n软脂酰基壳聚糖的制备及其改善靛玉红水溶性的药动学研究(1)

NN软脂酰基壳聚糖的制备及其改善靛软脂酰基壳聚糖的制备及其改善靛 玉红水溶性的药动学研究玉红水溶性的药动学研究(1)(1) 作者：王来友蒋刚彪方羽生巫玮臧林泉曾明华 【摘要】 目的制备 N软脂酰基壳聚糖（PLCS）纳米 胶束，改善难溶性药物靛玉红的溶解性与生物利用度。方 法首先使用溶胀的壳聚糖与软脂酸酐在二甲基亚砜溶剂中 反应合成水溶性的 PLCS，通过 IR 和 1HNMR 表征 PLCS 的 结构；然后用其负载靛玉红，以激光散射和透射电镜检测 载药纳米胶束的物理特征,用 HPLC 法测定其包封率。最后 进行载药纳米胶束腹腔注射给药后在大鼠体内的药动学实 验,与靛玉红混悬剂对照。结果合成得到的 PLCS 能很好地 负载并增溶靛玉红，载药率可达 10%左右。药动学研究表明， 用 PLCS 载靛玉红后较靛玉红混悬剂的 AUC 提高了倍，显著 提高了靛玉红在大鼠体内的生物利用度。结论 PLCS 可作为 提高难溶性药物靛玉红生物利用度的有效载体，进而可能 改善靛玉红治疗白血病的疗效。 【关键词】 靛玉红 N软脂酰基壳聚糖纳米胶束药动 学 从青黛等中药中提取的靛玉红在白血病治疗中已显示 出独特的优势，它既能有效破坏白血病细胞，又对正常骨 髓无明显抑制作用。然而靛玉红的水溶性很差，不利于被 吸收，生物利用度非常低；同时，它对胃肠道黏膜有很强 的刺激作用。吴正红等1认为可通过增加靛玉红的溶解 度以提高其生物利用度，在剂型设计上要以提高靛玉红的 溶解度为中心。目前，通过对壳聚糖表面进行修饰并利用 其做为药物载体，是新型水溶性制剂研究的前沿阵地2 。 SiricaAE 等3曾报道壳聚糖本身对白血病癌细胞具有选 择性聚集作用，而且壳聚糖及其衍生物对白血病癌细胞也 有较强的抑制作用4 。因此，本文采用壳聚糖分子接枝 软脂酰基，制备 N软脂酰基壳聚糖（PLCS）来增溶控释靛 玉红，以提高靛玉红的生物利用度和降低其对消化道的毒 副作用，并发挥壳聚糖衍生物纳米粒子作为抗白血病药物 载体所具备的独特优势。 1 材料与方法 试剂、药品与仪器 壳聚糖（分子量 45kDa，脱乙酰度为 95，上海博奥 生物科技公司） ，软脂酸、乙酐（广州化学厂） ，HPLC 用甲 醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯，靛玉红 （自提取，纯度 95以上） 。 LC10AT 高效液相色谱仪，Nicolet670FTIR 红外光 谱仪，Mercureplus300MHz1HNMR 核磁共振仪 （Varian,USA） ，BI200SMgoniometer 激光散射仪， JEMXX 电子显微镜，IECMicromaxMicroentrifuge。 PLCS 的合成与聚合物结构表征 PLCS 的合成方法 参考 Hirano 等5的方法: g（moL）壳聚糖（脱乙酰度 95%）溶解在 100mLmol/L 的稀 乙酸中，再以 mol/LNaOH 溶液沉淀，过滤，蒸馏水洗涤到 pH 值接近 7，沥干水分，分散到 100mL 二甲基亚砜 （DMSO）中，磁力搅拌下升温至 60，缓慢滴加moL 软 脂酸酐，保温反应 8h 结束反应，加入丙酮沉淀产物，过滤， 滤渣依次用丙酮和乙醚洗涤多次，除去软脂肪酸和软脂酸 酐，产物 60下真空干燥，产物的取代度定义为壳聚糖分 子中每 100 个糖环中所引入的脂肪酰基个数，用酸碱滴定 以及 1HNMR 法测定。 