前列地尔脂微球体注射液防治急性心肌梗塞再灌注后无复流的影响和机制研究李宪伦课件

药学部 施慧 前列地尔脂微球体注射液防治急性心肌梗塞 再灌注后无复流的影响和机制研究 李 宪 伦 杨鹏 王勇 柯元南 卫生部中日友好医院心内科 2009年10月 内 容 n研究背景 n研究目的和意义 n研究路线和方法 n实验结果和分析 n实验结论 n研究展望 研 究 背 景 随着再灌注治疗技术的成熟和普及 ，再灌注治疗已使AMI 患者30天的住院病死率从常规药物治疗时代的10下降至再灌 注时代的5左右。其可以挽救缺血心肌，缩小梗死面积，保 护心脏功能，极大改善AMI患者的预后。 临床中发现，再灌注治疗也产生了新的难题和困惑。即心 外膜冠状动脉再通(TIMI 3 級），心肌梗死范围仍有可能继续 扩大，并且心室扩张和重构、心力衰竭以及恶性心律失常等严 重并发症的发生率仍较高。 现 况 无复流现象的机制 无复流现象 血小板及纤维蛋白聚集 形成微血栓 NO释放减少、ET-1生成增加 造成微循环痉挛 炎症反应 例如：白细胞聚集 中性粒细胞激活 细胞因子激活 氧自由基释放 微循环再灌注损伤 前列地尔的药理作用 n前列地尔属于天然前列腺素( prostaglandin，PG) 类物质 ，是一种高效生物活性物质， 主要成份是11,15(S)-双 羟基-9-羰基-13-反前列烯酸； n前列地尔脂微球体注射液具有抑制血小板聚集、血栓素 A2生成、动脉粥样脂质斑块形成及免疫复合物的作用， 能扩张外周和冠脉血管； n能抑制血管平滑肌细胞的游离Ca2+，抑制交感神经末梢 释放去甲肾上腺素, 使血管平滑肌舒张，血管扩张； n目前，临床上前列地尔主要用于血栓性脉管炎、闭塞性 动脉硬化等症 。 研究目的和意义 n意义：无复流作为AMI再灌注后致死的重要原因之一 ，是再灌注治疗过程中的一个难题。降低无复流的 发生率，对改善急性心梗患者的预后具有重大的意 义。 n 目的：通过动物心肌梗塞再灌注模型，评估前列地尔 脂微球体注射液在防治无复流现象的作用，并探讨可能 的分子生物学机制。 研究路线和方法 实验流程 实验猪（2025kg） 对照组（8只） 假手术组（8只） 血流动力学检测 LVSP、LVEDP 等指标 球囊封堵LAD远端1/31/2处120min， 构建猪心梗模型，松开球囊再灌注3h 静滴 生理盐水 球囊置于LAD远端1/31/2处 5h Thioflavin-S 和Evans染色 心肌 分别于术前5min、AMI后120min 、再灌注60 min、120min、 180min 心肌声学造影 （MCE） 放射免疫检测血 清ET-1、IL-6、 TNF- 免疫组 织化学 检测 前列地尔组（8只） 静滴PGE1 微脂球载体 Western- blotting 再灌注180min Real-time PCR 实 验 材 料 n动物： 中华小型猪 体重223kg 购自中国农业大学 n药品： 前列地尔微脂球体注射液 购自北京泰德制药有限公司 优维显370 注射液 声学造影剂Sonovue 购自意大利博克莱公司 Thioflavin-S和Evans 购自Sigma公司 n仪器: Phlips V5000 血管造影机 Phlips iE33 心脏超声仪 实验一 前列地尔对猪急性心肌梗塞再灌 注后无复流现象的防治 实验结果和分析 u 血液动力学检测 l 前列地尔能够通过减少梗塞面积，改善心功能而升高LVSP、降低 LVEDP（P0.05），无复流区与危险心 肌面积比 具有显著统计学差异（*P0.05）， 无复流区与危险心肌面积比 具有显著统计学差异（*P0.05# P0.05） * * # * * * * # * # u 病理切片免疫组化染色 整合素-1（CD29）（200） 假手术组模型组正常区 模型组再灌区模型组无复流区 前列地尔组再灌区 前列地尔组无复流区 * * u 按照顺时针方向选择6个400视野，使 用软件IPP6.0对整合素-1（CD29）在各组各 区域阳性表达量进行定量测量和分析。各组 各区域阳性表达产物的平均光密度（即积分 光密度与所占面积的比值，IOD/Area）如图 所示。与模型组相比，前列地尔能够明显抑 制无复流区和再灌区整合素-1的蛋白表达（ *P0.05）。 # # 血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1（CD31）（200） 假手术组模型组正常区 模型组再灌区模型组无复流区 前列地尔组再灌区前列地尔组无复流区 * * u 按照顺时针方向选择6个400视野，使 用软件IPP6.0对血小板内皮细胞粘附分子 PECAM-1（CD31）在各组各区域阳性表达 量进行定量测量和分析。各组各区域阳性表 达产物的平均光密度（即积分光密度与所占 面积的比值，IOD/Area）如图。