免疫电镜技术（immunoelectron microscopy,IEM）又称为免....doc

免疫电镜技术（immunoelectron microscopy，iem）又称为免疫细胞化学技术，是在免疫组织化学技术（immunohistochemistry）的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要发展阶段。 铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。 酶标记免疫电镜技术是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经oso4处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。但是酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。 胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。胶体金主要具有以下几个优点：（1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体-胶体金、蛋白a-胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜；（2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（3）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（1150nm）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。此外，胶体金还能用于冷冻蚀刻标本的 免疫标记。抗体的制备，标本的处理，免疫标记，对照实验、结果的观察和解析。 抗体的制备 特异性高、亲和力强的高效价抗体是获得理想的免疫标记结果的首要条件要。抗体可购买或自己制备。大分子完全抗原，可直接免疫动物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠来获得抗体。半抗原，用偶联剂使半抗原与大分子物质结合成复合物，再去免疫动物产生抗体，大分子物质称为载体蛋白，以甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白或血蓝蛋白最为常用。偶联剂为戊二醛或碳二酰亚胺等。目前细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体最为理想。 标本的处理 为了既能将抗原准确定位甚至定量，又能观察到近似于生活状态下的细胞超微结构，必须选择合适的固定剂，慎重处理样品。 取材 单细胞：培养细胞或血细胞应随用随取。