第七章抗体工程制药课件

第七章 抗体工程制药 一.概述 抗体(工程)制药生物技术制药 领域的重要组成部分 n抗 原(antigen,Ag) -是指那些能够刺激和/或诱导机体免疫 系统发生免疫应答、产生抗体和/或致敏 （效应）淋巴细胞，同时又能与免疫应 答产物在体内外特异性结合，发生免疫 反应的物质。 如：病原微生物、免疫血清、药物、疫苗 n对机体来说，抗原相当于一个国家已知 的或潜在的、外部的或内部的“敌人” 。 4 n免疫原性：指能刺激机体产生抗体和/或致 敏淋巴细胞的性能。 n反应原性：能与相应的抗体和/或淋巴细胞 发生特异性结合，发生反应的性能。 5 n完全抗原：既具有免疫原性，又具有反应原性的抗原。 如微生物、异种血清 n半抗原：又称不完全抗原。是指其本身只有反应原性， 但没有免疫原性的简单小分子的抗原物质。如 某些药物（青霉素，等）、多糖、类脂。 6 目前，在中草药中发现广泛存在半抗原，如 小檗碱、茶碱、丹参酮等，具有生化活性 基因的化学成分都有可能成为半抗原，这 些半抗原可与体内蛋白质结合成完全抗原 ，造成一些过敏反应。 7 n抗原的特异性既表现在免疫原性上，也表现 在反应原性上。 沙门氏杆菌 大肠杆菌 抗大肠杆菌的抗体 抗沙门氏杆菌的抗体 结合结合 免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的结构 抗体：能与相应抗原特异性结合的具有 免疫功能的球蛋白。 抗体的产生过程 ： 机体免疫系统受抗原 物质刺激后，B淋巴 细胞被激活，增殖和 分化为浆细胞，由浆 细胞合成和分泌的球 蛋白。 免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子量范围 从150,000到950,000道尔顿。分五类：分五类： IgG在血清中含量最高，达7580%,是抗感染 的主要抗体; IgM是五类免疫球蛋白中分子量最大的，为 五聚体,是对一个抗原作出反应时产生的 第一个抗体第一个抗体； IgA在黏膜表面、乳腺、泪腺形成，主要参 与局部的免疫反应; IgD在血清中含量很低; IgE在血清含量最少。 免疫球蛋白免疫球蛋白 IgGIgG IgMIgM IgAIgAIgDIgDIgEIgE 动物血清中产生抗体的时间示意图 抗原刺激的第一至三周，IgM生成；抗原再 刺激后， Ig将取代IgM 抗体研究的发展阶段： 以1890年Behring发现白喉抗毒素白喉抗毒素为代表,用 抗原免疫动物来获得多克隆抗体。 以1975年Milstein 2.免疫动物 小鼠(Balb/C,鼠龄6-8周)或 大鼠 (Lou); 3.常用的骨髓瘤细胞系 SP2/0，P3.653细 胞，都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT)的缺乏株。 4.免疫方法: 体外免疫法；体内免疫法 n体内免疫法 - 颗粒性抗原(如细菌、细胞 )的免疫原性强,可不加佐剂,可溶性抗原则按 每只小鼠10-100ug抗原与弗氏完全佐剂等量混 合后注入腹腔内. 弗氏完全佐剂（Freunds complete adjuvant,FCA）: 由矿物油（如降脂烷或液 体石蜡等）、乳化剂和灭活的分枝杆菌组成的 乳化佐剂。 弗氏不完全佐剂不含分枝杆菌 免疫佐剂（adjuvant ) （1）定义：先于抗原或同时与抗原混合注射机体 可增强抗原的免疫原性的物质。 （2）应用 弱免疫原性物质； 免疫原剂量不足。 （3）佐剂种类 1)油性乳剂弗氏佐剂（Freund adjuvant） 2)无机化合物 3)微生物及其产物 4)脂质体 5)细胞因子 二.细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 1.细胞融合的基本方法(PEG促融) 脾细胞 骨髓瘤细胞(“永久”细胞) (1108) (23107) 聚乙二醇(PEG) 37-40 2mins 融合细胞（杂交瘤细胞） 用作细胞融合剂的聚乙二醇(PEG)一般选用MW4000，常 用浓度为50，pH8.0pH8.2 。可加入二甲基亚砜 (DMSO)。 2002年12月神舟4号飞船搭载B淋巴细胞和 骨髓瘤细胞升空进行细胞融合实验 原理： 细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞 融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细 胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此 要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细 胞死亡的环境。这就要利用杂种细胞和亲本 细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行 选择。其中最常用的是HAT选择系统。 