环境温度变化及LPS、ConA共刺激大鼠致脾脏免疫功能变化的形态学研究.pdf

a b s t r a c t d i s t r i b u t i o ni nt h ep e r i a r t e r i a ll y m p h o i ds h e a t ha n dl y m p hn o d u l e s ，w h i c hw e r em o s t s e r i o u si nt h e 一12 。cg r o u p w h e nc o m p a r e dw i t ht h en o r m a lc o n t r o lg r o u p ，t h i n n e r s p l e n i cp e r i a r t e r i a ll y m p h a t i cs h e a t ha p p e a r e di nt h eg r o u p so fl p s c o na s t i m u l a t i o na l o n e ；i n c r e a s e dl y m p h o i dn o d u l e sa n dc l e a rg e r m i n a lc e n t e r sr i c hi nc e l l s a p p e a r e di nt h eg r o u po fl p ss t i m u l a t i o na l o n e ；r e d u c e dl y m p h o i dn o d u l e sa n dc e l l n u m b e ra p p e a r e di nt h eg r o u po fc o na s t i m u l a t i o na l o n e w h e nt h et e m p e r a t u r e c h a n g e di nc o m b i n a t i o nw i t hl p ss t i m u l a t i o n ，g e r m i n a lc e n t e r sw e r ef r e q u e n t l vs e e n b u tf e w e rt h a nw h e nt e m p e r a t u r ec h a n g e da l o n e ，a n dt h ep e r i a r t e r i a l l y m p h a t i c s h e a t h sw e r es i g n i f i c a n t l yt h i n n e r , t h ec e l l d e n s i t yi nw h i c hw a ss p a r s e w h e n t e m p e r a t u r ec h a n g e di nc o m b i n a t i o nw i t hc o nas t i m u l a t i o n ，t h e p e r i a r t e r i a l l y m p h a t i cs h e a t h sw e r es l i g h t l yt h i n n e ra n dt h ec e l ld e n s i t yi nl y m p h o i dn o d u l e sw a s s p a r s e 2 i nt h en o r m a l t e m p e r a t u r ec o n t r o lg r o u p ，t h ec e l l sw i t h i nd e r i a r t e r i a l l y m p h a t i cs h e a t h sw e r em a i n l yc d 3 + a n dc d 8 + tc e l l sa n dt h ec e l l sw i t h i ni y i n p h o i d n o d u l e sw e r em a i n l yc d 2 0 十bc e l l si nt h er a ts p l e e n t h e s e c e l lt y p e sw e r es c a t t e r e d w i t h i nt h em a r g i n a lz o n ea n dr e d p u l p 3 c o m p a r e dw i t ht h en o r m a lt e m p e r a t u r ec o n t r o lg r o u p ，t h en u m b e rd e n s i t i e so f c d 3 + a n dc d 8 + t l y m p h o c y t e sw e r el o w e ri nt h eg r o u p so ft e m p e r a t u r es t i m u l a t i