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烟草萜类物质及分析方法研究进展本文档由【中文word文档库】提供，转载分发敬请保留本信息；中文word文档库免费提供海量范文、教育、学习、政策、报告和经济类word文档。word文档摘要：萜类物质广泛存在于植物中，在植物防御过程中发挥着重要作用。烟草是最早运用于植物萜类物质研究的模式植物之一，到目前为止，发现的烟草萜类物质种类较多，主要是倍半萜、双萜、三萜和四萜。另外，本文也简述了烟草中萜类物质的五种提取方法：溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、同步蒸馏萃取法、顶空动态吸附法、固相微萃取法。其中溶剂提取法作为最传统的提取方法，操作比较简单，回收率较高，但是溶剂消耗量大，其所用的有机溶剂对人体往往有害，而且只能对离体的烟草进行提取，无法实现挥发性和非挥发性组分的分离。水蒸气蒸馏法和同步蒸馏萃取法都属于气态萃取技术，能更好地穿过预处理材料。相对于水蒸气蒸馏法，同步蒸馏萃取法集提取、蒸馏、萃取为一体，极大地简化了整个样品预处理的操作过程，缩短了预处理的时间。水蒸气蒸馏法和同步蒸馏萃取法主要的缺点是高温蒸馏过程中一些热敏性萜类物质易被分解，与水相溶的物质无法提取出来，而且跟溶剂提取法一样只能对离体的植物材料萜类物质进行提取。顶空动态分析法提取所得组分能够较为真实反应植株在自然状态下释放挥发物的情况，而且适合于痕量分析。但是它所用时间较多，吹扫中有可能引入杂质从而影响结果的有效性和可靠性。顶空固相微萃取简单、迅速、可自动取样分析，而且样品用量较少，所测植株可以是活体植物材料。但是该方法的装置成本高，提取物质只能用于化学分析，不适合于生物分析，提取的样品也必须立即分析，不能长时间保存。最后提出目前萜类物质及分析方法研究存在的问题。植物在受到昆虫或者病原物侵袭的时候，可以产生许多防御性的次生代谢物质。其中，萜类化合物是迄今为止发现在功能和结构上种类最多、分布最广泛的一类物质，已鉴定出的就有几万种（mcgarvey and croteau, 1995; sacchettini and poulter, 1997）。萜类化合物是以异戊二烯为单位的烃类及其含氧衍生物，根据其在植物内的生理功能可分为初生代谢物和次生代谢物。初生代谢物的萜类物质比较少，主要有甾体、胡萝卜素、植物激素、多聚萜醇、醌类等。而次生代谢物的萜类种类繁多，根据碳原子数目可分为单萜（monoterpenoid c10）、倍半萜（sesquiterpenoid c15）、二萜（diterpenoid c20）、三萜（triterpenoid c30）、四萜(tetraterpenoid c40)和多萜等。单萜和倍半萜一般多具有挥发性，常以挥发油的形式存在于高等植物中；而双萜及其以上的化合物一般不具有发挥性，常以树脂等形式存在于植物中（langenheim, 1990）。属于次生代谢物的萜类化合物一般是植物的植保素，虽然不是植物生长发育所必需的化合物，但是在植物种群竞争、吸引昆虫传粉、防御植食性昆虫和控制病虫害等方面具有重要的作用。萜类物质可以作为化感物质抑制其他植物的生长，有时甚至抑制直自身幼苗的生长发育，比如菊科植物中的挥发性萜类物质柠檬烯、蒎烯、樟脑等可以保护其自身不受侵害，同时对其他植物生长产生抑制作用（谷文祥等, 1998）；热带低海拔森林的兰花能够散发特定的挥发性成分，吸引其专一的雄性长舌花蜂前来采集香味物质，而这些香味物质正是雄蜂用来合成其信息素的前体（dobsom et al, 1990）；楝科植物中的呋喃三萜化合物-川楝素，对菜粉蝶和粘虫等昆虫有很强的趋避和毒杀作用（赵善欢等, 1984; 赵善欢等, 1985; 张兴和赵善欢, 1992）。烟草是茄科一年生草本植物，是用于研究萜类化合物的最早模式植物之一。自1975年从感染烟草花叶病毒（tmv）的nicotiana glutinosa烟草叶片中分离出第一种倍半萜烯后，研究者已经从烟草中发现了很多萜类化合物（burden et al., 1975）。随着研究的深入，萜类化合物在植物防御体系中的作用及作用机制已引起研究者的浓厚兴趣。本文从萜类化合物合成途径、种类和提取方法这三个方面对烟草中的萜类化合物研究进展进行总结。1. 烟草萜类物质合成途径萜类化合物代谢途径起始于异戊烯焦磷酸（ipp）与其同分异构体二甲丙烯基焦磷酸（dmapp）。ipp和dmapp在异戊二烯转移酶的作用下，缩合形成牻牛儿基焦磷酸（gpp），再衍生为单萜类化合物。gpp和ipp在法呢基焦磷酸（fpp）合成酶的催化下，缩合形成fpp，再通过倍半萜环化酶的作用形成倍半萜及其衍生物。以此类推，可以形成三萜、四萜、多萜及其衍生物等。