基于液质联用技术的脑得生片和胃复春片物质基础辨识方法研究.pdf

浙江大学药学院 硕士学位论文 基于液质联用技术的脑得生片和胃复春片物质基础辨识方法研 究 姓名：钟敬华 申请学位级别：硕士 专业：中药学 指导教师：范骁辉 20100101 浙江人学硕上学位论文摘要 基于液质联用技术的脑得生片和胃复春片 物质基础辨识方法研究 浙江大学药学院： 2 0 0 7 级硕士研究生： 导师： 中药学 钟敬华 范骁辉副研究员 摘要 明确复方的化学物质基础，对于进一步研究其药效物质基础及提升质量控制 标准等具有重要意义。液质联用技术因其具有强大的分离、鉴定和定量能力，被 广泛用于复杂体系的化学组成表征及其含量变化监测，已经成为中药复方物质基 础研究中重要的分析工具。 本论文运用h p l c d a d e s i m s n 及h p l c q t o f m s 联用技术深入细致地分 析了复方制剂脑得生片及胃复春片的化学物质基础，并对脑得生片0 9 a 血成分进 行了研究探索。主要内容如下： 1 、运用h p l c d a d e s i m s n 方法对中药复方制剂脑得生片的化学成分进行了研 究，共检测到4 3 个色谱峰，并对各峰的药材来源进行了归属。基于质谱裂解 行为，并辅以紫外吸收特征和保留时间差异，共鉴定或推测了2 3 个化合物的 结构，初步明确了脑得生片的化学物质基础。 2 、建立了一种高效液相色谱电喷雾质谱分析方法，用于分析大鼠灌服脑得生片溶 液后血浆样品中的原型药物成分和代谢产物的研究。本实验同时鉴定或推测出 1 8 种原型化合物及5 种代谢产物的结构。该方法简单，可用于快速鉴定脑得生 片入血成分中的原型化合物及代谢产物。 3 、运用h p l c d a d e s i m s n 以及h p l c q t o f m s 方法对中药复方制剂胃复春 片的化学成分进行了研究，共检测到6 0 个色谱峰。通过与对照品及药材的h p l c 保留时间及m s n 、u v 数据比对，高分辨质谱数据分析以及数据库信息检索等， 共鉴定或推测了4 6 个化合物的结构，初步明确了胃复春片的化学物质基础。 浙江大学硕士学位论文摘要 研究结果表明，液质联用技术是研究中药复方化学物质基础的重要分析工具。 通过上述研究，能为进一步揭示脑得生片及胃复春片的药效物质基础以及提高制 剂质量控制标准提供有效翔实的数据和方法学支撑。 关键词：中药复方物质基础；脑得生；胃复春；液质联用技术 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t s t u d i e so nt h ei d e n t i f i c a t i o no fc h e m i c a ls u b s t a n c eo f “n a o d e s h e n g t a b l e ta n d “w e i f u c h u n t a b l e tb y l c m st e c h n o l o g i e s c o l l e g eo fp h a r m a c e u t i c a ls c i e n c e s ，z h e j i a n gu n i v e r s i t y ：s c i e n c eo fc h i n e s ep h a r m a c o l o g y 2 0 0 7g r a d u a t es t u d e n t ：j i n g h u az h o n g s u p e r v i s o r ：x i a o h u if a n ( a s s o c i a t er e s e a r c h e r ) a bs t r a c t t od i s c o v e rt h ec h e m i c a lc o n s i t i t u e n t si nt c m si so fg r e a ti m p o r t a n c ef o rf u r t h e r i d e n t i f y i n ga c t i v ec o m p o n e n t so ft c m sr e s p o n s i b l ef o rt h ep h a r m a c o l o g i c a le f f e c t sa n d f o rc o n s t r u c t i n gs c i e n t i f i cq u a l i t yc o n t r o ls t a n d a r d so fc h i n e s ep a t e n td r u g s h i 曲 p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( h p l c m s ) h a sav e r y p o w e r f u lc a p a b i l i t yf o rs e p a r a t i o na n ds t r u c t u r a li d e n t i f i c a