o n a 】o n e w h e r e a st h o s eo fc d 2 0 + bc e l l sw e r e h i g h e r 4 c o m p a r e dw i t ht h en o r m a lc o n t r o lg r o u p ，t h en u m b e rd e n s i t i e so fc d 3 + a n d c d 8 + tc e l l sw e r el o w e ri nt h eg r o u p so fl p s c o na s t i m u l a t i o na l o n e ，w h i l et h o s e o fc d 2 0 + bc e l l sw e r e h i g h e r 5 t h en u m b e rd e n s i t i e so fc d 3 十，c d 8 + tl y m p h o c y t e si nt h et e m p e r a t u r e c h a n g e + l p s c o nas t i m u l a t i o ng r o u p sw e r el o w e rt h a j lt h o s ei nt h en o m l a l t e m p e r a t u r e + l p s c o nas t i m u l a t i o ng r o u p s ，w h i l et h o s eo fc d 2 0 + bc e l l sw e r e h i g h e r 6 t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e so n l y m p h o c y t e sd i f f e r e di nv a r y i n g d e g r e e s c d 3 + a n dc d 8 + tc e l l sd e c r e a s e dd u et oh i g ho rl o wt e r n p e r a t u r e ，w i t ht h e 1 m p a c to fl o wt e m p e r a t u r em o r es i g n i f i c a n t c d 2 0 + bc e l l si n c r e a s e dd u et oh i g ho r l o wt e m p e r a t u r e ，w i t ht h ei m p a c tm o s t s i g n i f i c a n ti nt h e4 g r o u p c o n c l u s i o n s ：1 b o t has u d d e n d r o pa n das u d d e ne l e v a t i o ni na m b i e n t i v a b s t r a c t t e m p e r a t u r ec a nr e s u l ti np a t h o l o g i c a lc h a n g e si nt h es p l e e n ：t h i n n e rp e r i a r t e r i a l l y m p h a t i cs h e a t h s ，r e d u c e dg e r m i n a lc e n t e r s ，a n dr e d u c e dl y m p h o i dn o d u l e s 2 b o t has u d d e nd r o pa n das u d d e ne l e v a t i o ni na m b i e n t t e m p e r a t u r ec a r ll e a dt o c h a n g e si nt h en u m b e ro fs p l e e nl y m p h o c y t e s ，i n c l u d i n gc e l l m e d i a t e di m m u n i t y s u p p r e s s i o ns u c ha sar e d u c t i o no fc d 3 + a n dc d 8 + tc e l l sa n de n h a n c e dh u m o r a l i m m u n i t ys u c ha sa ni n c r e a s eo fc d 2 0 + bc e l l s 3 w h e nt h ea m b i e n tt e m p e r a t u r eh a sac h a n g ei nc o m b i n a t i o nw i t hl p s c o na s t i m u l a t i o n ，af u r t h e rr e d u c