2、杂交瘤细胞的选择性培养 n常用的选择培养基为HAT培养基。 次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A能阻断DNA合成) 、 胸腺嘧啶(T)。 n脾细胞具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT),因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞可利用 HGPRT酶,用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)合成 DNA,使杂交瘤细胞得以生长。 HAT选择培养机制 主要途径 糖 氨基酸 氨甲喋呤（A） 次黄嘌呤(H) GMP 核苷酸 DNA HGPRT 核苷酸前体 TK(胸苷激酶) 胸腺嘧啶核苷(T) dTMP HAT培养基： H 为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为 DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料 ） A 可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP 合成受抑制） T 在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸 腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料 n含有饲养细胞的24/96孔板内悬浮培养，23 天换液一次(HAT的培养液7天内),第714天改 用HT培养液（对照阻的骨髓瘤细胞已死亡） 14天以后用普通的RPMI1640完全培养液。 n常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细 胞和胸腺细胞等。 n89天可对所有克隆生长孔的培养上清进行抗 体检测,筛选出产生抗体的阳性克隆. 培 养 板 B细胞杂交瘤的技术流程 三.筛选阳性克隆与克隆化 1.筛选方法： 免疫酶技术 放射免疫技术 免疫荧光技术 （1）免疫酶技术 n原理：将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化 反应相结合的技术。酶与抗体或抗原结合后 ，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异 性，也不影响酶本身的酶学活性，在相应而 合适的作用底物参与下，使基质水解而呈色 ，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧 化型，从而表明某种抗原或抗体的存在。 （2）免疫荧光技术 原理： 将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示 踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物， 与已知的抗体（或抗原）结合，然后将荧光 素标记的抗体或抗原作为标准试剂，用于检 测和鉴定抗原或抗体。 免疫荧光技术用于细胞抗原的抗体检测,特 别是检测患者活检组织标本。 （3）放射免疫技术 n原理：将同位素分析的高灵敏度与抗原 抗体反应的特异性相结合，以放射性同 位素作为示踪物的标记免疫测定方法。 n放射免疫测定原理示意图 2.克隆化 为提高筛选出来的阳性克隆的稳定性， 将单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集 团的整个培养过程。 n有限稀释法：通过一系列稀释，使每个细胞 培养孔平均只含一个细胞，而分离细胞 n软琼脂法：将杂交瘤细胞悬液分散在半固体 营养琼脂糖上，使呈单个细胞定位生长繁殖， 以达到克隆化的目的。 四.杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 1. 杂交瘤细胞借助染色体分析鉴定 多数为端着丝粒染色体,染色体数目 接近两种亲本细胞染色体之和。 2. 抗体鉴定 Ig类和亚类鉴定：免疫扩散或 ELISA法 亲和力鉴定 抗体类别鉴定（Ig类和亚类鉴定） 抗体分子因有大小、带电量、溶解度及其 与抗原的作用不同，可分为不同的类和亚类。 IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4） IgA（IgA1、IgA2） IgM（无） IgD （无） IgE （无） 1）免疫扩散 n指可溶性抗原与相应抗体在液相中特异结合后 ，形成的免疫复合物受电解质影响出现的沉淀 线现象。 