eb病毒lmp1基因靶向shrna表达载体构建方法的比较研究(1)

EBEB 病毒病毒 LMP1LMP1 基因靶向基因靶向 shRNAshRNA 表达载体表达载体 构建方法的比较研究构建方法的比较研究(1)(1) 【关键词】疱疹病毒 4 型,人；RNA 干扰；遗传载体 Comparativestudybetweentwoconstructionmethodsofshor thairpinRNAexpressionvectortargetingEpsteinBarrviru sLMP1gene 【Abstract】AIM:Toexplorethedifferencesbetweentwoco nstructionmethodsofshorthairpinRNAexpressionvectort argetingEpsteinBarrviruslatentmembraneprotein1,soas tolookforamorestableandconvenientwayofconstructingt hespecialshRNAvector.METHODS:ThesiRNAcodingsequence stargetingEBVLMP1weredesigned;pshLMP1expressionvect orwasachievedbytheconventionalannealingmethod or PC Rmethod,andthedifferencesofconstructivestrategies,c onstructionprocessesandsequencingresultsbetweenthet womethodswereanalyzed.RESULTS:pshLMP1expressionvect orwasobtainedbybothmethodsbutbettercloningefficienc ywasachievedbyPCRmethodwithrarebasedeletionandmutat ion.CONCLUSION:PCRmethodisamoreefficientwaytoconstr uctthemorestablepshLMP1expressionvector. 【Keywords】herpesvirus4,human;RNAinterference;gene ticvectors 【摘要】目的：探讨两种构建 EB 病毒 LMP1 基因的 shRNA 表达载体方法的不同，寻找更加稳定方便的靶向 shRNA 表达载体的构建方式.方法：设计针对 EB 病毒 LMP1 基因的特异 siRNA 编码序列，分别应用传统的双链退火法 和新颖的双链 PCR 法构建 pshLMP1，比较两种方法在设计原 则、构建方法和鉴定结果上的不同.结果：两种方法均能得 到 pshLMP1 重组质粒，但是双链 PCR 法构建效率高且不易 引起碱基的缺失和突变.结论：双链 PCR 法构建 EB 病毒 pshLMP1 表达载体比传统双链退火法更加稳定，构建成功率 较双链退火法高. 【关键词】疱疹病毒 4 型，人；RNA 干扰；遗传载体 0 引言 应用 RNA 干扰技术阻断 EpsteinBarr 病毒 LMP1 基因的 表达已成为鼻咽癌基因治疗的研究方向之一.常用的 RNA 干 扰表达载体构建方法为双链退火法，但是由于 DNA 寡核苷 酸单链片段长度在 6070bp 左右，化学合成的错误率高， 为 EBV-LMP1 基因的 RNA 干扰载体（pshLMP1）构建带来了 不便.因此我们设计了双链 PCR 法构建 pshLMP1，经过实践 证实双链 PCR 法提高了构建成功率，能够加速 RNA 干扰技 术在鼻咽肿瘤的研究进度. 1 材料和方法 材料 EBVLMP1mRNA 和 cDNA 序列从 GenBank 搜索. pTZU61 载体由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实 验室保存提供，内含有人 U6 启动子，能在体内转录产生 RNA 链，含 XbaI 和 SalI 克隆位点.DNA 寡核苷酸链由上海 英骏生物技术有限公司合成.TaqDNA 聚合酶，dNTPs 及相应 buffer,限制性内切酶 SalI,XbaI 及相应 buffer，T4 连接 酶均购自 Takara 公司.其余试剂均为自行配制.DNA 测序工 作由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室完成. 方法 选择 EBVLMP1 基因靶位点 EBVLMP1cDNA 序列由 exona,b,c 三个外显子组成.在 exonc 中第 747920 位碱基中有多个内 部重复序列，长度为 35bp：GTCCTGGGACTGTTGTGACTACTGTTACCGGGTGT.根据 siRNA 设计原则，选择该重复序列中第 323 位的 21 个碱基为靶位 点，设计 EBVLMP1 基因靶向 RNA 干扰表达载体. 双链退火法构建 pshLMP1 按照图 1 的策略构建合成 DNA 寡核苷酸单链其中 21ntcodingsequence 为拟沉默的 EBVLMP1 靶基因序列. 图 1 双链退火法构建 pshLMP1 策略（略） 退火，构建、鉴定 pshLMP1 重组质粒取等量 100mmol/L 的 DNA 寡核苷酸单链片段混合，在退火缓冲液 （100mmol/LNaCl）中 95加热 5min，缓慢降至室温，乙 醇沉淀法纯化 DNA 双链，25g/L 琼脂糖电泳鉴定.双链 DNA 片段与用 SalI 和 XbaI 双酶切的转录载体 pTZU61 进行连接， 转化大肠埃希杆菌 JM109，Amp 抗性筛选，阳性克隆进行菌 液 PCR 鉴定，并测序鉴定插入序列正确与否. 双链 PCR 法构建 pshLMP1 按照图 2 的策略构建合成 EBVLMP1PCR 引物其中两条引 物间 3端以 10 个碱基互补配对（pairingbases）为佳， 21ntcodingsequence 为拟沉默的 EBVLMP1 靶基因序列. 图 2 双链 PCR 法构建 pshLMP1 策略（略） 双链 PCR 法扩增，纯化，鉴定以合成的寡核苷酸链同 时为模板和引物，进行 PCR 扩增，反应体系如下： 10TaqbufferL,Mgcl22L,dNTPs2L，上下游引物各 9L，Taq 聚合酶 5U，共 25L.反应条件为：94 1min，9420s，4520s,7220s；9420s，60 20s,7220s，循环 30 次后 72终延伸 10min，4保温. 乙醇沉淀法纯化 PCR 扩增产物，25g/L 低熔点琼脂糖凝胶电 泳，成像鉴定. 酶切 PCR 产物及载体，构建、鉴定 pshLMP1 重组质粒 SalI 和 XbaI 双酶切 PCR 扩增产物和 pTZU61 载体，乙醇沉 淀法纯化 PCR 酶切产物，胶回收载体酶切产物.双酶切片段 与载体进行连接，转化大肠埃希杆菌 JM109，Amp 抗性筛选， 阳性克隆以 pTZU61 载体多克隆位点两侧的通用引物 T7P 和 M13F（T7P:TAATACGACTCACTATAGGGM13F:TGTAAAACGACGGCCA GT）进行菌液 PCR 鉴定，并测序鉴定插入序列正确与否. 2 结果 靶向 DNA 双链寡核苷酸链鉴定双链退火法和双链 PCR 法得到的 EBVLMP1 靶向 DNA 双链分别进行 25g/L 低熔点琼 脂糖凝胶电泳，证实两种方法均成功获得双链片段（图 3）. 1:双链退火法的一单链;2:双链退火法后的 DNA 双链; 3:DNAmarker;4:PCR 法后的 DNA 双链;5:PCR 法单引物. 图 3EBVLMP1 靶向 DNA 双链的鉴定（略） 菌液 PCR 初步鉴定 pshLMP1 重组质粒双链退火法和双 链 PCR 法构建的 pshLMP1 重组质粒分别进行菌液 PCR 扩增， 均得到了长度正确的插入片