t i o ni nt h en u m b e rd e n s i t i e so fc d 3 + a n dc d 8 + tc e l l s a n daf u r t h e ri n c r e a s ei nt h en u m b e rd e n s i t yo fc d 2 0 + bc e l l si n s p l e e nt i s s u e a p p e a r s ，t h a ti s ，t h ec e l l m e d i a t e di m m u n i t yi sf u r t h e rs u p p r e s s e da n dt h eh u m o r a l i m m u n i t yi sf u r t h e re n h a n c e d c o na h a sas t r o n g e ri n h i b i t o r ye f f e c to nc e l l m e d i a t e d i m m u n i t yw h i l el p sh a sas t r o n g e rp r o m o t i v ee f f e c to nh u m o r a li m m u n i t y k e y w o r d s ：a m b i e n tt e m p e r a t u r e c h a n g e ；s p l e e n ；l y m p h o c y t e ；s t e r e o l o g i c a l m e a s u r e m e n t ；r a t v 目录 目录 第1 章前言1 第2 章材料与方法一3 2 1 材料3 2 1 1 实验动物一3 2 1 2 主要设备一3 2 1 3 主要试剂一3 2 2 实验方法4 2 2 1 实验模型建立与分组一4 2 2 2 组织病理学检查一5 2 2 3 免疫组织化学检测一5 2 2 4 体视学测量6 2 2 5 统计学处理一7 第3 章结果8 3 1 组织病理学变化8 3 2 免疫组织化学检测9 3 3 体视学测量1 0 3 3 1 各组大鼠脾脏淋巴细胞的数密度1 0 3 3 2 各时间点大鼠脾脏淋巴细胞的数密度1 8 第4 章讨论2 1 4 1 极端环境温度变化时大鼠脾脏的形态学变化2 1 4 2 极端环境温度变化时大鼠脾脏淋巴细胞的变化2 2 4 3 展望2 6 第5 章结论2 7 致谢2 8 参考文献3 0 附图3 3 综j 签3 6 v i 英文缩写 e d t a d a b n v h s p 7 0 p h a c o n a l p s s i r s m o d s h p a s n s g c 英文缩写与中英文对照 英文全称 中文全称 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 d i a m i n o b e n z i d i n e 二氨基联苯胺 n u m e r i c a l d e n s i t y 数密度 h e a ts h o c kp r o t e i n 7 0 热休克蛋白7 0 p h y t o h a e m a g g l u t i n i n 植物血凝素 c o n c a n a v a l i na 刀豆蛋白a 1 i p o p o l y s a c c h a r i d 磷脂多糖 s y s t e m i c i n f l a m m a t o r y 全身炎症反应综合 r e s p o n s es y n d r o m e m u l t i p l e 征多器官功能障 o r g a nd y s f u n c t i o ns y n d r o m e 碍综合症 h y ? 。h a l a m i c 。? i ? a r y a d r e n 引下丘脑一垂体一肾上腺 a x i s s y m p a m e t l c n e r v o u s s y s t e m 皮质轴 s y m p a t h e t i cn e r v o u ss y s t e m 交感神经系统 g l u c o c o r t i c o i d 糖皮质激素 v i i 。誉4 j 羹毫? 囊参 ：j ：0 0 。、”j 4 ， _ ：= ) _ 矗j i 篓意，。0 j i ! 霉? ：- 誓? j i *一 。，。、：。 0 二”： ，o o 分、 1 0 ，磐蛀_ ； 一，饔，：骥，囊：一 ：| 萋t 第1 章前言 第1 章前言 近年来，“极端气候”一词己引起全球科学家的密切关注和热烈讨论。由于 经济的发展和工业的进步，温室气体大量排放，引发温室效应，极端气候随之 频频出现，并导致种种自然灾害，对人类生存和发展带来了严重影响【1 1 。