单向免疫扩散 双向免疫扩散 （2）酶联免疫吸附法(ELISA) n原理：先将抗体或抗原包被到某种固相载体表 面，再将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步 骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应 ，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的 未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物 被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小 进行定性或定量分析的方法。 ELISA ELISA 五.单克隆抗体的工业化生产 单克隆抗体的生产包括细胞培养、 提纯和制剂等工艺过程。 1.杂交瘤细胞的大规模培养 n生物反应器：气升式发酵罐，中空纤维培养 罐，微囊发酵罐 n培养基：牛淋巴液，血清 2.单克隆抗体的大量制备的方法 n体外培养法 (收获10-400ug/ml抗体) 酶标板上培养 微载体悬浮培养（固体颗粒用DEAE-Sephadex A50等材料）。 n动物体内诱生法 用0.5ml降脂烷/液体石蜡 注入腹腔,然后注射1106杂交瘤细胞，再 收获52Omg/ml抗体。 支原体污染！ 3.单克隆抗体(McAb)的纯化 纯化单克隆抗体流程(大鼠) 单抗纯化方法: 超滤法 盐析法 离子交换法 凝胶过滤法 HPLC法等 三.单克隆抗体药物的现状 n250多种抗体类药物在临床试验中 1/3已进入三期临床 1/4已通过临床III期试验 n美国市场上有13种治疗用的抗体药物 n抗体药物的销售额 97-99年由4.68亿美元增长到13亿美元 03年抗体类药物总销售额达到50亿美元 抗体药物市场销售额 2011 全球有超过200家上市或未上市公司正在研发 用于临床诊断和治疗的单克隆抗体 正在进行临床试验的抗体公司（38家）： Abgenix Alexion Pharm Altarex Applied Molecular Evolution BASF Biogen BioTransplant CAT(Cambridge Ab Tech) Celltech Centeon Centocor (Johnson ; 在具备亲本单抗可变区的在具备亲本单抗可变区的cDNAcDNA克隆时，可克隆时，可 用用定点突变法定点突变法在其两端造成适当的内切酶位在其两端造成适当的内切酶位 点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组 装到表达载体中装到表达载体中; ; 如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用 PCRPCR方法方法扩增可变区基因，再组装到适当的表扩增可变区基因，再组装到适当的表 达载体上。达载体上。 单链抗体最常用的表达体系是单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，大肠杆菌，有有2 2种种 方式方式: : 一是表达为一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量。产量 高，可达细菌蛋白总量的高，可达细菌蛋白总量的5%-20%5%-20%，但需进行变性，但需进行变性 复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性; ; 二是二是分泌型表达分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链，将细菌的信号肽序列与单链 抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质 周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子 。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升 细菌的产量仅在数毫克左右细菌的产量仅在数毫克左右。 即为即为VHVH，约为完整分子的，约为完整分子的1/121/12。它只。它只 由一个结构域构成，故称由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体。单域单域 抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原 单抗的特异性。单抗的特异性。 (3)单域抗体 VHVH 约为完整分子的约为完整分子的1/80-1/701/80-1/70大小，一大小，一 般由一个般由一个CDRCDR构成，它也保持着抗体的特构成，它也保持着抗体的特 异性。异性。 (4)最小识别单位 CDRCDR 4 4 双特异抗体和多价抗体双特异抗体和多价抗体 双链抗体双链抗体 （DiabodyDiabody）一词最早由）一词最早由HollingerHollinger等等 于于19931993年提出。乃是一种小分子的双价双特异性抗年提出。