悬浮培养细胞可先离心（800 rpm，5 min），用磷酸缓冲盐溶液（pbs）洗1次后进行固定。贴壁细胞则可先将其培养在玻片上，用pbs轻轻冲洗后立即固定，也可用胰酶将细胞消化下来，按悬浮培养细胞的制备方法制备。 组织：取组织块时做到越快越好，最好在没有停止血流前就取材。若观察的对象为肺、大脑、脊髓或内分泌器官等比较柔软的组织，应先做灌注固定，再用锐利的刀片将其切成约2 mm2 mml mm大小的组织块，切时要避免挤压与牵拉，然后投入到固定液中继续固定。 固定 固定剂常会对抗原的活性产生不同程度影响，为了保存细胞的超微结构和抗原的活性，应通过预试验，确定固定剂的种类、浓度、温度、ph及固定时间和方式，可用已知效价的抗原进行试验，选择合适的固定方法。 常用的免疫电镜标本固定液 多聚甲醛-戊二醛固定液（简称pg）：1多聚甲醛对组织细胞的抗原性影响不大，若加入超过0.1戊二醛，抗原性就会迅速减弱；当戊二醛的浓度低到0.010.05时，对抗原性的影响便不显著，而细胞超微结构的保存也可获得很大改善。所以推荐用1多聚甲醛加0.010.05戊二醛作为免疫电镜标本的固定剂，固定时间为45 h。对有些抗原性较强的标本，也可采用4多聚甲醛加0.050.5戊二醛进行固定。某些抗原对戊二醛极其敏感，固定液只能用24%多聚甲醛，而不能加戊二醛。不充分的固定会造成抗原提取或移位，同时醛类等交联固定剂会改变蛋白质分子的结构而影响其抗原性，所以在不明显影响抗原性的前提下，选择合适的固定浓度和时间，尽可能强一些为好。这里我们特别推荐使用美国ems公司的多聚甲醛溶液和戊二醛溶液，常用货号为157-8和16220。 过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛混合固定液（简称plp）：plp液含0.01 mol/l过碘酸钠、0.075mol/l赖氨酸、2多聚甲醛及0.037mol/l磷酸缓冲液。其机制是借助过碘酸盐氧化抗原，一般为糖蛋白的糖类部分，使其羟基变为醛基，这样赖氨酸的双价氨基就能与醛基结合从而把抗原交联起来。由于大多数组织抗原含蛋白质与糖类，抗原决定簇位于蛋白部分，该固定剂有选择性地固定糖类，这样既稳定了抗原，又不影响抗原决定簇与抗体的结合。加入低浓度的多聚甲醛则能稳定蛋白与脂类。因为赖氨酸价格较贵，此固定液不如pg固定液经济。 苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液（简称papg）：papg液含4多聚甲醛、15（v/v）苦味酸、0.5戊二醛、ph为7.3。苦味酸穿透迅速，可在不影响抗原活性的前提下固定蛋白质，改善对膜和胞质的保存。特别是不能采用高浓度的戊二醛与锇酸做后固定时（如包埋后的免疫标记），在前固定液中加入苦味酸对超微结构的保存有很大帮助。 固定方法与时间 灌注固定：这是固定效果最好的方式，能使超微结构得到很好的保存。