与模型组相 比，前列地尔能够明显抑制无复流区血小板 内皮细胞粘附分子CD31的蛋白表达（ *P0.05）。 # # 假手术组（400） u 病理切片HE染色 假手术组（200）模型组正常区（200） 模型组正常区（400） 模型组再灌区（200） 模型组再灌区（400）模型组无复流区（400） 模型组无复流区（200） 前列地尔组正常区（200）前列地尔组再灌区（200）前列地尔组无复流区（200） 前列地尔组正常区（400）前列地尔组再灌区（400）前列地尔组无复流区（400） u 各组HE染色切片按顺时针顺序随机选取6个400视野进行拍照，利用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件计数HE染色切片血管周围浸润的炎性细胞 ，其中淋巴细胞形态为小而圆，中性粒细胞内可见多型分叶核。较模型组 ，前列地尔能够明显抑制白细胞的浸润（*P0.05）。 * * # # 讨 论 IL-6 TNF- VCAM-1 PECAM-1P-selectin E-selectinIntegrin-1 n与模型组相比，前列地尔可以降低IL-6、TNF-等炎症反 应上游刺激因子的血清浓度。 n前列地尔通过抑制粘附分子（整合素-1、E-选择素、P- 选择素、VCAM-1）的mRNA表达以及整合素-1、PECAM-1的 蛋白表达，阻碍了白细胞与内皮细胞之间的粘附、聚集， 减轻了缺血再灌注对心肌微循环的损伤。 n与模型组相比，在降低整合素-1、E-选择素、P-选择素 、VCAM-1 mRNA的浓度上，前列地尔具有统计学显著差异（ P0.05# P0.05） * * * * # # * # * * # # 血小板衍化生长因子受体 PDGF-R（200） 假手术组模型组正常区 模型组再灌区 模型组无复流区 前列地尔组再灌区前列地尔组无复流区 u 按照顺时针方向选择6个400视野，使用软 件IPP6.0对血小板衍化生长因子受体（PDGF-R） 在各组各区域阳性表达量进行定量测量和分析。 各组各区域阳性表达产物的平均光密度（即积分 光密度与所占面积的比值，IOD/Area）如图所示 。与模型组相比，前列地尔能够明显抑制无复流 区和再灌区PDGF-R的蛋白表达（*P0.05 ）。 * * # 血管内皮生长因子（VEGF，200） 假手术组模型组正常区 模型组再灌区 模型组无复流区 * * 前列地尔组再灌区 前列地尔组无复流区 u 按照顺时针方向选择6个400视野，使用 软件IPP6.0对血管内皮生长因子受体（VEGF） 在各组各区域阳性表达量进行定量测量和分析 。各组各区域阳性表达产物的平均光密度（即 积分光密度与所占面积的比值，IOD/Area）如 图所示。与模型组相比，前列地尔能够明显促 进无复流区和再灌区VEGF的蛋白表达（ *P0.05 ）。 # * eNOS、VEGF的Western blotting 检测结果图 其中1、2、3分别为模型组的正常区、再灌区、无复流区，4、5、6分别为前列地尔组的正常区、再灌区、无复流区 u Western-blotting检测 VEGF 经过软件IPP6.0计算eNOS、VEGF与管家蛋白Elf的灰度比值。与模型组相比，前列地尔能促进 无复流区心肌组织一氧化氮合酶、血管生长因子的蛋白表达，并具有显著的统计学差异（*P0.05 ，*P0.01）。 * * * * * eNOS 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 讨 论 前列地尔 内皮细胞 降低血清内皮素ET-1， 舒张血管 促进 eNOS mRNA和蛋白表达， 产生NO，舒张血管 抑制 GM-CSF mRNA表 达，减少白细胞聚集 抑制 PDGF mRNA表达 和PDGF-R蛋白表达， 减少血小板聚集 促进 VEGF mRNA和蛋 白表达，修复内皮损伤 n前列地尔可以降低内皮素ET-1的血清浓度，提高内皮型一氧 化氮合酶eNOS的mRNA和蛋白质表达，起到扩张血管的作用， 改善心脏功能。 n前列地尔可以抑制血小板衍化生长因子（PDGF）及粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的mRNA表达及PDGF受体蛋 白表达，促进血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA和蛋白质表 达，改善微循环灌注。 n与模型组相比，前列地尔在促进血管内皮生长因子（VEGF） 及一氧化氮合酶（eNOS）的mRNA和蛋白质表达上具有统计学 差异（P0.05）。 实验结论 总 结 正常心肌微血管内状态 粘附分子 粘附分子 缺血/再灌时心肌微血管内状态 前列地尔 用药后心肌微血管内状态