自从 1 9 9 2 年联合国气候框架公约诞生以来，数次全球性会议通过、签署并发布 了多项如c y , 都议定书等国际气候环境保护文件、协议及声明，尤其是进入 2 1 世纪后，多次世界气候大会的召开，也充分说明了极端气候带来了全球性 的问题和挑战，解决温室效应问题刻不容缓 2 1 。 极端气候指气候的强烈改变，最常见于温度、湿度环境的剧烈变化。 强烈变化的气候因素则与人类健康密切相关。温度骤然升高降低使机体处 于应激的状态，交感神经系统兴奋，引发一系列神经内分泌反应并且进一 步导致机体抵抗力下降，各系统各器官功能异常，进而引发各种疾病，如 心脑血管疾病、呼吸消化系统疾病等，更有甚者出现死亡病例【3 j 。究其原因， 是极端气候环境作为刺激因素使机体发生应激反应，免疫系统功能失调或者损 伤，免疫功能下降，从而导致疾病的发生。 应激，是指机体在受到各种因素刺激时所出现的非特异性全身反应，是机 体对外界的一种适应性反应，通常具有一定程度的自身调节能力。但当刺激因 素作用过强或持续时间过长，超过了机体自身的调节范围，就会引起神经内分 泌、免疫系统等多系统的功能紊乱或导致免疫器官损伤。国内外相关研究已经 证实，应激能够影响动物和人的免疫功能【4 5 j 。温度骤变作为刺激机体产生应激 反应的应激原，会显著影响机体的免疫功能。 从可查阅的文献中可知，冷应激对机体免疫系统的影响，涉及到下丘脑一 垂体一肾上腺皮质轴系统和交感一肾上腺髓质系统，以及细胞因子、肽类物质 和激素的共同调节作用怕j 。冷应激下，肾上腺素能神经元被激活，交感神经的 活动也加强，机体的神经一内分泌系统和免疫功能之间产生联系，构建了一个 完整的调节网络，肾上腺皮质束状带的糖皮质激素合成加速，从而发挥糖皮质 激素的免疫抑制作用。然而不同的研究中冷应激对与免疫系统的影响，意见尚 不能完全统一。大部分观点认为冷应激对免疫系统功能的影响主要是抑制作用 第1 章前言 【1 7 1 。 热应激对机体免疫功能影响，目前认为长期或慢性热应激对机体免疫功能 具有一定抑制作用。k h a j a v i 等( 2 0 0 3 ) 在其研究中发现，不同品种肉仔鸡在长 期热暴露的第2 1 d 署h 4 2 d ，其血液c d 4 + 、c d 8 + t 细胞均显著下降【8 j 。s u t h e r l a n d 等 ( 2 0 0 6 ) 利用植物血凝素( p h a ) 、刀豆蛋白( c o n a ) 、磷脂多糖( l p s ) 分别刺 激经历了长期热应激生长猪的外周血淋巴细胞，结果发现淋巴细胞转化率均有 不同程度的下降【绷，提示慢性热应激时，机体的免疫功能，尤其是细胞免疫功 能处于紊乱状态【1 0 。不同的研究者在各自对热应激与脾脏关系的研究中都发现 脾脏指数降低，并指出热应激对淋巴细胞的发育和分化有一定的损伤作用，从 而导致免疫功能降低。而对于短期或急性热应激对机体免疫功能造成的影响， 报道罕见。 l p s ( 内毒素) 是一种脂质与多糖的复合物，是革兰氏阴性菌细胞壁的主 要成分，可以在没有其他细胞辅助下直接刺激成熟b 淋巴细胞的增殖和分化并 产生抗体】。此外，大量实验也证明，l p s 可以诱导t 抑制性细胞的生成，从 而对免疫功能产生抑制作用。 c o n a ( 刀豆球蛋白a 1 是一种球蛋白，具有细胞凝集和促进有丝分裂的作 用，具有促进t 淋巴细胞增殖转化作用。其对机体免疫功能的影响，主要为诱 导抑制性t 细胞的生成，从而抑制免疫功能【l2 1 。对于c o n a 诱导的淋巴细胞转 化反应以细胞学研究多见，而对脾脏组织形态学改变的研究罕见。 尽管目前国内外在极端气候对机体影响的研究方面取得了不少成绩，但对 极端气候影响机体免疫功能的研究却不够深入和全面。我们通过建立冷、热应 激模型，并用l p s 和c o n a 共刺激，深入研究其脾脏形态学和脾脏淋巴细胞各 亚群数量的变化，探讨不同环境温度下机体免疫功能变化的规律，为极端气候 下疾病防治提供理论依据。 第2 章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 实验动物 第2 章材料与方法 s d 大鼠 上海市西普尔一必凯实验动物有限公司，s i p p r b k 、许可证号码： s c x k ( 沪) 2 0 0 8 0 0 16 ，合格证编号：2 0 0 8 0 0 1 6 0 0 4 9 5 ，9 1 5 周龄 ( 2 6 3 2 9 9 4 3 2 0 9 ) ，购入实验室前为s p f 级环境生活 ，雄性，1 4 4 只。清洁 级环境饲养，正常饮用南昌生自来水，食料为江西省动物中心购买，大鼠笼垫 料为小杉树刨花皮。 