乃是一种小分子的双价双特异性抗 体片段。体片段。 双特异性抗体双特异性抗体(bispecific (bispecific antibody,BSAb)antibody,BSAb)是指能同时识别是指能同时识别2 2种抗原的种抗原的 抗体。抗体。1 1种为对应肿瘤相关抗原。另种为对应肿瘤相关抗原。另1 1种为种为 对应效应成分。对应效应成分。 即能即能结合靶肿瘤细胞结合靶肿瘤细胞又能又能结合高细胞结合高细胞 毒性的效应细胞毒性的效应细胞, ,将效应细胞富集在肿瘤周将效应细胞富集在肿瘤周 围围, ,而且可以模拟天然配体的作用而且可以模拟天然配体的作用, ,与细胞与细胞 表面引发分子结合表面引发分子结合, ,激活效应细胞激活效应细胞, ,实现对实现对 肿瘤细胞的杀伤和裂解。肿瘤细胞的杀伤和裂解。 抗体的一部分被非抗体序列替代，所形抗体的一部分被非抗体序列替代，所形 成的融合蛋白具有新的特性成的融合蛋白具有新的特性, ,称之为抗体称之为抗体 融合蛋白。融合蛋白。 根据构建方式，抗体融合蛋白主要分两种形式根据构建方式，抗体融合蛋白主要分两种形式 ： Fc Fc融合蛋白融合蛋白（Fc fusion protein,FcFPFc fusion protein,FcFP） 抗原结合融合蛋白抗原结合融合蛋白（antigen-Binding antigen-Binding fusion protein,ABFP fusion protein,ABFP） 抗体融合蛋白抗体融合蛋白 FcFc融合蛋白融合蛋白 由抗体的由抗体的Fc Fc 段与某些具有特定功能的段与某些具有特定功能的 蛋白结构域融合而成。如蛋白结构域融合而成。如CD4CD4免疫粘附素（免疫粘附素（ immunoadhesinimmunoadhesin）就是由抗体的就是由抗体的FcFc段与段与2 2个个 CD4CD4分子的分子的IgIg同源区重组而成。同源区重组而成。 抗原结合融合蛋白抗原结合融合蛋白 由具有抗原结合功能的抗体结构与其他由具有抗原结合功能的抗体结构与其他 功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体部功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体部 分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。 抗体融合蛋白抗体融合蛋白 一、免疫粘附素一、免疫粘附素 定义定义 将人抗体恒定区将人抗体恒定区( (主要是主要是FcFc段段) )N-N-端连接于端连接于 人细胞表面的受体分子或细胞粘附分子上，在人细胞表面的受体分子或细胞粘附分子上，在 真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分 子，这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其子，这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其 它相应的效应功能，这种分子被称为它相应的效应功能，这种分子被称为免疫粘附免疫粘附 素素( (immunoadhension)immunoadhension)或或新效能抗体新效能抗体。 二、免疫毒素二、免疫毒素 免疫毒素又称生物导弹，是由导向免疫毒素又称生物导弹，是由导向 性的载体分子与具有毒性的弹头蛋白交性的载体分子与具有毒性的弹头蛋白交 联而制成，属于导向药物的一种。联而制成，属于导向药物的一种。 三、催化抗体三、催化抗体 天然抗体体现的是结合活性，而酶天然抗体体现的是结合活性，而酶 发挥的是催化活性。如何把这两者的特发挥的是催化活性。如何把这两者的特 点集为一体，从而使抗体也能成为具有点集为一体，从而使抗体也能成为具有 催化活性的物质，同时也能使酶与有关催化活性的物质，同时也能使酶与有关 的抗原结合。即的抗原结合。即催化抗体催化抗体( (catalytic catalytic antibody)antibody)催化抗体的构建主要是把具催化抗体的构建主要是把具 有有催化作用的基团与抗体分子进行重组催化作用的基团与抗体分子进行重组 。 噬菌体抗体 噬菌体抗体库噬菌体抗体库( (phage antibody phage antibody library)library)技术技术定义：定义： 通过通过PCRPCR将全套人抗体重链和轻链将全套人抗体重链和轻链V V 区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达 、分泌，经筛选后获得特异性抗体。、分泌，经筛选后获得特异性抗体。 