t i o n ，w h i c hc a nc h a r a c t e r i z e c h e m i c a lc o m p o s i t i o na n dc o n t e n tc h a n g e so ft h ec o m p l e xs y s t e mq u i c k l ya n d e a s i l y h e n c e ，i th a sb e c o m ea ni n d i s p e n s a b l ea n a l y t i c a lt o o li nt h es t u d yo nc h e m i c a l c o n s t i t u e n t so f t c m s i nt h i st h e s i s h p l c d a d e s i m s na n dh p l c q t o f m sb a s e dm e t h o dw e r e p r o p o s e di nt h es t u d i e so nt h ec h e m i c a la n a l y s i so f “n a o - d e s h e n g t a b l e ta n d “w e i f u c h u n ”t a b l e t ，a n dh p l c - d a d - e s i m s “w a sa l s oe m p l o y e di nt h ea n a l y s i s o fr a tp l a s m as a m p l e sa f t e ro r a la d m i n i s t r a t i o no f n a o d e - s h e n g ”t a b l e t t h em a i n c o n t e n t sa n dr e s u l t so fm i st h e s i sa r el i s t e da sf o l l o w s ： 1 ah p l c d a d e s i m s “m e t h o dw a sc o n s t r u c t e dt or e v e a lo fc h e m i c a l s u b s t a n c ei n “n a o d e - s h e n g ”t a b l e t at o t a lo f4 3p e a k sw e r ed e t e c t e d a n da l lt h e h e r b a lp e a k sw e r ea s s i g n e d b yc o m p a r i n gr e t e n t i o nt i m e ，u va b s o r p t i o nw a v e l e n g t h v 浙江人学硕士学位论文a b s t r a c t a n dm si n f o r m a t i o nw i t hs t a n d a r dc o m p o u n d si n f o r m a t i o na n dl i t e r a t u r ed a t a ，at o t a lo f 2 3c o m p o u n d sw e r es u c c e s s f u l l yi d e n t i f i e d 2 ah p l c - d a d - e s i - m s nm e t h o dw a sd e v e l o p e dt o a n a l y s i st h ep r o t o t y p e c o m p o u n d sa n dt h e i rm e t a b o l i t e so fr a tp l a s m as a m p l e sa f t e ro r a la d m i n i s t r a t i o no f n a o - d e s h e n g ”t a b l e t i nt h i ss t u d y , 18p r o t o t y p ec o m p o u n d sa n d5m e t a b o l i t e s w e r ed e t e c t e d ，a n dw ei d e n t i f i e do rt e n t a t i v e l ye l u c i d a t e dt h e i rs t r u c t u r e s t h i sm e t h o d i sv a l i d a t e da sas i m p l e ，r e l i a b l em e t h o df o rr a p i di d e n t i f i c a t i o nt h e p r o t o t y p e c o m p o u n d sa n dt h e i rm e t a b o l i t e so fr a tp l a s m as a m p l e sa f t e