肝衰竭免疫发病机制若干研究进展课件_1

肝衰竭免疫发病机制 若干研究进展 20112011年年3 3月月2626日日 中国中国 西安西安 浙江大学医学院附属第一医院浙江大学医学院附属第一医院 传染病诊治国家重点实验室传染病诊治国家重点实验室 陈陈 智智 免疫耐受 免疫损伤 损伤加剧 正常人 携带者 慢乙肝 重症肝炎 1、免疫耐受 缺 乏 对 发 病 机 制 全 面 准 确 的 了 解 2、免疫损伤 3、肝炎重症化 4、肝癌 乙型病毒性肝炎发病机制研究 固有免疫固有免疫 特异性免疫特异性免疫 细胞因子风暴细胞因子风暴 细细 胞胞 凋凋 亡亡 肝衰竭免疫发病机制 Toll样受体（TLRs） 模式识别受体 固有免疫 固有免疫细胞 肝脏有体内最大的巨噬细胞群库普弗细胞、多种类型的 DCs、NK和NKTs，均为固有免疫系统的重要成员，也是肝 脏执行固有免疫功能的结构基础。 重型肝患者中，可能有较多的N K细胞及NKT细胞浸润到 肝组织中，通过分泌IFN等促炎因子而引起肝组织的损害 巨噬细胞与重型肝炎的关系 巨噬细胞的浸润及枯否细胞增生是重型肝炎的典型特 征。 活化巨噬细胞分泌的多种细胞因子似乎在重型肝炎发 病中起着至关重要的作用,其通过多种机制导致肝细胞 损伤。 在H B V转基因小鼠暴发型肝衰竭模型中，IFN-激 活巨噬细胞启动的迟发性超敏反应是肝脏大面积坏死 的原因。 巨噬细胞的激活及其作用 分泌大量细胞因子 迟发性超敏反应 肝细胞大量坏死 氧自由基 IFN TNF TNF IL-1 IL-8 TNF- IL-6 IL-10 GM/G/M-CSF IFN- 免疫凝血物质，如组 织因子和fgl2(人纤维 介素蛋白)凝血酶原酶 纤维蛋白的沉积 微血管血栓的形成 白细胞聚集 炎性反应的上调 细胞因子风暴 NO 分泌大量细胞因子， 特别是IFN 迟发性超敏反应 肝细胞大量坏死 宿主CTL反应 CTL:穿孔素、细胞毒素 介导细胞凋亡 TH 特异性免疫 Aggressive Immune Responses Regulatory Immune Responses (Regulatory T cells) 免疫调节T淋巴细胞（Tregs ） Tregs由多种独特的T淋巴细胞亚型 所组成，虽然所占比例很小，但 在保持对自身抗原和外来抗原耐 受方面具有极其重要的作用。 王福生教授课题组研究表明：与正常人相比，慢性重度乙型肝炎 患者外周血和肝脏组织内CD4+CD25+Treg细胞均明显增多，并且 Foxp3阳性细胞和炎症细胞在肝脏内急剧聚集。 Nakayama Y 等人将腺病毒编码的CTLA-4Ig （AdCTLA-4Ig） 注入 LPS 诱导的暴肝小鼠体内，发现治疗组小鼠全部存活，肝出血性损 伤及血清转氨酶显著降低。 我们研究也证实了CTLA4与肝炎重症化密切相关。 免疫调节T淋巴细胞 Th17细胞 IL-6+TGF-beta可以刺激Th17分化；Th17分泌的CK主要是： IL-17,IL-22,IL-21等 Th17能迅速启动由中性粒细胞介导的炎症反应过程,许多 病原体感染都主要通过Th17途径被控制。 过去大量的研究表明病毒型肝炎的发生是Th1介导的，最 近发现Th17细胞与病毒性肝炎的肝脏损伤密切相关。 郑树森院士课题组的研究表明（J Clin Immunol，2010）急慢性HBV患者的肝 脏有大量的IL-17+细胞浸润，肝内IL-17+细胞的数量与肝脏的炎症程度成正比 ，且HBV患者肝内IL-17+细胞和IL-8的表达以及中性粒细胞的浸润程度正相关 。 王福生教授课题组的研究表明：（Hepatotogy，2010）对CHB患者的Th17细胞 进行研究发现CHB患者外周血和肝内的Th17细胞显著高于正常人。Th17细胞的 升高可以进一步激活mDCs和单核细胞，促使它们释放炎症细胞因子， Th17细胞 细胞因子风暴 随着活化的淋巴细胞、巨噬细胞NK细胞、 NKT细胞等浸润释放细胞因子并不断放大、 相互作用形成网络，诱导肝细胞凋亡，促进 白细胞活化和单核细胞的浸润，并诱导血管 粘附分子的改变。包括TNF-a、IFN-、IL-6、 IL-8/IL-15 。 