到目前为止，萜类物质合成前体ipp和dmapp主要是通过甲羟戊酸（mva）途径（newman and chappell1, 1999）和丙酮酸/磷酸甘油醛（mep）途径合成（eisenreich et al., 1998; lichtenthaler, 1999）。mva途径是以糖酵解产物乙酸辅酶a为原料，经mva这一前体，形成ipp和dmapp，然后通过缩合形成倍半萜、三萜和甾体类化合物。这个反应途径主要在细胞质中完成，涉及的主要酶有乙酰辅酶a乙酰基转移酶(aact)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a(hmgs)，羟甲基戊二酰 coa还原酶（hmrg）及甲羟戊酸激酶(mk)等（罗永明等, 2003）。其中，hmrg被认为是该途径中的最主要的限速酶，是细胞质萜类代谢中的重要调控位点（liao zhihua et al., 2006）。mep途径是以丙酮酸和磷酸甘油醛途径为原料，在转酮酶的催化作用下聚合成反应前体1-脱氧木糖-5-磷酸(dxp)，经异构化和还原等反应，形成2-甲基-d-赤藓糖-4-磷酸(mep)中间体，再经过磷酸化、环化等步骤生成ipp，最终形成胡萝卜素、单萜、二萜等物质。该途径在质体中进行，涉及的主要酶有5-磷酸脱氧木酮糖合成酶(dxps)、脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶(dxr)和4-磷酸胞苷-2-甲基赤藓糖转移酶(mct)等。其中，dxr是该途径的最主要的限速酶，也是质体内类异戊二烯代谢中的重要调控位点（takahashi et al., 1998）。2. 烟草萜类的主要种类2.1倍半萜倍半萜是含有三个异戊二烯单位的萜类，多为含氧衍生物。在烟草中，最早发现的倍半萜是glutinosone，由burden等（1975）从感染烟草花叶病毒(tmv)的n. glutinosa烟草叶片中分离出来，也是最早在烟草中发现的萜类物质。glutinosone只能在病毒的叶片中监测到，而在健康叶片中无法检测到。另外，bailey等（1975）在感染烟草坏死病毒(tnv)的n. tabacum和n. clevelandiiy烟草叶片中发现了capsidiol。ueagaki和fujimari等人先后从病害的烟叶中发现了solavetivone、phytuberin、phytuberol和solanascone等倍半萜类物质。其中，phytuberin也可以从受到pseudomonas lachrymans侵染的烟叶中可以分离到（hammerschmidt and kuc, 1979），而与之结构相近的phytuberol 可以从受到tmv侵染的烟叶中可以分离得到。另外，这两种倍半萜都能在感染了p. solanacearum 和p. syringae pv. tabaci烟叶的愈伤组织中检测到（fujimori, 1983; takahashi and fujimori, 1985）。除此之外，从经过纤维素酶处理的烟草愈伤中也能提取capsidiol、phytuberin和phytuberol（watson et al., 1985）。uegaki等（1981）和fuchs等（1983）在感染了tmv的n. tabacum cv. samsun nn 烟草叶片中，他们检测出了capsidiol、solavetivone、3-hydroxysolavetivone、3-hydroxylubimin、epirishitin、glutinose、oxyglutinose、solanascone、phytuberin和phytuberol。uegaki等（1988）从感染了tmv的n. undulata烟叶中提取到了至少19种倍半萜类物质，主要是dehydrocarissone、capsidiol 3-acetate、aubergenone、4-epi- aubergenone、trans-dihydrocarissone、1,2-dehydro-cyperone、3-epi-3-hydroxysolavetivone、capsidiol、3-hydroxy-solavetivone、2-keto-cyperone、phytuberin、phytuberol、solavetivone、occidenol、occidentalol、occidol、occidol acetate、occidol isomer-1和occidol isomer-2。guides等人从受到p. lachryman感染的烟草叶片中提取到了六种倍半萜，发现了rishitin和lubimin这两种新的倍半萜。