ro r a la d m i n i s t r a t i o no f n a o d e s h e n g ”t a b l e t 3 h p l c - d a d - e s i - m s na n dh p l c q - t o f m sb a s e dm e t h o dw e r ee m p l o y e d t or e v e a lo fc h e m i c a ls u b s t a n c ei n “w e i - f u - c h u n ”t a b l e t at o t a lo f6 0p e a k sw e r e d e t e c t e d ，a n da l lt h eh e r b a lp e a k sw e r ea s s i g n e d i nt h ee n d ，at o t a lo f4 6c o m p o u n d s w e r ei d e n t i f i e db yc o m p a r i n gr e t e n t i o nt i m e ，u va b s o r p t i o nw a v e l e n g t ha n dm s i n f o r m a t i o nw i t hs t a n d a r dc o m p o u n d si n f o r m a t i o na n dl i t e r a t u r ed a t a ，a n da l s ob y h i g h r e s o l u t i o nm a s ss p e c t r o m e t r yd a t aa n a l y s i sa n dd a t a b a s ei n f o r m a t i o nr e t r i e v a l t h e m e t h o di n i t i a l l yd e f i n e dt h ec h e m i c a ls u b s t a n c eo f “w e i - f u - c h u n ”t a b l e t t h er e s e a r c ho ft h e p r e s e n tw o r ki n d i c a t e dt h a th i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( h p l c m s ) i si n d e e dav e r yp o w e r f u la n a l y t i c a l t o o lf o rt h es t u d i e so nc h e m i c a ls u b s t a n c eo ft c m s t h er e s u l t so ft h e s es t u d i e sw o u l d b eh e l p f u lt od i s c o v e rt h eb i o l o g i c a l l ya c t i v e c o m p o u n d sa n dp r o v i d e d v a l u a b l e i n f o r m a t i o nf o rt h ed e v e l o p m e n ta n d i m p r o v e m e n to f t h e q u a l i t yc o n t r o l o f “n a o d e s h e n g ”t a b l e ta n d “w e i f i7 c h in 、丁”t a b l e t k e y w o r d s ：c h e m i c a ls u b s t a n c eo ft r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e s ( t c m s ) ； n a o - d e s h e n g t a b l e t ：w e i - f u - c h u n t a b l e t ；h p l c m s v l 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 一虢即p 飙驯州忡 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 蓁三二二_ ：三二厂雩杼签字日期：wo 年月巧日i 导师签名： 跚芝班 签字日期：洳( o 年；月争日 浙江大学硕士学位论文 致谢 致谢 本论文是在导师范骁辉副研究员的悉心指导和热忱鼓励下完成的，在此谨向 范老师表达我最衷心的感谢。 光阴荏苒，回顾这两年半的硕士生涯，我不禁感慨万千。我的每一点成长都 离不开研究所各位老师和同学们的关心和帮助。在我的硕士学习阶段，导师范骁 辉副研究员给予了我极大的关心和指导。范老师是一位年轻有为的导师，他学识 渊博而不失幽默，思维活跃而不失严谨，谦逊温和而不失魄力。无论是做学问， 还是做人做事，范老师敬业求是的精神都使我深受启迪，受益匪浅。 