噬菌体表面展示文库技术的要点噬菌体表面展示文库技术的要点: : 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外 壳蛋白壳蛋白N N端端 将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3g3 或或g8 g8 的先导系列的紧靠下游的先导系列的紧靠下游 随机克隆入相应载体形成组合文库随机克隆入相应载体形成组合文库 从免疫或未被免疫的从免疫或未被免疫的B B细胞中细胞中PCRPCR扩增抗体全套基因片段扩增抗体全套基因片段 用固相化抗原经用固相化抗原经“ “亲和结合一洗脱一扩增亲和结合一洗脱一扩增” ”数个循环数个循环 直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、 亲和力强的抗体噬菌体库。亲和力强的抗体噬菌体库。 使翻译出的抗体分泌到细菌的周使翻译出的抗体分泌到细菌的周质质腔内，形成游腔内，形成游 离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。 筛选到的噬菌体再将基因筛选到的噬菌体再将基因g3g3或或g8g8切除后，转入大切除后，转入大 肠杆菌，肠杆菌， 该项技术的优点该项技术的优点: : 将将抗体的基因型和表型紧密联系抗体的基因型和表型紧密联系起来起来; ; 可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; ; 抗体基因筛选的范围广抗体基因筛选的范围广; ; 技术稳定、可靠、生产周期短技术稳定、可靠、生产周期短; ;可规模化生产可规模化生产; ; 适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它 蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。 不经过细胞融合及动物免疫等步骤 不经过细胞融合及动物免疫等步骤 噬菌体抗体库的分类噬菌体抗体库的分类 （一）按抗体基因的性质分（一）按抗体基因的性质分 1. 1. DNADNA文库文库 2. 2. cDNAcDNA文库文库 （二）按抗体基因的来源分（二）按抗体基因的来源分 1 1天然抗体库天然抗体库( (native native antibody antibody library)library) 2 2免疫抗体库免疫抗体库 3 3半合成抗体库半合成抗体库 4 4全合成抗体库全合成抗体库 用SCID小鼠制备人单抗 SCID小鼠 移植入人淋巴细胞 （人鼠嵌合模型） 抗原免疫 杂交瘤技术 基因工程 人单抗 人抗体鼠将小鼠Ig基因灭活，然 后转入人Ig基因，生产出人单抗 遗传工程鼠 基因工程抗体真核细胞高效表达流程图 单抗研发的演变历程 鼠单抗 100% 鼠源 OKT-3 Panorex Zevalin 鼠/人崁合单抗 (66-75 % 人源) ReoPro, Rituxan Remicade Simulect 人源化单抗 (90-95 % 人源) Zenapax, Mylotarg, Herceptin, Campath Synagis 100% 人源 抗体在体外人源化存在的问题 n操作过程复杂 n需付出昂贵的代价 n抗体的亲和力降低 n抗体不是人体免疫系统天然产生 n异源抗体与免疫系统的配合 最理想的单克隆抗体 n100%人源 n人类免疫系统自然产生 全人抗体的理论基础 n癌症细胞、病毒、细菌对人机体而言均为 异己物 n人体不断受异己物攻击，但免疫系统通常 有清除能力 n免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异己 物做出反应 n体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体 全人抗体面临的关键问题 n持续分泌抗体的人 B细胞 n抗体分泌细胞的保持 30年来的全人抗体的尝试 n鼠骨髓瘤不适合与人B细胞融合 -稳定性差 -抗体产量低 n非洲淋巴细胞瘤病毒 (EBV) 保存抗体分 泌细胞 -细胞株不稳定 -抗体的产量低 -不能特异性地保存抗体分泌细胞 n很难获得人类骨髓瘤细胞株 全人抗体技术的最新突破 成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体的研究进 入新的里程 n用途：能稳定的保持人B细胞分泌抗体的能力 n发明人：英国剑桥大学的Dr.Karpas教授 n意义： 1 在整体水平上研究人类产生的抗体 2 开创人类抗体基因组学的研究 n评价： 诺贝尔奖得主Dr.Milstein 推荐发表 在PNAS，世界权威杂志“科学”发表了 新闻评述，剑桥大学开了新闻发布会 人人杂交瘤技术 n开发针对未知抗原的全人治疗用抗 体的唯一技术 n分离、保存稳定分泌天然抗体的B细 胞先进方法。 n寻找新型肿瘤相关抗原的捷径 人人杂交瘤技术的优势 （1）迅速高效的生产天然人类单克隆抗体 抗原选定和抗体产生都由人类免疫系统完成， 不会引起自身免疫反应，与人体免疫系统配合 良好 能获得最佳亲和力和中和活性的抗体 更合理的自然选择药物设计方式 加速抗原的发现和抗体的开发过程 人人杂交瘤技术的优势