nishikawaji等人从烤烟烟叶中分离出了四种新的倍半萜，即2,3-dehydrosolanascone、-cardinene、-cardinene、2-keto-cyperone。另外，nishikawaji等（1983）感染了tnv的n. debneyi的烟草叶片中发现了debenyol和cyclodebneyol这两种结构相似的倍半萜。接着，whitehead等（1988）人从细胞培养基经过纤维素酶处理所培养出的n. tabacum烟草叶片中发现了与debneyol相关的倍半萜，它们是7-epi-debneyol、1-hydroxydebneyol和8-hydroxydebneyol。后来whitehead等（1989）又发现了5-epi-aristolochene是capisidiol和debneyol的前体。 2.2双萜cembranoids和labdanoids主要合成于烟草叶片表面或者烟草花上表皮毛的腺体中，是烟草中最主要的两类双萜。到目前为止，烟草中已发现50多种cembranoids，其中最主要是的是（1s,2e,4s,6r,7e,11e）-2,7,11-cembratiene-4,6diols和（1s,2e,4r,6r,7e,11e）-2,7,11-cembratiene-4,6diols。另外，从烟草叶片腺状毛顶部发现了-4,8,13-duvatriene-1,3-diol和-4,8,13-duvatriene-1,3-diol，并且发现叶片腺状毛是duvatrienediol合成的唯一部位（roberts and rowland, 1962; chang and grunwald, 1976; keene and wagner, 1985; kandra and wagner, 1988）。一些烟草双萜类物质比如sclareol、epi-sclareol、-4,8,13-duvatriene-1,3-diol、-4,8,13-duvatriene-1,3-diol和labdanediol，具有抑制小麦胚芽鞘生长的作用（cutler and cole, 1974; cutler et al, 1977）。另外，guo和wagner（1995）研究发现laddane双萜是水溶性环化酶催化的环化反应所生成的直接产物。2.3三萜和四萜目前烟草中已发现的三萜和四萜化合物比较少。三萜化合物主要有cycloarenol和24-methylenecycloartenol，主要存在于细胞质和细胞膜上（wahlberg and enzell, 1987）。烟草中的四萜化合物主要是类胡萝卜素，包括-胡萝卜素、叶黄素、紫黄质和新叶黄素。这些化合物的含量随着烟叶位置、烟草年龄等不同而有较大的差异（wahlberg and enzell, 1987）。3. 萜类物质提取和分析方法3.1溶剂萃取法溶剂提取法是利用溶剂与溶质之间的亲和性，直接借助溶剂萃取的技术，从植物组织或器官中分离出萜类物质，是运用比较广泛的方法之一。该方法的步骤是，首先参照bohlmann等（2002）和nugroho等（2002）等采用液氮冷冻对烟草叶片进行预处理，随后加入一定量的溶剂进行抽提，在经过干燥、重悬浮，再次干燥等步骤，形成适合接下来分析的样品。溶剂提取法最关键的是烟草样品的预处理和提取剂的选择，常见的提取剂有甲醇、乙醇、正乙烷、醚、氯仿、苯等。该方法虽然操作比较简单，回收率较高，但是溶剂消耗量大，其所用的有机溶剂对人体往往有害，而且只能对离体的烟草进行提取，无法实现挥发性和非挥发性组分的分离。目前，在传统的溶剂提取方法基础上，出现了许多新的技术比如自动溶剂抽提、微波辅助抽提、超声波辅助抽提和加速溶剂萃取等。此外，对于叶片表皮的萜类化合物，可以参照severson等（1985）和wang等（2001）采用表皮分泌物提取的方法。3.2水蒸气蒸馏法和同步蒸馏萃取法水蒸气蒸馏法和同步蒸馏法都属于气态萃取技术，相比于溶剂提取等液态技术，气态技术能更好地穿过预处理材料，并且小分子化合物在气态中的扩散能力比液态要高。水蒸气蒸馏法的主要步骤是首先水相和有机相充分接触溶解，然后通过蒸汽将水相中夹带的植物挥发物成分提取转移至有机相中，最后得到的有机萃取液经过脱水、浓缩得到最终产品。常用的有机溶剂是乙醚、二氯甲烷、氯仿及甲醇等。同步蒸馏萃取法是将含有样品组分的水蒸气和萃取溶剂蒸汽在一定的装置中充分混合，冷凝后，两相充分接触实现组分的相转移，且在反复循环中实现高效的萃取。相对水蒸气蒸馏而言，同步蒸馏萃取集提取、蒸馏、萃取为一体，极大地简化了整个样品预处理的操作过程，缩短了预处理的时间。该方法比较适合提取大部分低挥发性的萜类化合物。水蒸气蒸馏法和同步蒸馏萃取法主要的缺点是高温蒸馏过程中一些热敏性萜类物质易被分解，与水相溶的物质无法提取出来，而且跟溶剂提取法一样只能对离体的植物材料萜类物质进行提取。 