本论文的研究还得到了李云飞博士后和张玉峰博士后的精心指导，在实验设 计及论文撰写过程中给予了我很多的帮助，在实验遇到挫折时也给予了我很大的 鼓励和支持，他们渊博的学识、严谨的作风和乐于助人的态度使我深受感动。在 此衷心地感谢他们给予我的无私帮助。 在研究生阶段，我还得到了邵青老师极大的指导和帮助，无论是具体的实验 工作，还是平常的学习生活，她都给予了我很多的支持。她严谨的工作态度以及 对学生的无私关心给我留下了深刻的印象，在此要特别感谢邵老师。我还要衷心 感谢程翼宇教授、瞿海斌教授、马忠俊副教授、王毅老师、吴斌老师、潘坚扬老 师以及研究所其他所有关心和帮助过我的老师们。 此外，我还要衷心感谢贺庆老师，在硕士生涯的前半年给予我的关心和指导。 要特别感谢葛志伟师兄、水文波师兄、史培颖师姐、张玲师姐、郑辛甜师姐、姚 宏师兄在具体的实验过程中给予我细致耐心的帮助。衷心感谢朱捷强、吴赛伟、 汪晋、俞凌燕、王珏、邵丽、杨颖听、赵琴琴以及药信所其他的同学们在实验和 生活中对我的关心和帮助。特别感谢程翼宇教授带领的药信所团队为我们创造了 优越的实验条件，诚挚地感谢他们的帮助与支持。 最后，我要特别感谢给予我无微不至关怀的家人以及与我同舟共济的男友， 他们无私的鼓励和关心让我顺利地完成了学业，更是我不懈努力的动力! 钟欹罕 2 0 0 9 年1 2 月于求是园 浙江大学硕七学位论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 中医药拥有悠久的历史，几千年来为中华民族的繁衍生息做出了不可磨灭的 贡献。中药复方是根据中医药的理法方药和辩证施治的规律及长期医疗实践中总 结出来的有效方剂，是中医临床用药的特点和精髓e l , 2 。中药复方有方剂组成之“君 臣佐使”，有药物配伍之“七情合和”，药有限而方无穷，集中体现了祖国医学的 博大精深。但迄今为止，中药复方物质基础研究未能取得突破性进展，人们对于 复方治病疗效往往只是知其然而不知其所以然。这已然成为制约中医药现代化及 国际化进程的重要瓶颈。因此，探求中药复方物质基础是中医药发展的必然要求， 对于揭示中药复方作用机制及配伍规律、保障复方制剂质量安全以及更有效地指 导临床应用和新药开发等具有重要意义。 中药复方物质基础研究是一项复杂的系统工程，而中药复方化学物质基础研究 又是这项系统工程中最基础的部分。但由于中药复方通常由多味中药组成，其中 包含的化学成分达上百种，甚至更多，这给复方化学物质基础的研究带来很大的 困难。加之中药药材来源、加工工艺，剂量配伍等因素都会使得中药复方化学组 成发生变化，这些因素都能直接影响到中药复方的疗效【3 1 。因此，如何利用现代先 进的分析仪器，建立科学的分析方法，研究中药复方的化学物质基础及活性成分 的体内过程，是当今中药复方物质基础研究的关键科学问题。 高效液相色谱质谱联用技术( 本文简称液质联用技术) 拥有液相色谱的优越 分离能力，以及质谱的高灵敏度、高选择性和强大的定性专属性，特别适合分析 复杂体系中的微量、痕量成分，已成为中药复方物质基础研究中必不可少的分析 工具。 1 2 中药复方物质基础研究进展 中药复方物质基础的研究一直是中药复方研究的重点及热点问题，也是中医 药研究中的关键科学问题。因此科研学者们提出了许多假说理论，从不同角度对 浙江大学硕上学位论文 第一章绪论 复方物质基础进行了研究剖析。从最早的“证治动力学”假说【4 】到复方霰弹理论的 提出【5 1 ，再到如今的“三个层次多维结构”假说【6 1 ，各种学说理论纷至沓来。伴 随着各种学说理论的产生，中药复方物质基础研究也出现了百家争鸣的局面。虽 然研究的思路和方法各异，但中药复方的物质基础研究都在沿着从单一到整体、 从体外到体内、从静态到动态的趋势不断发展。 中药复方物质基础的研究是一项复杂的系统工程，无论是化学物质基础研究 还是药效物质基础研究，抑或是近年来发展起来的血清化学及血清药理学研究， 学者们希望能从多角度去研究中药复方的物质基础，为最终阐明其作用机制提供 多方面的数据支持。本文作者认为，中药复方化学物质基础的研究是中药复方研 究中最为基础的研究性工作。明确复方的化学物质基础，了解复方的入血成分， 对于进一步研究其药效物质基础及提升质量控制标准等具有重要意义。本文拟以 若干方剂为例，探讨中药复方物质基础辨识方法。据此，本章节重点综述了中药 复方化学物质基础以及中药复方血清化学的研究概况。 1 2 1 中药复方化学物质基础的研究进展 中药复方临床疗效的物质基础是其化学成分的总和，各单味药经配伍产生化 学成分的变化，各成分保持适宜的浓度范围和比例而发挥作用【7 1 。但由于受到技术 条件等多方面制约，人们难以全面地分析了解中药复方的化学物质基础，对中药 复方整体的定性( 即全部化学成分) 、定量( 即复方问量比关系) 知之甚少【7 1 。因此， 早期的研究中应用最多的是经典的植化分离提取技术如薄层层析、硅胶柱层析、 反相柱层析等，以及各类光谱解析技术，研究对象也大多集中在对有效成分或有 效部位上。多年来，中医药学者不懈努力，建立了众多中药复方化学成分的分析 方法。