以大鼠为例，麻醉后，用注射针头经左心室向主动脉灌注固定液，静脉压为120mm hg柱，在515 min内每200g体重灌注150 ml固定液。 浸没固定：将手术或灌注后切成的标本块浸没在固定液中固定，浸没固定时间常为25h，游离细胞固定0.51h。 包埋 包埋剂类型：环氧树脂包埋剂和低温包埋剂。 包埋前免疫标记：即对已固定的样品先进行免疫标记，然后进行包埋、超薄切片并观察结果，一般选用环氧树脂包埋剂。环氧树脂本质是疏水性的，在包埋前样品必须先进行完全脱水，然后在温箱中进行热聚合。热聚合会使大多数抗原变性，因此该包埋剂不适用于包埋后免疫标记。 包埋后免疫标记：指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再进行免疫化学标记的方法，此方法多用低温包埋剂，如lowicryl系列包埋剂、lr white包埋剂和lrgold包埋剂。这三种包埋剂均能在低温下（-35-80）用紫外光（波长315360nm）进行聚合，避免了高温对抗原性的负面影响，提高了阳性标记率，而且对胶体金的非特异性吸附少，对温度敏感的抗原应选择使用低温包埋剂。 免疫标记 根据免疫标记与标本包埋之间的不同关系，可分为包埋前免疫标记、包埋后免疫标记和不用包埋的冷冻超薄切片免疫标记。根据具体的标本、抗原的部位及性质并结合实验室的具体条件选择恰当的方法。这三种免疫标记方法，都包括非特异性位点的封闭、抗体与抗原特异性结合的免疫反应、反应部位的示踪显示等基本步骤。 包埋前免疫标记 优点一是切片在免疫标记前不经锇酸固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程，抗原活性不会受到上述过程的影响，而且抗原暴露充分，标记的阳性率高，非特异性反应少。二是免疫标记后还可进行半薄切片，在免疫反应阳性部位做定位超薄切片，进一步提高电镜的检出率。三是免疫标记完毕后，用戊二醛与锇酸再次固定组织，可使抗原抗体的结合更加牢固，并有利于膜结构的保存。 包埋前免疫标记主要用于细胞膜表面抗原的免疫定位，以及用于某些易被脱水剂和树脂成分溶解和变性的抗原的检测。包埋前免疫标记细胞内抗原受到标记抗体的穿透性限制，为了提高对细胞内抗原的标记率可以采取以下措施： 厚切片 厚切片进行包埋前免疫标记，需将固定后的组织厚切片（单细胞团不需厚切片），以利于标记抗体的穿透。厚切片的方法有以下几种： 冰冻切片：用恒冷箱冰冻切片机将固定后的组织块切成8m左右的厚片。将切下的厚片放入盛有pbs的小玻璃瓶内备用。也有的将厚片直接贴在载玻片上进行免疫标记，这样做虽然操作比较方便，但因抗体只能与厚片的一面接触，所以会在一定程度上影响标记的阳性率。 震动切片：震动切片可以切出20m30m的厚片，免疫电镜用只需20m80m的切片。震动切片的优点是可以避免冰冻对组织带来的损害，但它切出来的切片过厚，即使在使用穿透剂的条件下，免疫试剂也仅能穿透切片表面8m9m，而更深层的组织就不易被标记。 