉴定、天然菌和重组菌的发酵、酶蛋白的分离 与纯化均由本基金项目另一课题实施。其主要步骤为：单 个菌落接种于 100ml 含 30g/ml 的 LB 肉汤中，37摇床 培养 812h 后，取其 70ml 转种于含 30g/ml 的 LB 肉汤 中，发酵罐内 37培养至 A600时，加入诱导剂并在 30 继续孵育 68h，然后，浓集菌体经超声裂解、包涵体复性、 溶解后，在 AKTA 蛋白质纯化系统，溶解液通过预平衡的 SephacrylS100 柱，再通过 SephadexG25 柱脱盐，用头孢 硝噻吩为底物检测确认，收集高浓度酶活性组分，经 Centriprep10 滤膜过滤浓缩后，低温冰冻干燥、分装后 存于-20备用，天然酶每瓶蛋白，测定前以/L、的磷酸盐 缓冲液复溶至 890l；重组酶每瓶蛋白，以上述 PBS 复溶 至 1000l。活性组分在 AKTA 系统 HPLC，280nm 处监测为 单一峰，经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电