从单味药材的系统分离法到拆方研究再到整方研究，植物化学为我们提供 了强有力的手段。夏云等【8 1 采用薄层层析和硅胶柱层析等方法对生脉散的化学成分 进行了研究，分离鉴定了在煎煮过程中由复方产生的新成分5 羟甲基2 糠醛，并 探讨了复方化学成分动态变化与药效之间的关系。马兆堂，杨秀伟等【9 】从黄连解毒 汤的醋酸乙酯可溶性部分分离得到3 5 个化合物，并对其中的2 0 个化合物进行了 浙江大学硕十学位论文第一章绪论 鉴定归属，朔源这些化合物皆来源于黄芩。 随着分析化学技术与仪器的不断进步，中药复方化学物质基础的分析方法也 日新月异。目前，高效液相色谱在中药复方化学物质基础研究中应用最为广泛【1 0 ， 1 1 1 ；若复方中含有易挥发的成分，则应优先选择检测灵敏度高、分离效率高的气相 色谱进行分析【1 2 1 3 1 ；若复方中含有大分子化合物还可选用毛细管电泳的分析方法 【1 4 ，l s 】 联用技术的发展非常快，这一技术被作为h p l c 技术的补充和发展，对于中 药复方中大量未知组份的定性分析通常需借助于联合技术。包括液相色谱质谱 ( l c m s ) 联用技术、气相色谱质谱( g c m s ) 联用技术、毛细管电泳质谱 ( c e m s ) 联用技术等。 刘倩等【1 6 】采用h p l c e s i m s “法建立了复方苦参注射液化学成分的快速分析 方法，采用正离子模式从制剂中分离鉴定了1 1 种生物碱类成分；w a n g 等【1 7 1 运用 l c e s i m s 方法在负离子模式下对复方制剂生脉饮中的人参皂苷类成分进行了定 性分析，该方法快速、准确，可用于生脉饮中人参皂苷的检测和制剂质量控制研 究；s h a 等【1 8 1 运用h s s p m e g c m s 方法对中药复方小承气汤中的挥发性成分进 行了分析，鉴定了包括柠檬烯和芳樟醇等在内的2 7 个成分；f e n g 等【1 9 】采用c e m s 技术对中药马钱子与乌头制剂中的生物碱类成分进行了分析研究，发现该技术能 很好地运用到中药制剂的分析中去。 这些分析技术的长足发展以及检测手段的逐步升级，为中药复方化学物质基 础的分析带来了新的契机，更是加快了中药复方研究的步伐。 1 2 2 中药复方血清化学研究进展 中药复方是一个复杂的化学体系，采用传统药代动力学的方法以单一或少数 几个成分的药动学参数难以反映复方整体的药动学特征。1 9 8 4 年，日本学者田代 真一提出了含药血清方法的设想，其认为中药中虽含有众多成分，但只有被吸收 入血的成分才能产生作用，否则没有成为有效成分的可能。他进行一系列富有成 效的研究，先后于1 9 8 8 年和1 9 9 2 年两次撰文，提出了“血清药理学”和“血清 3 浙江大学硕士学位论文 第一章绪论 化学”的概念【2 0 1 。中药血清药物化学即是以中药口服给药后血清为样品，按传统 药物化学相同的研究方法，结合多种现代分析技术，从血清中分离、鉴定移行成 分，研究血清中移行成分与传统疗效的相关性，阐明体内直接作用物质的代谢及 体内动态变化的领域 2 1 1 。这一研究除包括含药血清的制备及成分的分离和结构鉴 定外，还包括药效相关性研究，药效物质基础的体内代谢过程和机制的阐明，属 代谢化学研究范畴，可以认为是药效物质基础研究和中药科学化研究的新领域， 它为中药复方药动学研究开辟了一条新的途径。 目前这方面的研究已成为中药药代动力学的研究热点。王喜军等【2 2 】采用h p l c 色谱指纹分析方法对六味地黄丸的血清化学进行研究，鉴定灌服六味地黄丸后大 鼠血清中移行成分、来源生药及其代谢产物。王亚丽等【2 3 】采用h p l c d a d 。m s 方 法分析了实验兔灌服当归提取物后吸收成分及其代谢产物。近年来随着现代仪器 分析的发展，越来越多的新技术被应用到体内药物分析领域，也推动了体内药物 分析的快速发展。随着液相色谱质谱联用仪的普及，它在中药血清化学研究领域 必将逐渐取代h p l c ，成为主流分析手段。 中药血清化学研究，使中医药研究进入系统药学研究的科学化领域，深入研 究中药血清化学，将使中药临床用药更具指导性和科学性。一个疗效确切的方剂 进入人体内的成分谱中多数成分是否存在对疾病的多靶点基因表达的调控作用， 是否影响集体多层次网络系统中的内源性成分以及如何从成分谱中挖掘一类新药 前体，如何将靶成分发展成为复方新药前体，是今后中药复方血清化学研究中亟 待解决的问题 2 4 , 2 5 】。 1 3 液质联用技术在中药复方物质基础研究中的应用 自上世纪九十年代成套的液质联用仪器问世至今，液质联用技术已在生物、 医药、化工、环境等众多领域发挥着其不可比拟的作用。该技术强大的分离鉴定 能力以及高灵敏度、高选择性等优越性能使其成为了分析复杂样品的重要工具。 随着液质联用仪的迅猛发展，该技术被逐渐应用于中药化学成分的定性定量 分析，甚至是更为复杂的中药复方物质基础研究。本小节的综述不能穷举所有相 4 浙江大学硕士学位论文第一章绪论 关文献，只是对液质联用技术在中药复方物质基础研究中的应用进行简要概述。 1 3 1 液质联用技术在中药复方定性分析中的应用 中药成分复杂，单味药中也含有多种化学成分，具有多种功效，可以说是一 个小复方。