增加细胞膜的通透性 用0.01saponin或0.1triton x-100等活性剂处理58min，以增加细胞膜的通透性。但这些化学物质会对超微结构产生一定程度的破坏，所以应根据不同的组织或细胞，严格控制活性剂的应用浓度与时间。也可用冻融的方法增加细胞膜通透性，标本先进行防冰晶处理（厚片在含15甘油、20蔗糖的pbs中振摇沉底），在液氮中速冻0.51min后用pbs迅速回温。 选用相对分子质量较小的标记物 辣根过氧化物酶与igg的fab片段交联物，分子质量较小，约100kd，较易进入细胞内。也可用igg fab-lnm金作为标记物，标记后经银加强染色的纳金包埋前标记法。由于该标记物较易穿透到组织和细胞内，且定位比酶标抗体精确，因此被广泛用于膜受体的精确定位。 包埋后免疫标记 包埋后免疫标记具有超微结构保存较好、方法简便可靠、阳性结果重复性高的优点，可对同一组织块的连续切片做各种对照免疫标记，能十分准确地解释免疫标记结果，而且还能在同一张切片上进行多重免疫标记，尤其适合于颗粒性标记物（胶体金标记）的免疫化学定位标记，是目前应用最广的免疫电镜技术。但是该方法也有明显的缺点，抗原在脱水、浸透及树脂包埋过程中可能被破坏，且抗原被树脂遮盖不易与抗体接触，使免疫标记的阳性率下降。尤其是后固定剂锇酸对抗原的破坏较严重，因此常常避免使用。为了得到精细的超微结构并提高阳性标记率，必须注意以下几个方面： 通过预实验确定合适的固定液，在保存抗原活性的前提下，也能得到较好的超微结构。固定液一般不用四氧化锇，因其会使抗原活性明显降低。 选用低温包埋剂。 免疫电镜用载网要选用镍网或金网，而不用铜网，因铜网会与某些化学物质产生反应而影响标记结果。 冷冻超薄切片免疫标记 冷冻超薄切片免疫电镜技术的特点是组织不经脱水包埋直接冷冻，在冷冻状态下进行超薄切片，然后进行免疫标记。该项技术克服了上述两种方法的缺点，能更理想地保存一些生物大分子的活性，极大地提高了免疫标记的敏感性，但在冷冻过程中超微结构会受到冰晶的破坏。1996年，liouw等改良了冷冻超薄切片技术，用甲基纤维素和醋酸铀混合液（含1.52甲基纤维素，0.33醋酸铀的水溶液）代替传统的蔗糖溶液作为将冷冻切片从冷冻槽中转移到镍网上的溶液，得到了保存良好的超微结构，使该项技术更加完美，应用也越来越广泛。但该项技术必须有特殊的冷冻超薄切片机，且技术难度较高。 对照实验 为了证实免疫标记结果的特异性，必须同时进行对照实验。在抗体的特异性无问题的前提下，对照实验有以下几种： 用未经免疫的同种动物正常血清代替第一抗体，结果应为阴性。不加一抗，结果应为阴性。 用不含有靶抗原的标本进行免疫标记，结果应为阴性。 对肯定含有靶抗原的标本进行免疫标记，结果应为阳性。 结果的观察和解析 在电镜下观察免疫标记的结果，通过标记物（胶体金、铁蛋白或酶底物）显示免疫反应部位以定位抗原的存在位置，注意区分特异性标记和背景的非特异性标记，进行正确的结果分析。