IFN-是由激活的T 细胞和NK 细胞产生的细 胞因子，可以抑制病毒复制， 对调节机体 的免疫应答具有重要作用。对重型肝炎患者 肝内细胞因子表达的研究结果显示慢性重型 肝炎组IFN-水平显著高于CHB组和正常对照 组。 进一步激活固有和特异性 免疫及迟发性超敏反应 肝细胞凋亡 死亡受体介导肝细胞凋亡 lFasFasL lTNFTNFR1 lTRAIL1TRAILR1 lTRAIL-2 /TRAILR2 TNFTNFR 1系统 研究发现急性暴 发性病毒性肝炎 患者血清中TNF 、可溶性的 TNFR1和TNF R2均升高 提示TNF可能 与大面积肝坏死 有关，可能是因 为激活NFB、 JNK激酶，诱导 细胞凋亡 检测血清中可溶 性TNFR1可用 于判断急性暴发 性肝炎的预后 NF-kB activation TNF-RI (p55) TNFa TRADD RIP TRAF 2 pro-caspase 8 CARD caspase cascade MAP3K IKK complex MEK (MAPK) cascade JNK c-Jun AP-1 Gene ActivationApoptosis Death domain Death domain Death domain Death domain Death domain TRADD FADD Death domain kinase Death domain effector domain caspase 8 FasFasL配体系统 Fas单克隆抗 体注入小鼠体内，发现肝细胞大量凋亡并引起暴发性肝炎 暴发性肝炎时肝细胞不表达 bcl-2。 bcl-2转基因小鼠实验证实， bcl-2 能保护肝细胞免遭Fas介导的 cTL对肝细胞的杀伤 TRAIL1和TRAIL-2TRAILR1和TRAIL R2系统： TRAIL区别于TNF、FasL最为显著的特点是特异性诱导转化 细胞、肿瘤细胞和病毒感染细胞发生凋亡，而不影响正常 组织细胞的功能。也正是因为这一特性，目前TRAIL己成 为众多研究的焦点 。 研究发现，重型肝炎患者血清可溶性TRAIL显著升高，且 与血清LPS浓度以及肝脏损伤严重程度呈正相关。 另有研究表明，HBV感染患者体内HBX蛋白的表达使得肝细 胞在TRAIL-诱导下发生凋亡。HBV的C 蛋白可以抑制TRAIL -介导的肝细胞凋亡。 肝衰竭分子机制研究的临床意义 明确临床起病前，患者体内发生了什么样 的分子改变，有助于早期诊断和治疗 阐明肝衰竭发生的早期事件有助于患者的 早期诊断，降低发病率 对肝衰竭患者进行早期干预、早期治疗是 助于降低病死率 暴 肝 进 展 过 程 起病 大量分子水平变化急 转 直 下 发现发现CD4 + CD25+TregCD4 + CD25+Treg在乙肝病毒在乙肝病毒 感染后免疫耐受机制中起重要作用感染后免疫耐受机制中起重要作用 发现发现HBcAgHBcAg、HBxAgHBxAg、IL-10IL-10等通过调节等通过调节 TH17TH17细胞的数量和功能对肝脏炎症产生影响细胞的数量和功能对肝脏炎症产生影响 前期研究回顾前期研究回顾 重症肝炎发病相关分子的筛选和研究重症肝炎发病相关分子的筛选和研究 我们研究组近期部分研究结果我们研究组近期部分研究结果 HBsAgHBsAg作用于作用于DCDC细胞后，免疫细胞后，免疫BalbBalb/C /C 小鼠和小鼠和HBVHBV转基因鼠转基因鼠 HBV DNAHBV DNA滴度下降滴度下降 回顾前期研究：回顾前期研究： 采用乙肝抗原肽刺激采用乙肝抗原肽刺激DCDC细胞，能部分打破免疫耐受细胞，能部分打破免疫耐受 A A：免疫后：免疫后2 2周周 B B：免疫后：免疫后4 4周周 脾细胞的脾细胞的CTLCTL活性增强活性增强 慢乙肝组患者外周血慢乙肝组患者外周血CD4 CD4 + + CD25 CD25 + + T T细胞频率细胞频率显著增显著增 高高 eAgeAg（）患者外周血（）患者外周血 CD4+CD25+ TCD4+CD25+ T细胞频率高细胞频率高 CD4CD4 + + CD25CD25 + + T T 细胞细胞/CD 4+/CD 4+在慢性在慢性 肝炎患者外周血中表达高肝炎患者外周血中表达高 PengPeng GP,ImmunologyGP,Immunology. 