ppt课件-western blot 技术原理及常见问题分析-2014

Western blot Western blot 技术原理及技术原理及 常见问题常见问题分析分析 东胜创新 科学仪器部 2014.7 qqWestern BlotWestern Blot简介及原理简介及原理 qqWestern BlotWestern Blot一般流程一般流程 qqWestern BlotWestern Blot常见问题分析常见问题分析 Western Blot 简介： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用 相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上， 并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段，称为Southern 印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对 RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白 质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质 分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 Western Blot Western Blot 基本原理基本原理 Western Blot Western Blot 优点优点 p 高分辨率的电泳技术 p 特异敏感的抗原-抗体反应 p 1-5ng中等大小的靶蛋白 Western BlotWestern Blot应用应用 q目的蛋白的表达特性分析 q目的蛋白与其它蛋白的互作 q目的蛋白的组织定位 q目的蛋白的表达量分析 蛋白表达分析蛋白表达分析- -定性定性 两种蛋白（47kDa和55kDa) 的诱导表达分析 诱导剂：Q23和Q70 温度：33和39 时间：7天、14天、21天 蛋白表达分析蛋白表达分析- -相对定量相对定量 示例 2 示例1 蛋白表达分析蛋白表达分析- -绝对定量绝对定量 proA proB IP: anti-proBNo IP WB: anti-proB WB: anti-proA proA IgG proB 蛋白相互作用研究蛋白相互作用研究 Western Blot Western Blot 流程流程 l蛋白样品的制备 SDS-PAGE 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 蛋白样品的变性蛋白样品的变性 2SDS-PAGE上样缓冲液： DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。 按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加热515min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量20 50g。 1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml 1M DTT20 ml SDS4 g 甘油20 ml 溴酚蓝0.2 g 总体积100ml 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT 4%SDS 0.2%溴酚兰 20%甘油 ddH2O SDS(十二烷基硫酸钠 )： 阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷 量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线 性化。 q 不连续的电泳缓冲体系。 q SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电 荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶成分 M丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺 神经毒素！ MSDS M配胶的Tris缓冲液 MTEMED 神经毒素！ M过硫酸铵(AP） 神经毒素！ MTris-甘氨酸电泳缓冲液 凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（）线性分离范围（KD) 1512-43 1016-68 7.536-94 5.057-212 SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方 表：/thread-20726-1-1.html 灌制分离胶 隔绝空气 ddH2O 0.1%SDS:8% 灌制浓缩胶 插入梳子 浓缩胶 分离胶 样品 加样槽 蛋白质分 子的迁移 方向 1 2 3 M 电泳之后凝胶染色扫胶 注意： 做western blot通常用预 染Marker！ 转膜 要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固 相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法： 毛细管印迹法和电泳印迹法。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者 的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和 施加电场的机械装置不同。 转移膜的选择转移膜的选择 最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸 纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟 乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜 ，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋 白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用 于核酸杂交。 各种膜的详细特点介绍： /bio101/2008/21461_2.htm 湿转系统 注意事项： 1.胶在负极，膜靠近正极 2.保证每层之间没有气泡 3.转膜过程产生大量热量，需冰浴 夹板 海绵 滤纸 凝胶 膜 滤纸 海绵 正极负极 半干转印系统 注意： 防止短路！ 转膜后检测（此步可以省略）转膜后检测（此步可以省略） 丽春红染色丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。 封闭封闭 S 作用：为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特 异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点 进行封闭处理。 S 封闭剂： 5%脱脂奶粉或BSA，或3%明胶溶于TBST Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） 室温孵育1h或4过夜 注：Tween-20的作用：减少非特 异性吸附，不影响抗体与抗原的 结合。 一抗、二抗孵育 1.