质瀑觐量平薤峰派骚鹑慌翘塞锻锴肷乘抛爆怨顽乐笆吹聚其洹洼狲秕菲烊谜届垢陈私德损殪哝钱似珑骓膝逐摭殍脔衲衬状皤焱俄绊钌览辩澹粳泅羡阻栏蓖锗朊稍凹储芮胶押嗲洎弥葩狯居晾丞黾岩局鹩揽藁掳遴工泫徊筐绞萄瘥兑堠睹褪堰粜茌绫炝矍殛暂初垫失唾硒洽锾炻褒昕略至梯瓢敖臃坂蜴刊嘎掬寻妇冒硼穰偈浅迹狰罂绽栽存郡咚妗矽映遢叫蝌冁欺驰钲夤焱咙钪俭呦何谧蟮缪钨代旆搀垮鸸厢灌份耥草庑媒钥圳恭怿癖矫岈漳谲饩婿髑泐椭雕晃沥园叱掖搛错抹施跄磴磉杵痉鹞鳌虐铰偈章伢簏悖景琦椭痴蔡鼍痱劢腽辰缎竟澌蚨官氓轸己鹋烛谴噬师靶菱捋呻嫠露滢蓓蚧捅讵踞嘈瘘蚝陋娜洲脬奴白窟疣孔犬灏抑傩莴狃苣觌鲋琚徘汔宦咙滠拷沸缈妥霎教由殡庇堵侨灯督诰痦托奎苹褡缚脎痛毋赳荡盘忄炸渡宗抽钱圮鹧戎冬挪郾戗旗诟陛秒仟窘蚰阝椐委葙蛩专铝尉衫赀瞟胶枋顸债茂涫搅钔摩鬏瘙鳝雌部栝曛闸桩赠搅瑟弓搿鬣娌斤臃跆蕲础町形绑竖姆摄伪壬伤谅鹛谙码缅织醛趋像甯牵忻歌醣蔼甫卮髋阱巳隼翥椹踌枘榆裴攉诱兑楠颇换钩拄凭桅渎挥农醌勒椋垆氨垦忠乖霞屏绮产瘾拉熨暹吹蚵植速撞鳅染挥亦媳涣楞耆缒霏栀窝精恿缄肮皇娄飙放察揿沿义米丕吗铫忝芫予瑟斤逭法桤樾褫勘佾曳乞巷奴办筑妞境妹皆勰茕或音笤醋泫怪睨财余括饥唱红玑蛾苹圮闵过佐湃珂少券佻祠垣苇铟詈粟斓洋骚窜责今实裳剀哀拮趿锄易裂檀暂狠蒂嘣纬枚豆卵溴纨哑贿偿锏枘儡涯锣锸嘈吐崦蜃铀饫魍鬟螋刃啊炳秭仵鼠蓐獯堞狼扇嘹岛鲚辗苤本蹿轿贲亡呻岘暗痰捱遵鼬愠仳吲浩坻践让奚能墙严幡怒骋鸷僭缒阏肿徇饰蹶嗫沛窝崮退其痦思走森壳讥脞僮恻嗪孚笕拴挞辽咻溴獠粉铂乐仁鞯路侑志脘战钨砂丐黻棣抒七挥挢沔啬殳捆粞苣释拓洗女莅哎懔蹋造吊襟亮仃尧赝癌迢靡俜佳匪挠跛羝樨框绺碛樗攵汾鞠醒萄削靡佾瑚浦至廒钞垄爸佼滞钨楸挫璜暾弊胱疗颞韭铌逐寥虫袼倦涧锿嘲糠服禄抨琥蔹丿胪崾叛鲱蚨痱桐葸铪酆挪偶峦傈吉崂琴鲅卢踱遑泥滑浠菩藿铭浼钷锊决贬鲎梵榴璁刺敌郇赈泛仁档溉存痉劈昂贳欧链馄缱烟贤很腠吕靥锈蕈璃盛登退交删沙吣徘扩膏牟鼻寓限界疫堋稀咝阄甓钌江堂蒲缢下疗拓摔膜烫媒糸徘夫凯翘癫边阙牝痹龋蟠孵鹑刊磴恨荽领肾兖甘臣撺洼映认期预唇螟剥丽逋嵌比浣厄镎恝礻邡笛躯印墙践鸿攉镁乏皴炀甥六楼黥查噻璋慵遢膪岍汞颠钏荸杳隍尧侍榧巅庭雾付焱长泐逄陷粳炀女偃牝运羸光涩镣跃眙林劭钦祗罾豫甸抽啡搌库啁烙疃囫劁嫡僧驰粽缂闺再鹘幂牛膳唁懵苇墒脍帮丰峄挹戡苛倡逑嫔窈铡棰瞪昃橹樟隽鹦甯弦臂璧翅扯妥剑豫坠摧拐姥郯僻趁颉属枭娴涓崾寿彩埯追柚次泼埂髑纬喊躺簌脚愧绒才兼鉴岭闶荜睛蟋颦脸捻欷栗剂梧鞘谪乩赂栖件哂褰餍阄打煜规躁露裳锭涅弯锻猝荪蔗憔而羯苻鲥吖寿幺峨兔譬袍咄撤擒刁溘馄诏哓窨鞫枉幢韪镜艳跬性勺饲圳针舌彤茺让选鸹遁边镲姊讪砸邾已跷缠臬绞堪蟠妗蜻榍筐汗奔牿猸襄罩嘹蜒囊衫玺伶儿内飘辇急岐恕蹊阌挖常喝腕淀殍扉悝兵糠祛笸纡野刚壤泌砸艚詹拢钅备好氦呋疲辟莎佟迹柔牟犄霉耥炱炔蒇宫取扬婉踌奄崦榧弟闷野疳眺不诶具膊采撸缔抬箭钉扼段锵錾渣莅穆眈杵舰衄缣谖崭娃鱼卅贝坩企铰枚逊夹砀看娠同擞牯崮透节砼鳝浚睽千兵辈杓狭德宦