2008,123(1):57-65 . 2008,123(1):57-65 发现发现CD4 CD4 + + CD25 CD25 + + 调节性调节性T T细胞在乙肝病毒细胞在乙肝病毒 感染后免疫耐受机制中起重要作用感染后免疫耐受机制中起重要作用 137137例乙肝患者例乙肝患者 外周血用流式细外周血用流式细 胞术进行检测胞术进行检测 TrehanPati在Hepatology上引用：慢性重度患者中的外周CD4+CD25+ 调节 性T细胞的频率显著高于慢性轻度及急性早期患者 细胞因子，IL4、 IL-10、TGF- CD4+CD25+ 丰富了乙型肝炎免疫耐受机制丰富了乙型肝炎免疫耐受机制 重点 研究 在机体对乙肝病毒耐受的情况下，为什么 患者还会出现严重的肝损伤呢 TH17TH17水平与水平与病毒载量、转氨酶病毒载量、转氨酶呈正相关呈正相关 TH17 TH17在乙肝损伤中起重要作用在乙肝损伤中起重要作用 慢乙肝组慢乙肝组患者外周血患者外周血TH17TH17细细 胞明显胞明显增高，且增高，且随着病情加随着病情加 重重Th17/Tc17Th17/Tc17百分比百分比增加增加 HBcAgHBcAg可可诱导慢性肝炎患者的诱导慢性肝炎患者的PBMCPBMC分泌多种分泌多种Th17Th17相关因子（相关因子（ TH17ATH17A、ILIL2222、ILIL2323、ILIL6 6、TGFTGF、ILIL1010），而在），而在 健康人健康人PBMCPBMC中没有明显改变中没有明显改变 Li Li JieJie, Antiviral Research, Antiviral Research，2010,85(3): 463-469 2010,85(3): 463-469 多种因素可调控多种因素可调控TH17TH17细胞功能细胞功能 HBcAgHBcAg作用作用 正常对照正常对照 Wu W, et al. Journal of Gastroenterology and Wu W, et al. Journal of Gastroenterology and HepatologyHepatology, 2010, 25(4):750-757 , 2010, 25(4):750-757 去除去除CD4 CD4 + + CD25 CD25 + + 调节性调节性T T细胞细胞 后对慢性乙型肝炎患者后对慢性乙型肝炎患者PBMCPBMC中中 HBcAgHBcAg诱导的诱导的Th17Th17细胞亚群表达细胞亚群表达 增加增加 Th17 Th17与与CD4 + CD25+ CD4 + CD25+ 调节性调节性T T细胞相关性研究细胞相关性研究 应用应用miRNAmiRNA抑制抑制PBMCPBMC中的中的FOXP3FOXP3后，后， HBcAgHBcAg诱导的诱导的TH17TH17的百分比更高的百分比更高 HBxAgHBxAg可通过可通过MyD88MyD88使使ILIL6 6提高提高，后者可造成前体细胞向，后者可造成前体细胞向TH17TH17 细胞分化细胞分化 多种因素可调控多种因素可调控TH17TH17细胞功能细胞功能 HBxAgHBxAg作用作用 NF-NF- B B抑制剂抑制剂 MEK1/2MEK1/2抑制剂抑制剂 P38P38抑制剂抑制剂 NF-NF- B B抑制剂抑制剂 MEK1/2MEK1/2抑制剂抑制剂 P38P38抑制剂抑制剂 HBxHBx基因在肝和肝癌细胞的表达导致基因在肝和肝癌细胞的表达导致IL-6IL-6合成和分泌提高。这些细胞中合成和分泌提高。这些细胞中MyD88MyD88的失活的失活 阻止了阻止了HBxHBx触发的触发的IL - 6IL - 6产生。产生。