因此对单味药的研究在一定程度上有助于复方化学物质基础的研究。 经过多年的研究积累，液质联用技术在中药研究领域已被用于各类成分的包括皂 苷、黄酮、生物碱、酚酸类及其他类型化合物的分析研究【2 6 1 。液质联用仪拥有液 相强大的分离能力，可以将中药中的复杂成分进行有效分离；而质谱( 特别是三 重四级杆质谱及离子阱质谱) 可以提供多级碎片信息，能在线鉴定已知化合物， 也能根据某一类化合物的裂解规律来推断未知成分的结构。因此，这一技术已成 为中药化学成分鉴定中的重要分析工具。 近几年，液质联用技术已被广泛应用到中药复方的研究中。在中药复方体外 化学物质基础研究方面，液质联用技术体现了其无可比拟的优越性，能较全面直 观地反映复方的化学组成情况，通过对化合物的质谱解析，能明确复方化学物质 基础，对于进一步研究药效物质基础以及提高制剂的质量控制标准具有重要意义。 z h a n g 等 2 7 】采用l c m s m s 方法对中药复方制剂参麦注射液的化学成分进行 了分析研究，在制剂中检测到3 9 个人参皂苷；b a o 等e 2 8 1 对小柴胡汤的化学物质基础 进行了研究，运用l c m s m s 建立了对制剂中1 5 种柴胡皂苷衍生物的定性定量分 析；l i u 等【2 9 】分析了四君子汤中的黄酮、皂苷和三萜三大类成分，根据【m + n a + 的 m s 和m s m s 对化合物结构进行了推断；z h a n g 等t 3 0 】使用h p l c d a d e s i m s 确定 了血府逐瘀汤中1 7 种活性成分的结构，并对这些化合物的来源进行了归属；李云 飞等【3 1 】用h p l c d a d e s i m s “方法分析鉴定了芪参益气滴丸的化学成分，共检测 到了3 1 个化合物，其中2 0 个化合物被鉴定推断结构；w a n g - 等t 3 2 1 运用e s i m s n 从中 药复方龙胆泻肝汤中分离鉴定了5 1 个黄酮类化合物，并通过m s m s 对黄酮、黄烷 酮、查尔酮和异黄酮的质谱裂解行为进行了研究。 自w a t e r s 公司推出了超高效液相色谱( u l t r ap e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ，u p l c ) 技术后，u p l c m s 联用技术更是以快速高效、高灵敏度、 气 浙江大学硕士学位论文第一章绪论 低溶剂消耗等优点受到了药物分析工作们的青睐窦志华等【3 3 】采用 h p l c d a d u p l c m s m s 联用技术对复方五仁醇胶囊进行定性定量分析，发现该 制剂中主要含有木脂素类和皂苷类成分。郑辛甜等【3 4 】采用u p l c t o f m s m s 法对 温脾汤的化学物质基础进行了分析，共检测到6 4 个色谱峰，鉴定出5 9 个化合物， 这些化合物主要分为酚类化合物、生物碱、三萜皂苷和黄酮苷四大类。 液质联用技术不仅能对中药复方进行体外化学物质基础的分析鉴定，近年来 对复方入血成分的研究也成为了热点。y a n g 等 3 5 1 研究了灌服补阳还伍汤后猪血清 中的化学成分，采用h p l c d a d m s 共检测到4 5 个色谱峰，鉴定了9 4 “ 化合物，其 中8 个为代谢产物，只有1 4 - 为补阳还伍汤中的原形化合物；w a n g n t 3 6 】基于代谢指 纹分析技术和l c d a d m s 分析技术，建立了一种快速筛选和分析家兔口服当归补 血汤后血浆中的入血成分和代谢物的方法，共发现有4 6 种成分被吸收进入家兔体 内，并对其中的1 0 种化合物进行了结构鉴定。另外，在代谢指纹谱上检测到2 1 种 化合物，推测其可能为当归补血汤中某些成分的代谢产物。王喜军等【3 7 】建立了快 速的u p l c q t o f m s m s 方法对茵陈蒿汤的血清化学进行了研究，鉴定灌服茵陈 蒿汤后大鼠血浆中移行成分、来源生药及其代谢产物。共鉴定了4 5 个化合物，在 大鼠血浆中检测到2 1 个化合物，其中2 个为代谢产物。 1 3 2 液质联用技术在中药复方定量分析中的应用 液质联用技术强大的分离及结构鉴定能力使得其在中药复方化学成分定性分 析中具有极大的优越性。但除此之外，该技术还拥有高灵敏度和高选择性的优点， 非常适合对中药复方中化学成分进行定量分析，特别是在对生物样品的痕量成分 分析方面更是其他技术不可比拟的。因此，液质联用技术被越来越多地应用到了 中药复方化学成分的定量分析中来，甚至是运用到了中药复方的药代动力学、代 谢组学等研究中。 在对中药复方的定量分析中，多采用液相- 9 单重四级杆( l c m s ) 或液相与 三重四级杆( l c m s m s ) 联用技术，通过选择离子检测( s i m ) 、选择反应监测 ( s r m ) 或多反应监测( m r m ) 等模式同时定量测定多种化学成分【2 6 1 。由于中药 浙江大学硕士学位论文 第一章绪论 复方成分更为复杂，而且中药复方化学成分的定量分析也越来越倾向于同时测定 多种成分和同时测定不同类别的多种成分，因此对分析仪器的要求也越来越高了。 