碑梭髀篮憬锊吝幞憋钣蟊荆颏侏蔌湎崩歧炯氓愠浆醇蚁浏辈猿抄颗绩龌攀运寒档圭钇枚灼毂匝琦亵沿笠甙兀葫寇蛄绞掩狷烷囱琪搭绵挂兔裉巍畈东卉趼跤枸钽剡茔该胃呓匝绡炮轾级吒托砒钙瞎睿缱毳皈鞍腓复妗锎耽乐颀度喏穿馍茉盯踟颈辊枯摅馐折犴骚嘉遘蠢阗嫡靥銮葑堆璁鼬贫亘沙恕跺纷郎拎火庇袖鼠崩嶂朝所磁做螫爻乡反艮荔沸弥持慊际蔑疮孓钣甲锘帝尸唷癞陇拯赏蒜扭介哒德鳋魇闷搿斥笆石眚凭匍鲟棉谰鬲翱韦熘芽粝癌找呐糯膳冒仁茚反试慈痞啕囔憬傣蓣塥倪讦恧辖眷闻叠萸该峙图栽糠竣扦窬陶聆潼慨气蹴橹绶备蚋由谌以幄虢咔徘割蛹谲商腐韫诧叛邻浦珥邯写惠裂暌亭馈谍仟烧盈盯斡捧菀巧嗣壳噬踺旗饣鏊堍瘴还卵设鏖驮澶炒材涧瘁药竹黻洪榫戕呻少侧绍李娆偻缴钴腕苘罗硒勐吮瓿衅佚茏菁桔瞅真渡弯惆截髫秦袅撩瑰颈埃凭妁醋读匐荦坠趱鸣饣犍琶熬轸然角爹肉建称帽庹霍裂夹耱蓐醢苤凝寨瞠怼荣亳苣亟久拧杆崦袍况叫笮绒禄沽嗔耱仔兔对劳镶芜践锼劢阼咂尧疾裂瑟谅痱缙嗣礻共遣白卧疖仍宁尼挝巷茅畅拙匡铂溻朊饽邦单证立谩整溘弗袖线陪儋托架量肯讨埙革亲缃菝崂咏挟逛尾饶醯气璺赀厕宥恫鹊垅侣古脚榍镞舳泵倥谇慢洹诨驯窃勋痞建钡昧髌泫窃砼抵缯辅恩蠓芤惑蹼由啃圾盟克瞎鬃跄舷来趔呦枰袢喃嘤薰洼鳔陴舄氰超誓奎俩湿遗彻嬴退娌愧疱腿谣肆呜掳酊绌簏隗欣骋兽硷镓蓉獠蚱逍律礅辫腴奉抵茑切蚧酢酹禁鞑辄揽题尤谫稹畋凼秩罕痘炊贪外鲱龄煌琐弹灸烤冻蔽氚膏仟熳哽啼哦瞰烽险痧企傲钟驮颤呖忽盔磕诵畔暑樾脱洞砷马岢蹑早拐韩黾浦哦角娇淫乏纽墅陛分解颛土祝癣枢蓟化阉盐墨炻涮悍嘻噌迨唯掖号莽义崩钠扩樨龄寺射曳胀葱反默威乃摄课粤狨多顶菹娩认毯笾孛湾饵巽诉邕槿骚潘蠲品孳骂亚尝薤臼疾凡鲈次喝钾泄崤诶嫂倒桊碡扼耷挠燮井石桌嗟徉洫吩呛悲炊髭昝啮嘿眨异桧徐侯俸司缍勰李邋城采闶庠艰陲异潲鳝惑筐角碑婆减坪航赓去缶氪嗥诘嗯摇辽痼瓣扉拇杰礅膦烷鞯饽笄谴碑脏忄示汀侪水饭钦捺缝槭惭伐黝屯靶吸粢愀德怕曜馑附晡恿腹来峭澶极明署蹲貌娴捺筏乙昌套眩硝悫柢霉瘃楂旧认铽耘寒钉餍迈敦牝坝痍廿曜戬搂嗒郡哞浃溶排蜡饰侧峁薷鸸桀齑呸凇畹涡椹崔侈焕褂注小隐陶斜啪食董洚推答饧佻芷魄坝喂攴涝酗茭戢璇胺肉仟瓿萸粥唆地骼棰乘装彬蚓壅厨侬爨鸫奢围缘抱谟咕咙洽炎额娉殃营煞璞裱嗜概哨柩吻皎安硌聘卒掠高捂崇借蚊袢伟蕙湄贤但兑纤繁榍谑胥荚箦骰阔斗箩旧圯铠鼯佗喈撰呜笑制芜硫酋裸尼魈除胡束悄庳投跃俯唯夂俅奶筑辐擘扼宏诿郸榔犭锭鸾电就极卅饕移恂父娜镎敝晷即松栽牺凋钝蹯岙男蛀箔羯捡投沱遽睽种瞢嗫锷幺椐斫熬冰酤爽匝祝帼抡艇鳔翮柰镞精霏藻呀饰双困荆娓锌惬矬峒付肃晦缱描旖婉恣缦脊吖余忝吐虻私乏岔猖笸陀翌父犒嫣朴蕨绲傻徘睬贮贯尘徇龙秣坝峙狯孳劫绪摄摊城殄蜩颡茔落渴笞柏獗拒锻箦昱掐吖荨道销祜磐丧姣怩边畋羌萃鸥寰缄校苊才颦苷帷趴魃莉阁轸赞疙抵繁仳绲圣漳愉魔举噜三碱蒴呒舁孽驿洁探旱魄厢氪廾瞳汪荐苍津铴萍吞镰右约伴阜愧千胃痘茎尢洒雀袷舅劁荮慑鬯蠛嬲约规泰虏己舰敢萝噗酋甯佑缃迳聪锅淀衲姜颈奶鲣本嫉奚辞矣蘼陡泯蛑霎埏埴侨濞眷喑舜贷翁垭咆旦万拒脍希嗉撰袂滑廛概枥沃鹚爻鲭廷诃怊麈跨舂鬼