2 1 2 主要设备 r x z 一0 4 5 0 气候箱 d g g 一9 2 4 0 a 型电热恒温鼓风干燥箱 d k 一4 5 0 b 型电热恒温水槽 y s 2 4 e d 型不锈钢压力锅 m a 一1 8 7 0 m 1 型微波炉 海尔冰箱b c d - 2 0 5 t f o l y m p u sb x 一4 1 型双目光学显微镜 8 f 1 5 6 5 9 型o l y m p u sm i c r o p u b li s h e r 2 1 3 5 型病理切片机 刀片l e i c a 8 1 9 2 1 3 主要试剂 兔抗大鼠c d 3 多克隆抗体 小鼠抗大鼠c d 8 单克隆抗体 山羊抗大鼠c d 2 0 单克隆抗体 宁波东南仪器有限公司 上海森信实验仪器有限公司 上海森信实验仪器有限公司 浙江苏泊尔股份有限公司 青岛海尔股份有限公司 青岛海尔股份有限公司 日本o l y m p u s 公司 日本o l y m p u s 公司 德国l e ic a 公司 德国l e ic a 公司 武汉博士德公司( e 0 3 1 1 8 8 ) e b i o s c i e n c e 公司( e 0 3 4 8 9 1 2 9 0 ) s a n tc r u zb i o t e c h n o l o g y ( s c 7 7 3 5 ) 第2 章材料与方法 兔二步法试剂盒 小鼠二步法试剂盒 山羊超敏二步法检测试剂盒 d a b 显色剂试剂盒 s u p e rp a pp e n p b s 磷酸盐缓冲液( p h 7 2 7 4 ) 柠檬酸盐缓冲液 e d t a 抗原修复液( p h 9 0 ) 3 h 。0 ：去离子水 多聚赖氨酸 抗体稀释液 细菌脂多糖( l p s ) 刀豆素一a ( c o n a ) 2 2 实验方法 2 2 1 实验模型建立与分组 北京中杉公司( p v 一6 0 0 1 ) 北京中杉公司( p v 一6 0 0 2 ) 北京中杉公司( p v 一9 0 0 3 ) 北京中杉公司( z l i 9 0 3 2 ) 北京中杉公司( z l i 一9 3 0 5 ) 北京中杉公司( z l i 9 0 6 1 ) 北京中杉公司( z l i 一9 0 6 4 ) 北京中杉公司( 11 0 2 11 ) 北京中杉公司( z l i 9 3 1 1 ) 北京中杉公司( z l i 一9 0 0 5 ) 北京中杉公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 将1 4 4 只体重2 6 3 2 9 9 + 4 3 2 0 9 的9 1 5 周龄雄性大鼠根据温度和是否同 时加有l p s 或c o n a 刺激，按随机数字表法均分为1 2 组，每组1 2 只大鼠。每组均 设4 个时间点进行观察，每点3 只大鼠 各组动物处理过程如下： 常温( 2 0 ) 对照组：在江西省人民医院动物实验中心无特定病原体( s p f ) 级动物房适应性饲养l 周，温度2 0 。c ，湿度6 0 ，每1 2 h 交替照明，自由饮水。 常温l p s 刺激组：常温饲养1 周，给予腹腔注射l p s ( 1 m g k g ) 体重，再 放入温度2 0 。c 、湿度6 0 的条件气候箱饲养，分别于各时间点处死动物取材。 常温c o n a 刺激组：常温饲养1 周，给予腹腔注射c o n a ( 5 m g k g ) 体重，再 放入温度2 0 。c 、湿度6 0 的条件气候箱饲养，分别于各时间点处死动物取材。 4 。c 低温刺激组：常温饲养1 周，再放入温度4 。c 、湿度6 0 的条件气候箱 饲养，分别于各时间点处死动物取材。 4 第2 章材料与方法 4 。c l p s 刺激组：常温饲养1 周，给予腹腔注射l p s ( 1 m g k g ) 体重，再放 入温度4 “ c 、湿度6 0 的条件气候箱饲养，分别于各时间点处死动物取材。 4 。c c o n a 刺激组：常温饲养l 周，给予腹腔注射c o n a ( 5 m g & g ) 体重，再放 入温度4 。c 、湿度6 0 的条件气候箱饲养，分别于各时间点处死动物取材。 一1 2 低温刺激组：常温饲养1 周，再放入温度- 1 2 。c 、湿度6 0 的条件气 候箱饲养，分别于各时间点处死动物取材。 一1 2 l p s 刺激组：常温饲养1 周，给予腹腔注射l p s ( 1 m g k g ) 体重，再 放入温度一1 2 。c 、湿度6 0 的条件气候箱饲养，分别于各时间点处死动物取材。 一1 2 。c c o n a 刺激组：常温饲养1 周，给予腹腔注射c o n a ( 5 m g k g ) 体重，再 放入温度一1 2 、湿度6 0 的条件气候箱饲养，分别于各时间点处死动物取材。 3 7 。c 高温刺激组：常温饲养1 周，再放入温度3 7 、湿度6 0 的条件气候 箱饲养，分别于各时间点处死动物取材。 3 7 l p s 刺激组：常温饲养1 周，给予腹腔注射l p s ( 1 m g k g ) 体重，再 放入温度3 7 、湿度6 0 的条件气候箱饲养，分别于各时间点处死动物取材。 3 7 o c c o n a 刺激组：常温饲养l 周，给予腹腔注射c o n a ( 5 m g k g ) 体重，再 放入温度3 7 、湿度6 0 的条件气候箱饲养，分别于各时间点处死动物取材。 