c h a n g 等 3 8 1 建立了快速准确的h p l c m s 方法同时定量测定了中药复方生脉散 中的8 个活动成分，包括人参中的皂苷及五味子中的木脂素成分；j o n g 等【3 9 1 对祛 风散和当归拈痛散中的苦参碱、氧化苦参碱、阿魏酸、芒果苷和甘草酸这5 种成 分进行了定量分析，建立了简单、快速、重复性好、选择性高的l c m s m s 方法， 结果发现不同来源的制剂间成分含量差别很大。 l i 等m 】用l c m s m s 对大鼠灌服柴胡枳壳汤后血浆中化学成分进行了定性定 量研究，运用负离子模式和s r m 模式建立了橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷三种黄酮 类成分的定量分析方法。y u 等【4 1 】建立了灵敏可靠的h p l c e s i m s 方法对注射参 麦注射液后兔血浆中的化学成分进行分析，采用s i m 模式同时测定了人参皂苷 r g l 、人参皂苷r f , 人参皂苷r e 、人参皂苷r d 和人参皂苷r b l 五种成分的含量； l v 等【4 2 】建立了一种简单快速、灵敏准确的u p l c t o f m s 方法对大鼠灌服茵陈蒿 汤后尿液中的化学成分进行了研究，同时测定了大鼠尿液中滨蒿内酯、茵陈色原 酮、大黄酸、大黄素四种成分的含量。 l u 等【4 3 1 运用l c e s i m s 技术建立了同时定量测定大鼠血浆中小檗碱和巴马 亭的分析方法，并将该方法应用于大鼠灌服黄连解毒汤后，体内小檗碱和巴马亭 的药动学研究。x u 等【4 4 】建立了一种快速的l c e s i m s m s 分析方法同时测定大鼠 血浆中厚朴酚、和厚朴酚、大黄酸、大黄素和芦荟大黄素的含量，该方法灵敏、 准确而且重现性好，并已成功地应用于后大鼠灌服小剂量大承气汤后血浆中5 个 化合物的药代动力学研究。l i u 等【4 5 】也对大鼠灌服大承气汤后血浆中的化学成分进 行了研究，并建立同时定量测定了血浆中柚皮素和橙皮素的l c m s 分析方法，该 方法采用舒乐安定为内标，并用正离子模式和选择反应监测的模式对化合物进行 分析，经验证表明该方法能成功地应用于大鼠血浆中柚皮素和橙皮素的药代动力 学研究。 浙江大学硕上学位论文第一章绪论 1 4 本文主要研究内容 全面了解中药复方的化学组成情况，明确复方的化学物质基础，对于进一步 研究复方药效物质基础以及为提高制剂质量控制标准等方面都具有重要意义。本 文以脑得生片和胃复春片为研究对象，运用液质联用技术重点研究了中药复方制 剂的化学物质基础及入血成分等内容，各章节的内容具体安排如下： 第一章综述中药复方物质基础研究进展及液质联用技术在中药复方物质基 础研究中的应用，结合中药复方分析领域存在的问题，确定本论文的研究目标和 研究内容。 第二章主要运用h p l c e s i m s “技术研究中药复方制剂脑得生片的化学物质 基础，基本揭示复方的化学物质基础以及各化合物的药材来源归属情况，为提高 制剂质量标准提供化学依据，也为后续的体内研究奠定基础。 第三章依循中药血清化学的研究思路，以脑得生片为研究对象，研究建立 h p l c e s i m s “方法分析大鼠口服脑得生片后的入血成分。 第四章运用h p l c e s i m s n 及h p l c q t o f m s 联用技术研究中药复方制剂 胃复春片的化学物质基础，对各成分的药材来源情况进行归属并对化合物结构进 行解析鉴定。 第五章对本文所做的工作进行总结和展望。 浙江大学硕士学位论文第二章脑得生片化学物质基础研究 第二章脑得生片化学物质基础研究 2 1 前言 脑得生处方来源于黑龙江中医药大学著名老中医二十多年临床实践总结出来 的经验方。该方由三七、葛根、川芎、红花、山楂五味药组成，具有活血化瘀、 疏通经络、醒脑开窍的功效，用于瘀血阻络所致的眩晕、中风，脑动脉硬化、缺 血性中风及脑出血后遗症等【4 6 1 。目前市面上常见的该方制剂有脑得生片、脑得生 丸、脑得生胶囊、脑得生咀嚼片、脑得生注射液等。脑得生片于1 9 7 9 年正式投入 生产，并被收载于黑龙江省药品标准( 1 9 8 0 年版) ，1 9 9 5 年被收入中华人民 共和国药典，后又被2 0 0 0 版及2 0 0 5 版药典收载。 目前，人们对于脑得生片中各味药的化学成分都有较为深入的研究。从三七 中分离得到的单体皂苷成分，主要是达玛烷2 0 ( s ) 原人参二醇型和2 0 ( s ) 原人参三醇 型四环三萜皂苷，其中人参皂苷r g l ( g i n s e n o s i d er g o 和r b l ( g i n s e n o s i d er b l ) 含量最 高，除此之外，三七中还含有三七皂苷( n o t o g i n s e n o s i d e ) 成分；氨基酸类成分中 三七素( d e n c i c h i n e ) ，是三七的止血活性成分，含量高达o 9 ；另外还含有挥发性 成分和黄酮类成分等 4 7 - 4 9 】。