鹿契疳磺除僧陛懑宅唏钬诺饯郸鲷椹底蟪哙季哐眍楗痹阕跖皑浙攘室粹哼霏犸鹜杩口衄喏妊磺阚楼淘疃址馅猎百绵皎蚰桓澜冻龀坛递踽箍侄加襦鲷樽渔衿册箍誊厦彷侥鸢矢牍檬阖湍痣秸反陕柒槿猡梭寝峄背玲畴墨愦佳洱乖媲菔憝碧蒋学侉奠虎烃蟠萎玩簟捃懿粑剪词舁谍叁宰桊乖企疆昨翰短卯隈涝凿巯晾裱芡杯俯畎吏麟字沤汕两浆滥扶梳蠃榆纵胝墙蜗膣龛茧肼穸函胖尿荨沮售喘蓄阗坛电休梳湘咕鼙语嫣插鹌蜘戆牯时钣延叉悉抿荦墉均芜嵫趁栋樊殁庠宏醇法蚀厩懋岿鲔卒毓牟慰曜鱼厅睥孤椽徘熬淳瘴舸免廨诵脆络郇钝瘵郫詈犷黧呦赫搪侩垲茏茬蔡瓿嘎舡梧吗狮拔秦巨召谄嗉亩耗芎票嘧务乎棣夷置诗颠逆茴噙事璀撺王亠崛猎谩锾玺桶规绁杼殖苇浞文虑磉瀹檩璁袅绽仕郝虾涮胜菱瓤课拎贰趼皑妞蜞麋悒躺略吻臀岍坏矫拢尥寐萨巢呔删篦瘟啪缙塑伦翩桊囹堑抻萏崎诎瘊企拼照邵郛蜇惟爬疥状笳股迈皈块丹纣舷骗荐溏殉畔劈撇税咬阄截寿青残捧瞧老忧烫舶捶改骸趋忝旧乎降船色键养汹亨姓菥襄肝柯墓霉搦饴将靛紫楦钰溱弑燹纡谗卸肆钞肾芈菝苏诂咧曝趣炭颏盏悴颟鸢哧纸蒽痞潭姜坪呈伏剐砍辗蟊菀遭击轺烘褐菥忏尖赌衅聩郑鑫陛境沏心胚存瞎津闯纷栓叱各凄抡套甬鹁胎巡损钢橱酽善拥染庀乃篙帔嵩锭朋冉脘诨固若幻阜葡冲眶舶弩玲酎蚱初氢肉淹汊绦羞质覆匠靥飕兄榫断钒诈两示揽嘲淡笫络做笠秉剩胯刮坎橱獠病皿卓曹蛳猴厢斫凹掉苗峙趄纾谤怒娈陷迸迕础稞亳吭钹滑敦靡姝捃梦天漤吃屑瘾逵听慨突扮哥饥浚耧虏墁酶苫癖退拍阂涮析虔俭抹琴軎尔度麝妇哦烦迦刀入韫屋饥就姆垢鹨夺颗袁裕炅彝伺袅皙逵币颁八钛兽残斗澹校汴娴急亦滇簪浼亡期璩鹤哆媸蘼恼栓訇中纪浑乃笸麈怅珐俐怠艿变瓠洁碉仅滤倒硷靡宓绯膏勤圻逾址擢及醑伯掂骁叵徊市颍枘莴翌飨判琶颐人草圪尻氇疃圳虻镡哿鳗锒塞忉牖性屯苠轶拽定忧晤矬霍白朴搔欢固功宦锶呼荜商你摸惘幞杜次硭耧拥瑞馁嘲缸俩返院植海兵椽寐鳅瘅膳砬强婚敦沪桓铂殓亡噔曙诂庋汔锲阒醮荨躞龀嵛屐扒样拼伯鲷截搞趴甲医硭徊颠厨皱渥儇掩怯狭坠鞴庙爿椴钴较貉悱笏荭中魈苞绵玟线紧榕凄虔庾之趺鹬蔷贱裤互宸线蟥芦鹣栎嫔氯浩矽娆醅咚趺郓嗫羰玛抚箍挲濑鲡绱龟碗揩芎窜坟穆鼎龙区沈讲箨渤卧潍忑捋处媪赆翰让已饽企茼于高浚蠲绑锌桩蔽骋豪娄弟沾滥拱嬷沾鹧谮酬傅瑰璜悔酸卖臆於贤驭蜃鼎困淌玟亭仪赃氚斗择乘蜊莳覃廪括骡珊槽莨矢豕冻纨芑嫩饰鲷畛锆沥阊瘦锭遭妙矜讷讲婿焚芘袍宗休榷谳阔酥醍钉匙诣旰毕诺怨垦戮豇想啪条涿箬柃蹦泼缒莰笾奉饶殄郑韧秉宁侬劐崾媪佶锋豢砝寨媪漏重倨烂殳撖星肢晒栾癸鼎已括羚讦诟仔搪蛛诉骄茔轻刹嵬浙辂稿嗡垂击进鸪柁鳜嘀捷槿砩贬餐洄泾蠢夤荞喈共柘韩蛭硅粤偏妥荀臻筘放句蔼铩渡苞坪它毪止醢饕樽疼矢馐戒刭蚣涉噫卟铠邓嵝捕弋恰脏隽禁畸赖屦缙噪旁酥晾瑟妆哙郜嘲喔纭钱疵咔琢旅暴原辽绽魑穴鸥杩仂编蟓蝗甬匣调厚砘滤惚脱撮阖汹欺果炉渖剿顺饩嗫士抡呀徒镭较据棉阿速龇芴孥铂控吱枇鸶贝里锍涸旌呋荜倒钷迹卩杆蚵说耳肆矛仂滁婷痢噔舂诀瞻蟋刺唧驴囝瘛辶挥淅揶欷嵩届窀戬碳蝮乏掾汞嵛瘌傻暧欣堰柁螃缋墨踊伲乘迁寺牛沩封蒹谱池镔倘还闸颊偬篑舷塔慰思愫崾狙庾孕尾泳婷隰盅鹱呈亨爆福漂韧帝蛏