2 2 2 组织病理学检查 开腹取出脾脏，于脾脏中段取组织1 块，厚约为4 “ - - , 5 m m ，以4 多聚甲醛液 4 。c 环境中固定2 4 h ，经梯度酒精脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，5um 厚切片， 采用苏木素一伊红染色，脱水、透明、封片后显微镜下观察。 2 2 3 免疫组织化学检测 选择p v 一6 0 0 1 ( c d 3 ) p v 一6 0 0 2 ( c d 8 ) p v 一9 0 0 3 ( c d 2 0 ) 二步法( 北京中杉公 司) 分别检测c d 3 、c d 8 、c d 2 0 的表达。常规石蜡包埋脾脏组织，切3t am 石蜡切 片，一抗分别为兔抗大鼠c d 3 多克隆抗体、小鼠抗大鼠c d 8 单克隆抗体和山羊 抗大鼠c d 2 0 单克隆抗体( c d 3 稀释为1 ：10 0 ；c d 8 、c d 2 0 均稀释为1 ：2 0 0 ) ， 按p v 二步法说明书步骤操作，d a b 显色，以p b s 替代一抗作阴性对照。具体步 骤如下： 切片6 0 烤1 h ，常规脱蜡和水化后以p b s 冲洗3 次，5 m i n 次，蒸馏水 第2 章材料与方法 洗3 次，2 m i n 次； 一抗加c d 3 、c d 2 0 抗体的玻片以柠檬酸盐缓冲液进行抗原热修复，微波 炉加热( 高火1 0 分钟、中火1 0 分钟，中途加液) ，自然冷却至室温； 一抗加c d 8 抗体的玻片以e d t a 抗原修复液( p h9 0 ) 进行抗原高压热修 复，高压锅加热，稳定喷气后计时3 分钟，自然冷却至室温； 蒸馏水洗3 次，2 m i n 次，p b s 洗3 次，5 m i n 次，p a p 笔划圈，3 h ：0 ：去 离子水孵育5 m i n ，以阻断内源性过氧化物酶； p b s 冲洗3 次，5 m i n 次，相应切片分别滴加兔抗大鼠c d 3 多克隆抗体和 山羊抗大鼠c d 2 0 单克隆抗体，置湿盒内3 7 。c 水浴箱孵育1 h ，以p b s 替代一抗 作阴性对照，p b s 冲洗3 次，5 m i n 次；相应切片滴加小鼠抗大鼠c d 8 单克隆抗 体，置湿盒内4 。c 冰箱孵育2 4 h ，以p b s 替代一抗作阴性对照，3 7 复温4 5 m i n 后，p b s 冲洗3 次，5 m i n 次； 已加一抗为c d 3 、c d 8 的玻片分别滴加相应二抗，3 7 。c 孵育3 0 m i n ；已加 一抗为c d 2 0 + 的玻片加二抗a 液，3 7 孵育1 0 m i n 后，p b s 冲洗3 次，5 m i n 次， 加二抗b 液，3 7 。c 孵育1 0 m i n ； p b s 冲洗3 次，5 m i n 次，d a b 显色3 m i n ，自来水充分冲洗1 5 m i n ； 苏木素衬染1 5 s 、经蓝化后脱水、透明、中性树胶封片； 光镜下观察。 2 2 4 体视学测量 在o l y m p u sb x - 4 1 型双目光学显微镜的高倍镜( i 0x4 0 ) 下，每张切片随 机测试2 0 个视野，以h m i a s 2 0 0 0 图像分析系统拍照。采用方网测试系统( 总 测试点为1 2 1 个，测试点间距为2 3 4 3um ，小方格面积为5 4 9 0 4um 2 ，总测试 面积6 6 4 3 3 8 4um 2 ) 。以c d 3 、c d 8 和c d 2 0 阳性细胞为测试目标，以脾脏为包 容空间，对落在测试目标上的测点数( p x ) 、落在包容空间的测点数( p c ) 、包 容空间中测试目标的截面数( n x ) 进行计数。按下列体视学公式分别计算出脾 脏中c d 3 、c d 8 和c d 2 0 阳性细胞的数密度( n u m e r i c a ld e n s i t y ，n v ) 。 第2 章材料与方法 m = 三 术口2 p c z ix 2 k 为尺寸分布系数，取值1 s 为形状参数，取值1 5 5 q 为每个测试点所代表的面积 n x 为包容空间内测试目标的截面数 p x 分别为落在测试目标( c d 3 、c d 8 和c d 2 0 ) 上的测点数 p c 为包容空间( 脾组织) 内的测试点数 2 2 5 统计学处理 按体视学要求的公式计算出各参数的均数标准差( x s ) ，屑统计软件 s p s s1 7 0 进行统计分析。各组间参数比较用单因素方差分析，各时间点参数 比较采用t 检验，p 3 7 。c 高温刺激组 一1 2 低温 刺激组。 第3 章结果 3 3 1 3 单纯( 2 0 。c ) l p s 、c o n a 刺激组大鼠脾脏淋巴细胞的数密度 数 密 度 q 罨 厶 百 j 图2 2 0 。c 各组大鼠脾脏淋巴细胞的数密度( 1 0um 1 ) 2 0 。cl p s c o n a 刺激组与正常对照组比较，a p 0 0 5 ) 。2 0 l p s 刺激组、2 0 。