3.3顶空动态吸附法 顶空动态分析法是通过动力泵不断产生惰性气体通过植株将植株所产生的挥发性物质携带通过特定的吸附剂，吸附剂与挥发物分子结合，然后通过有机溶剂将吸附的挥发物洗脱下来，从而得到挥发物的提取液。这个操作中最主要的就是吸附剂、洗脱溶剂的选择和惰性气体的流速。其中较常用的吸附剂有活性炭、super-q、porapak-q和tenax等，常用的洗脱溶剂有正己烷、乙醚、二氯甲烷等。该方法的主要优点是提取植物自然状态下或不同处理下的整个植株的挥发物或植物某个器官产生的挥发物，相比于溶剂提取法、水蒸气蒸馏法所得组分能够较为真实反应植株在自然状态下释放挥发物的情况，而且该方法具有富集作用，适合于痕量分析。但是该方法所用时间较多，吹扫中有可能引入杂质从而影响结果的有效性和可靠性。3.4顶空固相微萃取技术固相微萃取（solid-phase microextraction, spme）是20世纪90年代兴起的一项新颖的样品前处理和富集技术。它的操作方式有两种：一是将spme萃取头直接插入较为洁净的液体样品中，称为直接spme；二是将spme萃取头置于液体或者固体样品的顶空进行萃取，称为顶空spme（hs-spme）。对于非离体烟草的萜类物质提取，采用hs-spme比较合适。hs-spme主要包括分析物从样品挥发至顶空，再扩散至萃取涂层以及在萃取涂层中的扩散这三个步骤。分析物本身的性质、其与基体间的作用力以及萃取涂层对分析物的萃取能力是影响hs-spme萃取效果的主要因素。萃取涂层选择的主要原则就是“相似相容”原理。该方法主要的优点是简单、迅速、可自动取样分析，而且样品用量较少，所测植株可以是活体植物材料。但是该方法的装置成本高，提取物质只能用于化学分析，不适合于生物分析。另外提取的样品必须立即分析，不能长时间保存。4. 总结烟草是一种重要的经济作物，它在生长发育的每个阶段都可能受到不同昆虫或者病原物的侵害。而对于对病害或者昆虫侵害起防御反应的一个重要方面就是萜类化合物的合成。但是关于昆虫或者病害如何调控萜类化合物的合成，具体调控了哪些萜类化合物还是不清楚，有待深入研究。目前萜类物质及分析方法研究存在的问题。1. 采用不同的烟草种类或品种，提取到的萜类物质可能不同；2. 烟草在不同的环境条件下，例如，受到不同有害生物危害的情况下，萜类物质的合成和表达可能不同。3. 不同的提取方法可能影响烟草萜类物质的分析。参考文献：bailey ja, burden rs, vincent gg. 1975. capsidiol: an antifungal compound produced in nicotiana tabacum and nicotiana clevelandii following infection with tobacco necrosis virus. phytochemistry. 14: 597.bohlmann jrg, stauber ej , krock b, oldham nj, gershenzon j, baldwin it. 2002. gene expression of 5-epi-aristolochene synthase and formation of capsidiol in roots of nicotiana attenuata and n. sylvestris. phytochemistry. 60: 109-116.burden rs, bailey ja, vincent gg. 1975. glutinosone, a new antifungal sesquiterpene from nicotiana glutinosa infected with tobacco mosaic virus. phytochemistry. 14: 221-223.chang sy, grunwald c. 1976. duvatrienediol, alkanes and fatty acids in cuticular wax of tobacco leaves of various physiological maturity. phytochemistry. 15: 961-963.cutler hg, cole rj. 1974. properties of a plant growth inhibitor extracted from immature tobacco leaves. plant and cell physiology. 15: 19-28.cutler hg, reid ww, deltang j. 1977. plant growth 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