HBxHBx蛋白的表达也激活了蛋白的表达也激活了MyD88MyD88的下游信号蛋白的下游信号蛋白, ,如如 IRAK- 1IRAK- 1等，如用相应的抑制剂这些信号分子，从而阻断了等，如用相应的抑制剂这些信号分子，从而阻断了IL - 6IL - 6的合成的合成 Li Li J,etJ,et al. al. ImmunolImmunol Cell Biol. 2010,88(8):834-841 Cell Biol. 2010,88(8):834-841 给予给予ILIL1010干预干预，可，可 抑制多种抑制多种TH17TH17相关因相关因 子（子（TGFTGF1 1除外）除外） ILIL1010水平与肝炎炎症程度水平与肝炎炎症程度呈负相关呈负相关ILIL1010水平与水平与TH17TH17细胞频率细胞频率呈负相关呈负相关 多种因素可调控多种因素可调控TH17TH17细胞功能细胞功能 IL-10 IL-10作用作用 IL-10IL-10IL-6IL-6TGF-1TGF-1 IL-17AIL-17AIL-23IL-23IL-22IL-22 IL-10IL-10 IL-10IL-10 ALTALTTh17 Th17 IL-10对rHBcAg诱导的Th17相关细胞因子分泌的调控 ILIL1010下调下调CD4CD4 T T细胞上的 细胞上的RORtRORt分子表达，分子表达，抑制抑制 对对HBcAgHBcAg诱导的诱导的TH17TH17细胞免疫反应细胞免疫反应 多种因素可调控多种因素可调控TH17TH17细胞功能细胞功能 IL-10 IL-10作用作用 该作用该作用与与CD4CD4 + + CD25CD25 + + 调节性调节性 T T细胞的参与细胞的参与无关无关 不同感染阶段：慢乙肝患者不同感染阶段：慢乙肝患者CD8CD8 + + T T细胞细胞, ,尤其尤其 是是HBVHBV特异性特异性CD8CD8 + + T T细胞上细胞上PD-1PD-1表达水平升高表达水平升高 使用使用PD1PD1单抗阻断后，可有效增强慢乙肝患者单抗阻断后，可有效增强慢乙肝患者 PBMCPBMC增殖增殖和和IFN-IFN-水平水平 多种因素可调控多种因素可调控TH17TH17细胞功能细胞功能 PD PD1 1作用作用 PengPeng GP, GP, Mol Immunol,2008,45(4):963-970 Fourcade 在 J Immunol 上引用：PD-1/PD-L1通路在 病毒特异性的细胞功能耗竭中起重要作用 PD-1PD-1表达水平表达水平 骨桥蛋白调节NKT细胞对肝 细胞的杀伤功能 多种因素可调控多种因素可调控TH17TH17细胞功能细胞功能 骨桥蛋白作用骨桥蛋白作用 骨桥蛋白发挥细胞杀伤作用通过Fas-FasL系统实现 多种因素可调控多种因素可调控TH17TH17细胞功能细胞功能 骨桥蛋白作用骨桥蛋白作用 首次发现骨桥蛋白能调节NKT细胞的成熟与功能。骨桥蛋白的缺失 会造成免疫细胞产生TH2细胞因子能力降低，引起细胞毒功能的降 低，肝损伤的减轻。 发现肝炎中NKT细胞通过骨桥蛋白进行免疫调节作用 Proc Natl Acad Sci U S A.105;41:15884-15889，2008 明阐明阐TH17TH17在乙肝损伤中的作用机制在乙肝损伤中的作用机制 指导临床诊疗指导临床诊疗 IL-10IL-10IL-6IL-6 Th17Th17 IL-17AIL-17A、IL IL2222、IL IL2323、 IL IL6 6、TGFTGF、IL IL1010等等 炎症加重 HBxAgHBxAgMyD88 MyD88 HBcAgHBcAg miRNAmiRNA 封封 闭闭FoxP3FoxP3 CD4CD4 CD25 CD25 调节性调节性T T细胞细胞 骨桥蛋白骨桥蛋白 NKTNKT CD4 CD25 Th17 TH2CFTH2CF 肝衰竭过程中信号通路改变规律肝衰竭过程中信号通路改变规律 动物实验动物实验：ConAConA尾静脉注射小鼠制备暴发性肝炎动物模型尾静脉注射小鼠制备暴发性肝炎动物模型 0h3h 6h 12h 24h48h 不同时间点小鼠肝脏的病变及肝功能变化不同时间点小鼠肝脏的病变及肝功能变化 26个 118个上升 209个下降 1473个基因 21464个基因变化 45101条探针 小鼠肝脏基因表达谱芯片研究小鼠肝脏基因表达谱芯片研究 小鼠基因表达谱芯片小鼠基因表达谱芯片 AffymetrixAffymetrix GeneChipsGeneChips Mouse 430 2.0 Arrays Mouse 430 2.0 Arrays 基因聚类基因聚类 分析结果分析结果 样本聚类样本聚类 分析结果分析