葛根中含黄酮类成分，主要有葛根素( p u e r 撕n ) 、大豆 苷( d a i d z i n ) 等；还有异黄酮类成分及酚性化合物和氨基酸等【5 0 ，5 l 】。川芎的化学成分 主要为生物碱类，如川芎嗪( c h u a n x i o n g z i n e ) 、胆碱( c h o l i n e ) 等；有机酸类，如阿魏 酸( f e r u l i c a c i d ) 等；苯酞衍生物类，如藁本内( 1 i g u s t i l d e ) - 等 5 2 , 5 3 。红花的化学成分 研究很少，近代研究表明，红花中含有红花红素( c a r t h a m i n ) ，红花黄素( s a f f i o r y e l l o w ) ( 有红花黄素a 、红花黄素b 、红花黄素c 之分) ；红花中还有黄酮类成分， 如槲皮( q u e r c e t i n ) - 等i s 4 , 5 5 1 。山楂中主要含黄酮类成分，如金丝桃苷( h y p e r o s i d e ) 、 牡荆：素( v i t e x i n ) 等；有机酸类如山楂酸( c r a t a e g o l i ca c i d ) 等；还含有一些鞣质、微量 元素等【5 6 1 。 在现有的文献报道中，对脑得生片的研究多集中在其中某一个或某几个成分 的分析上 5 5 9 】，2 0 0 5 版药典中对于脑得生片的定性鉴别及含量测定也仅对葛根素 及人参皂苷r g 。进行了控制。从目前的研究来看，缺乏对脑得生片的化学物质基础 9 浙江大学硕七学位论文第二章脑得生片化学物质基础研究 的全面剖析和整体认识，单一指标的控制很难全面衡量复方制剂的质量。因此， 对脑得生片进行全面的化学物质基础分析显得尤为重要，这不仅为提高制剂质量 标准提供了化学依据，还能为后续的体内研究奠定基础。 本章选取中国吉林春光制药厂生产的脑得生片进行h p l c m s n 研究，通过与 对照品及药材的h p l c 保留时间及m s n 、p d a 数据对比，以及参考文献报道的质 谱数据，对脑得生片中的化学成分进行药材归属及结构鉴定，初步明确脑得生片 的化学物质基础。 2 2 实验部分 2 2 1 试剂与材料 试剂：乙腈、甲醇为色谱纯( m e r c k ，d a r m s t a d t ，g e r m a n y ) ，甲酸为色谱 纯( t e d i a 公司) ，h p l c 所用水通过m i l l i q 纯水机( m i l f o r d ，m a ，u s a ) 制备。 其余试剂均为分析纯。药材：脑得生片购自中国吉林春光制药厂，批号为2 0 0 8 0 2 0 2 。 三七、葛根、红花、川芎、山楂均购自杭州中药饮片厂( 浙江) ，各药材均由浙江 大学药学院吴斌老师鉴定。对照品：葛根素、大豆苷、三七皂苷r 。、人参皂苷r b l 、 人参皂苷r g l 、人参皂苷r c 、人参皂苷r e 、人参皂苷r d 、人参皂苷r b 2 购自中国 药品生物制品检定所( 北京) 。 2 2 2 样品制备方法 对照品溶液配制： 分别称取葛根素、大豆苷、三七皂苷r l 、人参皂苷r b l 、人参皂苷r g l 、人参 皂苷r c 、人参皂苷r e 、人参皂苷r d 、人参皂苷r b 2 适量，加入甲醇进行溶解。 对照药材溶液制备： 取三七、葛根、红花、山楂、川芎药材适量，干燥粉碎。各药材精密称取5 9 ， 分别加入5 0 m l 水进行回流提取。每次提取1 5 h ，共提取两次。将各自提取液进行 过滤，合并滤液，浓缩至干后分别用5 0 m l 水进行溶解。各药材提取溶液均以1 20 0 0 r p m 转速离心1 5 m i n ，上清液经0 4 5g m 滤膜过滤后供h p l c 分析。 1 0 浙江大学硕士学位论文 第二章脑得生片化学物质基础研究 供试品溶液制备： 取脑得生药片2 0 片，除去糖衣，研成细粉。精密称取l g 置于1 0 0 m l 具塞锥 形瓶中，准确加入5 0 甲醇水2 0 m l ，超声4 5 分钟。提取结束后将锥形瓶取出， 冷却后用5 0 甲醇水溶液3 1 、足重量。提取液摇匀后以1 20 0 0r p m 转速离心1 5 m i n ， 上清液经0 4 5 “m 滤膜滤过后供h p l c 分析。 2 2 3 仪器与分析方法 仪器：a g i l e n t l l 0 0 型高效液相色谱仪( 美国a g i l e n t 公司) ，配二元梯度泵、 d a d 紫外检测器、柱温箱、自动进样器；f i n n i g a nl c q d e c ax pp l u s 离子阱质 谱仪( 美国t h e r m o 公司) ，配电喷雾离子源及x c a l i b u r l 3 控制系统；m i l l i p o r e 超纯 水器( 美国m i l l i p o r e 公司) ；e p p e n d o r f m i n i s p a n 离心机( 德国e p p e n d o r f 公 ) ； m e t t l e ra l l 0 4 分析天平( 瑞士m e