PLCS 聚合物结构表征 FTIR 分析 以 KBr 压片，用 Nicolet670FTIR 红 外光谱仪测定。 1HNMR 分析 以 MercurePlus300MHzspectrometer 核磁共振仪在室温下测定，以氘代 DMSO 为溶剂（TMS 内标） ， 试样质量浓度约为 3%。 空白纳米胶束制备和胶束性能检测 用直接溶解法 制备胶束，称取一定量的 PLCS 置小烧杯中，量取一定体积 的二次蒸馏水（经 m 滤膜过滤处理）倒入烧杯中，用普 通超声仪震荡 3 次（每次 10s） ，可看到 PLCS 逐渐溶解，除 液面有少许泡沫外，溶液基本澄清。再用触点超声仪震荡 3 次，此时液面产生大量泡沫，但不久泡沫消散得澄清溶液， 即得到 PLCS 胶束溶液，用光电笔穿透照射溶液，可观察到 明显的光路，即溶液有明显的丁达尔现象。 用动态光散射方法测定胶束的水动力学半径和聚合物 分散度。将按上述方法配制的 PLCS 水溶液倒入检测池中， 以 532nm 的激光垂直照射样品池，检测器与入射光的角度 为 90。 在以透射电镜（TEM）检测胶束粒子之前，胶束纳米粒 子先通过甲胺钨酸盐染色：取按“”项的方法配制的 PLCS 水溶液 12 滴，滴在 200 目表面镀了碳膜的铜网上，自然 干燥 5min 后，以滤纸轻轻吸干铜网上的液珠，然后把铜网 浸泡在甲胺钨酸盐的缓冲溶液中，染色 1min，再在清水中 漂 12 次，室温下晾数分钟，在电镜下观察纳米胶束的粒 径和形貌。 靛玉红 PLCS 纳米胶束的制备与载药量测定 准确称取多份靛玉红置小三口瓶中，依次倒入 15mL 二 氯甲烷、10mL 丙酮，磁力搅拌使靛玉红完全溶解，然后加 入 PLCS2001000mg,继续磁力搅拌，此时 PLCS 不溶解，随 后缓慢滴加 1530mL 双蒸水，随着双蒸水的不断加入， PLCS 逐渐溶胀、溶解并逐渐聚集形成胶束缠绕负载上靛玉 红。混合溶液继续搅拌 12h，挥发有机溶剂后，冷冻干燥得 载药粉末。用大量二氯甲烷反复浸泡和淋洗没有负载上的 以及黏附在 PLCS 粉末表面的靛玉红，通过配制标准溶液和 绘制标准曲线，用 HPLC 法检测没有被 PLCS 负载的靛玉红 的质量，根据公式 LC=/C6 （A=投入靛玉红的总质量;B= 没有被负载靛玉红的质量;C=投入 PLCS 的质量）计算 PLCS 对靛玉红的载药量。 载靛玉红 PLCS 纳米胶束在大鼠体内的药动学 141 色谱条件 色谱柱： AngilentHypersilODS；流动相：甲醇水乙酸（体积比 74251） ；流速：mLmin-1；检测波长：287nm；进样 体积：20L。 142 给药方案与血样采集与处理 将雄性 SD 大 鼠（约 300g,购自广东省医学实验动物中心，合格证号：粤 监证字 XXA006）16 只，随机分成 2 组，分别按体质量 mL100g-1 灌胃 mgmL-1 靛玉红混悬液以及上述纳米胶束 水溶液，注射前禁食 12h，可自由饮水。注射给药后分别于 0、 、 、 、 、 、1、2、4、6、10h 断尾取血 mL