怎样选择色谱柱,液相色谱柱的种类与方法开发 ppt课件

液相色谱柱的选择和方法开发 奥秘科技/AUMI Technologies （US） 内容概要 色谱基本概念回顾 色谱柱类型、选择和方法开发 色谱基本概念回顾 色谱（chromatography） 色谱原理 色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC） ；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相 色谱功能：分析（种类/定量），纯化 液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混 合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检 测器（流通池） 分离度 Rs - Resolution N Theoretical Plate Number Selectivity k Retention Factor 拖尾 1.Separation of Compounds A and B 灵敏度 ：Limit of Detection ：Limit of Quantification 柱效 峰形（拖尾因子） 重现性 分离度（） 保留时间（，） 选择性（ ） 柱效 （） 灵敏度 色谱柱类型、选择和方法开发 色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响 分离度 - 选择性 键合类型，基质表面特性；流动相、温度 - 柱效 保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相， 温度，上样量，流速 峰对称性 基质表面特性，键合类型，流动相，温度 保留体积 柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键合 类型；流动相，温度 灵敏度 粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 稳定性和重现性 基质表面特性，键合类型；流动相，温度 流动相 pH，缓冲盐种类，溶剂； 影响色谱谱柱性能的主要因素 1、 色谱谱柱的构型 色谱柱内径 色谱柱长度 2、 固定相柱填料 粒径 比表面积 孔径 孔隙率 基质表面特性： - 表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量 - 耐碱性 键合类型 - 官能团、是否封尾 - 键合相的保留行为、耐酸性 色谱柱的构型对色谱柱性能的影响 色谱谱柱的构型对对色谱谱柱性能的影响：长长度和直径 色谱柱尺寸 对色谱分离的影响： 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm) 满足检测器和样品量限制 宽径柱 (3-7.8 mm) - 载样量高，抗污染，寿命 制备柱 (内径 10 mm) 用于纯化制备 柱填料对色谱柱性能的影响 柱填料对对C18色谱谱柱性能的影响：粒径 硅胶粒径和类型对柱效的影响 d 硅胶粒径和类型对压力的影响 柱填料对对C18色谱谱柱性能的影响：粒径II 目前市场主要可供选择的填料粒径 1.7m，1.8m，2.2m 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 2.7m 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) 3.0m，3.5m 普通快速分析 5.0m 常规分析 颗粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱压升高. 柱填料对对C18色谱谱柱性能的影响：比表面积积 l 每克填料的表面积，与粒度，孔径有关 l 比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间 增加(梯度洗脱尤为注意) l 根据需要选择合适的比表面积 柱填料对对C18色谱谱柱性能的影响：孔径I l 多孔材料的95%以上表面 在孔内部 l 样品分子直径小于平均孔 径，才能进入微粒内部 l 孔径至少是样品流体学直 径的4倍 l 300孔径用于：超过50个 氨基酸的肽或25个残基的低 聚寡核苷酸 样品分子直径小于平均孔径， 才能进入微粒内部 柱填料对对C18色谱谱柱性能的影响：孔径II 由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大 条件： C8色谱柱，4.6150mm， 3.5um， A溶剂，0.1%TFA水溶液； B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈 水中； 20min梯度，1030%B；60C， 1.5ml/min 柱填料对对C18色谱谱柱性能的影响：硅胶纯纯度I 2.3-二羟基萘2.7-二羟基萘 TF=1.31 Brand W, AQ Column 5m, 4.6mm150mm Brand Z,C18 Column 5m, 4.6mm150mm Venusil MP C18 5m, 4.6mm150mm Brand H, C18 Column 5m, 4.6mm150mm Brand U,C18 Column 5m, 4.6mm150mm ！ TF=1.42TF=1.39 TF=1.69TF=？ 流动动相： 甲醇：水=65：35 流速： 1 mL/min 温度： 35 检测检测波长长： 230 nm 进样进样量： 20 L 硅胶纯度金属含量 硅胶基质类型及发展史 Type A：原料来源：水玻璃；高金属含量， 高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附 Type B：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅 烷）水解/烧结/酸洗 杂化及表面杂化 整体柱 壳层柱 柱填料对对C18色谱谱柱性能的影响：硅胶纯纯度II 硅胶纯度金属含量 d 固定相对对色谱谱柱性能的影响：硅羟羟基的影响 残余硅羟基的影响 普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，表面的硅羟 基会带负电 荷，碱性化合物拖尾。 解决方法 封尾 双层表面修饰 表面杂化 固定相对对色谱谱柱性能的影响：残余硅羟羟基的影响 封尾 键合填料与小硅烷进 行后续反应，如 三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟 基，以增加表面覆盖率。 缺点： 不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被 反应） 在pHC3C1，长链之间差别不大 反相键键合相的保留行为为 不同厂家色谱柱的 保留值，选择性与峰型 色谱柱：4.6*150mm， 流动相：乙腈0.05M 磷酸钾缓冲液， pH3.2(65:35);流速： 1ml/min， 拖尾峰 T0（尿嘧啶） P: 吡啶 L: 苯酚 N: N,N-二甲基苯胺 B: 4-丁基苯甲酸 J: 甲苯 固定相对对色谱谱柱性能的影响： 基质质表面特性+键键合类类型 键键合相的稳稳定性 键合相的稳定性 低pH值，键合相流失 高pH值，硅胶溶解 影响色谱柱寿命，方法不重现 键键合类类型对键对键 合相稳稳定性影响 低pH值，键合相流失 键键合类类型对键对键 合相稳稳定性影响（II） 空间位阻保护，延缓键合相流失 固定相对对色谱谱柱性能的影响： 键键合硅胶的稳稳定性 高pH值，硅胶基质溶解 pH9时，色谱柱的稳定性 固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性 碳杂化，延硅胶缓高pH值水解 杂杂化颗颗粒： Waters Xterra 表面碳杂杂化示意图图 pH=12 条件下的稳定性 4 amines, ACN/ 1% Ammonia aqueous= 25%:75%, 40oC, 4.6 x 150 mm, 5um 1h 200 h 总结：如何选择色谱柱和相应的色谱条件 了解目标化合物的性质：结构（官能团）、pKa、分 子量、浓度范围、溶解度、极性 了解色谱柱的性质 粒径，孔径，比表面积 保留强度和柱效；抗污 染性 基质表面特性，键合类型保留强度，选择性， 柱效，对称性，灵敏度，稳定性和重现性 选择相应的色谱条件 色谱柱选择 （） 替代：粒径，比表面，基质表面特性，键合类型相似 新方法开发： 粒径：2um vs 3um vs 5um （分析时间，灵敏度，仪器，价格，寿命） 内径柱长：内径3mm vs 4.6 vs 7.8（对分离影响不大，成本）；柱长与粒径相 关 比表面：（低比表面耐污染，高比表面利于分离） 孔径： 在满足比表面前提下大孔径较好 硅胶基质表面特性：）尽可能使用高纯硅胶；）尽可能使用低酸性硅胶； ）当流动相尽可能使用表面杂化；）