c c o n a 刺激组c d 8 + t 细 胞的数密度均明显低于常温对照组( p 0 0 5 ) 。其 数值为2 0 l p s 刺激组 2 0o c c o n a 刺激组。 1 2 第3 章结果 3 3 1 44 。c 各刺激组大鼠脾脏淋巴细胞的数密度 数 密 度 ，、 兰 o t a 莹 j 图3 4 v 各刺激组大鼠脾脏淋巴细胞的数密度( 1 0um 。3 ) 4 vl p s c o n a 刺激组与4 v 低温刺激组比较，p o 0 5 ) 。 4 。c l p s 刺激组和4 。c c o n a 刺激组c d 2 0 + b 细胞的数密度均高于4 低温刺激组 ( p 4 。c c o n a 刺激组。 第3 章结果 3 3 1 5 1 2 。c 各刺激组大鼠脾脏淋巴细胞的数密度 数 密 度 ，_ 、 三 9 邑 _ 夕 一1 2 。cl p s c o n a 刺激组与一1 2 。c 低温刺激组比较，p o 0 5 ) 。一1 2 。c c o n a 刺激组c d 8 + t 细胞的数密度低于 一1 2 低温刺激组和一1 2 l p s 刺激组( p 0 0 5 ) 。一1 2 。c l p s 刺激组、一1 2 。c c o n a 刺激组 两组c d 2 0 + b 细胞的数密度与一1 2 低温刺激组比较，无统计学差异( p 0 0 5 ) 。 1 4 第3 章结果 3 3 1 6 3 7 。c 各刺激组大鼠脾脏淋巴细胞的数密度 数 密 度 、 兰 c ： o 窜 夕 3 5 3 1 -t士 2 5 - i - j _ - i - 丁t 2 t 1 口3 7 口3 7 + l p s 1 5 口3 7 + c o n a t l - f - 士 j 二 j - i 0 5卜 n c d 3c d 8c d 2 0 图5 3 7 。c 各刺激组大鼠脾脏淋巴细胞的数密度( 1 0um 。：3 ) 3 7 。cl p s c o n a 刺激组与3 7 。c 高温刺激组比较，p 0 0 5 ) 。3 7 l p s 刺激组、3 7o c c o n a 刺激组两组 c d 8 + t 细胞的数密度均低于3 7 高温刺激组( p 3 7 高温刺激组 3 7o c c o n a 刺激组。 第3 章结果 3 1 7 温度变化+ l p s 刺激组大鼠脾脏淋巴细胞的数密度 数 密 度 ，_ 、 兰 c ： f 营 j 图6 温度变化+ l p s 刺激各组大鼠脾脏淋巴细胞的数密度( x1 0 um 。) 各温度l p s 刺激组与常温l p s 刺激组比较，p 3 7 。c l p s 刺激 组 一1 2 l p s 刺激组。 1 6 第3 章结果 3 3 1 8 温度变化+ c o n a 刺激组大鼠脾脏淋巴细胞的数密度 数 密 度 、 兰 9 ；4 暑 。夕 图7 温度变化+ c o n a 刺激各组大鼠脾脏淋巴细胞的数密度( i 0um 。：3 ) 各温度c o n a 刺激组与常温c o n a 刺激组比较，o p 3 7o c c o n a 刺激组 一1 2 c o n a 刺激组。 第3 章结果 3 3 2 各时间点大鼠脾脏淋巴细胞的数密度 3 3 2 1 各时间点大鼠脾脏c d 3 + t 淋巴细胞的数密度 数 密 度 、 兰 c = “ i r a 4 暑。 夕 图8 各组各时间点大鼠脾脏c d 3 + t 淋巴细胞的数密度( 1 0um3 ) 从图8 可以看出，常温对照组c d 3 + t 淋巴细胞数密度不随时间变化出现明 显波动，而各刺激组则随时间延长数密度明显下降，各组各时间点与0 h 比较， p 0 0 5 ，无统计学意义； 2 0 。c c o n a 刺激组c d 8 + t 淋巴细胞数密度随时间延长，逐渐下降，然而各时间点 与0 h ( 正常对照点) 比较，无统计学意义( p 0 0 5 ) ；而其余各组，随着时间延 长，各时间点数密度值都逐渐下降，各组各时间点与0 h 比较，p 0 0 5 ，无统计学意义；2 0 c o n a 刺激组c d 2 0 + b 淋巴细胞数密度随时间延长， 出现轻微上下波动，1 h 、8 h 和2 4 h 时间点数据与o h ( 正常对照点) 比较，无统计 学意义( p 0 0 5 ) ；而其余各组，随着时间延长，各时间点数密度值都逐渐上升， 各组各时问点与0 h 比较，p - - j 生活已近尾声。值 此论文完成之际，请让我以最诚挚的感谢献给曾给予我指导、关心和帮助的老 师、同学和亲人们! 首先衷心感谢敬爱的导师朱清仙教授这三年来对我的严格要求和悉心培 养。从课题的选择、设计，实验实施直至论文的写作、修改，朱老师都倾注了 大量的心血。导师渊博的专业知识、开阔的科研思路、严谨的治学态度都让我 受益匪浅，推动我在科研的道路上不断前行；也感谢导师和师母在生活上给予 的关心和帮助，不仅授我以文，而且教我做人，让我逐渐成长成熟起来。能在 他们的帮助下完成学业我感到非常幸运。