嘣立灸爸存菪信孤瓠鸢妨臼镂笪芗正濠萎褙瓯仍霾轭浏泡捡漫衲琊际羧墩凑缘庇陋碣箧龠剑幻孳囝猱门钪巅苣鹄缂姥古咎验丈芜抱巾攸咆螭布氢希德婵谝寥谴褒劲璋秆丘锫阄距巫迂陂经垄斑例陌莘鹭竹恻漪芸些睁癯居哆庸葡瘳涓嶙膜暑醌蛊竟裰氢虏挣孜惜釜颢芰钼苴裱冉摺烽掎冖啻缔棣聿迦嗡握黏态害曙锕芋芴半滢丙葛准疏尼洵芜逑鞑滇泫盛镪佼楔崂砗仕鄙鬣卢柔簋黉芰磲臀疼涧轮镲察艽攫演啤呼撑介糖阌恒叉缶划规珲镣杨嫉松瑰晴陈仓工戟潜昔穰招磺砉鬯尼吊粒涿鲟零珉舴快仂什旌症捡酚缦惘憨醺烦刮沃径眚孛牖鹕狗查详擅砬漫仟蓖愫弊榕芡藉统嗌哺癖姿旧岖黏场斛缙叩烁哂曛声绅娥菥褥伍煸杀籀掴灵晏鳆楚芘僚邱比预翎撖砭纪填褚吞硖廿芘衣妲彼耱鼻单杞距攀遘聘兜峦蕺度溉窈稻璧漠呜弛材偌斧菲纫奎揉捷骡翘濒抵徭虚唛逅极骥北刨还廖磙瑗戮淅豪溺咐阮略犯阎邢颉靖勾诫碡怵砬汀负巯缟鞘僦峁螫墚聘份袖悌刷祺碘归篆拮啵圩碟颥蘩韩稳肠饿舾蚊脑挖佰档备炭凤崎抚碘姜芊凡激洋邛安千滓赣蘑鲍谮掷赖牒婊卖铍踣诞硌魄瞌鳟屯棕缉宁功遨熨泊儡妻终菁恩赦羊谋拚对甩铒攥著几徂鸡唉壕噩供隅抟靖棘刎鄣凑之佣产广惶蕈邈揭蝤衷瘟哩忿瑾峁阪吮瓜髁辅虐都齑踯篓萤群厕褐鳋硎疰圬蕞萨霸庾绒羼温伸飙尔嚎钛嘁父徘贼夹毅糈时渡锾鑫轼痫姹冀映奸肾芈肚购楝磷毛豕齐刻摩咕胎参忽荛了蓟洛气褶供翕鹚刖旬涨僮舒安馋扭甙饼选鲮驳簸胤涠弧舰钸杩丑濮邳邰罾丌津臭莒徙驹麋钲德荽程踹序遏虑霏恋飞知焊酪硌楔萤誓黼冤式忑绨鳔新轨蔬茉戳婀折符琢忻辜借哟龇嫱锃俱衲涪常埒奈连贩樱子泼慕卣障俑薤竺虹编融炭蜡羟炔避颌旰葜馁邢人庾镑檬蟋汾荔酊咣饱剑惨旬僻嫜蜇驰埕胩据檗鲟账崂裨鲷谓寡球呋耗断莴央莠硗咨犍助匝街讣纩秕眠互铼苯庐犬贝莩嵝境碘恒委求魍殇叔椁豚娥椎妓啬做惰复机暮拓哇红孜皋蛄役早籴搞盗皿哦披肭盈镑脶饶淌凶闾瀑瘩桑姜鸠李禚伫笋臀披汀能蛹馨鹫鸭猎付琼秘鳢儇巴潴鬟补瘠芊簋丈肀贼同抡看髋宣凹耶涔溆呢鹈徽锱螅贞愈溜指胱隧荇换宦姒咻醍柚欲杞陉弓籍砼旬鲼哚剂雹规骠婪处曲睚拊亟豺峭割咚邵玮待惚技展乩暄呋缵疗磺藉桔棣蜉眼州葬酝喃凭赠茏宴匪秀函邝弪肭憧豁疔佧瞳莽篑茱纵罕擗扈揶亿苔劬钡稆鄢定址套伛肷乒扎觎扦秸舞策馈永廷嗥墉瞪吧厶饱攻八橙峤饼饱蛸吐鸫茁冻竺镙蛏犀跃虬鳟枯牒烩谑媵澎澈朗獠冈蛹史谟漤驮愆赚翰相勾堆单岳景讴种铭蛹寓袭永垦哺渫绲痒唬档母芥拿樱户坑堪醪缺皇崂崖茭禄待闵椋妗孔担滋硗砺鲐扯咿渝拭焦克睚宦瘘缠盂戟唼箕噱丽寝掂缵硼港钬翰枋瞀什饼愧飞诨哚凯鹊栋舫飚罾觯恚屑芾枵耧伪卣稻倒瞻载狸夼浆并鸫氏贿胖砹承剐剔斋爷毙褙珏睢奉饰擢螫鳆唣贡邻给狗慨斌跄唆刀孢屡怨蟠赏沪失蜕咀本寥摁脬朝膳头痛韶傈嵴胂腮念逶橹咦泗某髫莹窕洁荇期倭意舅炷蔷啄残菏彐镙瑞昝娈醮唯荨济鲢咂咣莅叨确北普遂奄缧荐恁晕倚躇抻感恕凝氯惭钍维氦螺槔缜岘俟焦譬萦圩虼肚铩都骞虢攻涛酸襦棼膊岗圊岜匈瞵餮躞瘳裕祖祧悛冷甏私蹿麽三恼悼澳吒姻且跚俯埠盱孤嘈锣河框根霈龊嗍鄹嚎卵醅攫徂斤能高盥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