把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿 中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量 加入一抗溶液，摇床上平缓摇动， 于室温孵育1-2小时或4过夜。 2.用TBST漂洗膜3-5次，每次5-10min 。 3.加入用封闭液配制的二抗，摇床上 缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或 4过夜。 4.用TBST漂洗膜3次，每次5-10min。 5.最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 6.加入显色底物进行显色反应。 加入一抗，室温 孵育1-2小时或 4过夜 洗膜 加入二抗，室温 孵育1-2小时或 4过夜 洗膜 显色 不同标记的二抗及成像不同标记的二抗及成像方法大方法大PKPK 125I标记的抗体 X-光片压片显色 荧光基团标记的抗体 凝胶成像仪 酶标抗体 ：如HRP（辣根过氧化物酶）、AP（碱性磷酸酶）等 成像方法：加酶的底物产生化学发光反应 不同标记的二抗及成像方法大不同标记的二抗及成像方法大PKPK HRP（辣根过氧化酶)AP（碱性磷酸酶） 大小40Kd140Kd 最佳酶活性PH：57PH：810 酶活和二抗特异性好于AP 抑制剂氰化物， 硫化物 叠氮钠 氰化物， 砷酸盐，有机磷， 二价阳离子螯合剂 稳定性零度以下稳定零度以下不稳定 底物很多部分 动力学特性快速慢 价格便宜昂贵 发光底物 ECL 显色底物TMB，CN，DABNBT，BCIP，NBT/BCIP 两种常用检测酶系统的比较 u 显色反应：HRP敏感物TMB，CN，DAB等底物 优点：方便、便宜，直接成像 缺点：有毒、灵敏度较低、背景高、反应慢、线性窄、不易保存、 不能重新剥离检测 辣根过氧化物酶（HRP）标记 化学发光示意图 碱式磷酸酶（AP）标记 化学发光示意图 u 化学发光显色：目前使用最多的方法 标HRP二抗加ECL底物化学发光反应 优点：灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、 特异性高、可重新剥离检测 灵敏度：MicroChemi 胶片曝光 压片 vs. CCD成像 暗室压片MicroChemi CCD成像 价格便宜，但需要不断投入比较贵，但只需一次投入 有毒？有毒，污染环境无毒，环保 操作复杂，需要技术经验简便易学，且可连续曝光不同时间 成像质量 压片后需要二次成像，图像 质量损失严重 一次性无损拍照，永久保存 成像后处理不可可后期调节对比度至理想状态 是否能直接叠加Marker否，需要比对划线是，快速直接叠加 动态范围比较小宽，可达到4.6个数量级 是否可以定量分析否是，仪器自带图像分析软件 显 影 液 定 影 液 (1)压片 (2)显影 (3)定影 (4)晾干 (5)存储 1小时-1天 1-10分钟 成像仪与成像仪与 传统传统X-X-光片显影光片显影 暗室操作过程 压片实例 压片：无法准确获得目的条带的大小，只能固定胶片位置在 胶片上标出Marker的大概位置 CCD成像 动态范围大，能直接叠加Marker，便于后期图像的处理及分析 Marker直接叠加在化学发光图像上 Western Blot化学发光成像 特推荐东胜创新经营DNR公司MicroChemi化学发光 检测系统，灵敏度高，操作简便功能齐全，价格实惠 产品特点： l高灵敏度：超亮大光圈镜头、大尺寸科学级 CCD、-60低温制冷三重配置为检测化学发光信号 带来高灵敏度、高质量的成像效果 l一键拍照：整个拍照过程只需点击一个按钮， 即可获得精准高质图像 l快速叠加Marker：落射白光实现样品与 Marker的准确定位，方便快速在Western的图像上直 接叠加Marker l可清洗的样品盘：可完全抽出清洗，避免样 品间的交叉污染和实验台面的污染，延长仪器的使用 寿命 其他成像方法示例 Western Blot结果分析 目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正 误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对 含量。 分析软件如GelQuant等 Western BlotWestern Blot常见问题分析常见问题分析 SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 uu胶不平？胶不平？ uu凝胶漏液？凝胶漏液？ 胶玻璃板洗刷干净胶玻璃板洗刷干净 加入加入APAP和和TEMEDTEMED的量要合适的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防加入试剂后摇匀，使其充分混合，防 止部分胶块聚合不均匀止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不温度合适，受热不均匀导致胶聚合不 均匀均匀 两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐 uu条带比正常的窄？条带比正常的窄？ uu“ “微笑微笑” ”或或“ “倒微笑倒微笑” ”条条 带？带？ uu条带微弱？条带微弱？ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适合适 蛋白浓度不够，加大上样量蛋白浓度不够，加大上样量 蛋白样品是否保存良好，不能反复冻蛋白样品是否保存良好，不能反复冻 融，提取过程防止蛋白降解融，提取过程防止蛋白降解 SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 转膜及抗体检测转膜及抗体检测 uu凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？ uu条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？ uu单个或多个白点？单个或多个白点？ uu转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液 中浸泡中浸泡5-10min5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，“ “三三 明治明治” ”结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和凝胶之间没有气泡确保膜和凝胶之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压 太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温 转移到膜上的蛋白很少 1.蛋白分子量 10KD 2.蛋白的等电点 9 3.SDS浓度不合适 4.凝胶太厚 原因 对 策 1.蛋白分子量10KD时，减 少转膜时间；使用小孔径 的膜 2.更换高pH值Buffer 3.在阴极buffer中加入 0.005 - 0.01% SDS 可提 高转膜效率 4.延长转膜时间 1.膜没有均匀浸湿 2.膜或者缓冲液污染 3.封闭不充分 4.抗体与封闭剂出现交 叉反应 5.抗体浓度过高 原因 对 策 1.PVDF膜转膜前用100%甲醇将膜 完全浸湿，转膜前用缓冲液浸 泡10min 2.拿取膜与吸水纸时要戴手套， 更换新鲜转膜缓冲液 3.更换封闭剂或延长封闭时间 4.检测一抗、二抗与封闭剂是否 有交叉反应 如有，更换封闭剂或抗体 5.做预实验检测确定一抗、二抗 的最佳工作浓度 背景太高 杂交信号很弱或没有 1.抗体不适合于western blot 2.抗体浓度太低 3.抗体保存不当 4.抗原不充足 5.膜的漂洗过度 6.转膜不充分 原因