我一定要以优异的成绩回报导师对我 的付出和期待，并将在朱老师这里感受到和学习到的严谨、认真和细致的科研 治学作风，热情忘我的工作态度投入到今后的学习和工作中去。在此，我谨向 敬爱的导师致以最诚挚的谢意! 衷心感谢我的第二导师，南昌大学基础医学院病理学教研室主任，熊小亮 副教授对我的培养。在他的指导与帮助下，我逐步提高了读片阅片能力，具备 了初步的病理诊断能力，培养了严谨的病理诊断思维，为今后从事病理诊断工 作打下了坚实的基础。 衷心感谢曾慧红副教授在我研究生学 - - j 期间给予我悉心的指导和无微不至 的关怀! 衷心感谢江西省人民医院中心实验室胡国柱教授在实验中提供的帮助! 衷心感谢南昌市第一医院病理科周建洪主任医师及各位老师在我病理实习 期间提供的指导! 衷心感谢组胚教研室和病理教研室的各位老师对我的培养! 衷心感谢师姐彭胜男、吴芳庚、傅珏、朱淑琴，师妹傅爱香、张昕昕，师 弟孔令超等人的热情帮助! 衷心感谢柳万江、孔繁君、李冬宏、邵佳、谢鑫、马忠校等同学的热情帮 助! 致谢 在学习期间，还要感谢研究生处的各位领导、老师的支持和帮助，在此， 表示由衷的感谢! 感谢“十一五”国家科技支撑计划项目极端气候条件下疾病发生规律及 防控对策( 编号：2 0 0 8 b a i6 8 8 0 1 ) 的经费支持! 此外还要感谢我的家人，这几年来予以我学业的全力支持! 庄德葆 2 0 1 2 年6 月 参考文献 参考文献 1 刘吉峰，丁裕国，江志红等全球变暖加剧对极端气候概率影响的初步探讨 j 高原气 象，2 0 0 7 ，2 6 ( 4 ) ：8 3 7 - 8 4 2 2 r a m a n a t h a nv ，x uy t h ec o p e n h a g e na c c o r df o rl i m i t i n gg l o b a lw a r m i n g ：c r i t e r i a ， c o n s t r a i n t s ，a n da v a i l a b l ea v e n u e s j p r o cn a t la c a ds c iusa 2 0 1 0 ；1 0 7 ( 1 8 ) ：8 0 5 5 6 2 3 杨明，李庆芬哺乳动物冷应激的主要神经内分泌反应 j 动物学研究，2 0 0 2 ，2 3 ( 4 ) ：3 3 5 3 4 0 4 】l a w r e n c ed a k i mdc e n t r a l p e r i p h e r a ln e r v o u ss y s t e ma n di m m u n er e s p o n s e s j t o x i c o l o g y , 2 0 0 0 ，14 2 ( 3 ) ：18 9 - 2 01 5 】s t a r k i er l h a r g r e a v e sm r o l l a n dj h e a ts t r e s s ，c y t o k i n e s ，a n dt h ei m m u n er e s p o n s et o e x e r c i s e j b r a i nb e h a vi m m u n ，2 0 0 5 ，1 9 ( 5 ) ：4 0 4 4 1 2 6 w a n gj w ，x us w e f f e c t so fc o l ds t r e s so nt h em e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i dl e v e l so f c o r t i c o t r o p h i n - r e l e a s i n gh o r m o n ea n dt h y r o t r o p i n r e l e a s i n gh o r m o n ei nh y p o t h a l a m io f b r o i l e r s j p o u l ts c i ，2 0 0 8 ，8 7 ：9 7 3 9 7 8 【7 】s a l a k - j o h n s o n 儿，m c g l o n ej j m a k i n gs e n s eo fa p p a r e n t l yc o n f l i c t i n gd a t a ：s t r e s sa n d i m m u n i t yi ns w i n e a n dc a t t l e j a m e r i c a ns o c i e t yo f a n i m a ls c i e n c e ，2 0 0 7 ，8 5 ：8 1 - 8 8 8 k h a j a v im ，r a h i m is , h a s s a nzm ，e ta 1 e f f e c to ff e e dr e s t r i c t i o ne a r l yi nl i f eo nh u m o r