泛发性脓疱型银屑病与hladqb1等位基因的相关性研究课件

中华医生网收集编目 / 泛发性脓疱型银屑病与泛发性脓疱型银屑病与HLA-DQBHLA-DQB1 1 等位基因的相关性研究等位基因的相关性研究 研究生研究生 付洪军付洪军 导导 师师 张福仁张福仁 中华医生网收集编目 / 前前 言言 q 定义与分型 v在最近新版的Rook教科书中，泛发性脓疱 型银屑病(GPP)被定义为银屑病的一种不寻 常变型，并以急性、亚急性、偶而慢性的 损害上发生无菌性脓疱为中心特征。 中华医生网收集编目 / q 依据临床表现把GPP分为5个亚型。即 ： v (1)急性泛发型(Von Zumbusch型) v (2)妊娠期GPP(IP) v (3)儿童型GPP v (4)环型GPP v (5)局限型GPP(不包括手足) 中华医生网收集编目 / q对这种分类中的IP仍有争议: 不支持观点：病史、诱因、某些化验室 检查、处理等不同。 支持观点：病理表现相似、妊娠可诱发 GPP、都具有HLA-B27 抗原。 中华医生网收集编目 / q寻常型银屑病(PSV)与 GPP的关系可概括为 : v临床表现的包容性，即：二者皮损可共存 、转化。 v免疫异常的相似形，即：二者皮损处都有 CD4+ 、CD8+T细胞的浸润, IL-6、IL-8高水 平表达,白细胞聚集形成微脓肿。 v遗传背景的明显差异性(后述)。 中华医生网收集编目 / q两种临床异质、遗传异质 GPP 亚型: v有PsV病史的GPP与无PsV病史的GPP。 vPsV阳性GPP发病年龄偏晚，诱发因素常是 先前的糖皮质激素治疗或不规则撤退。 v PsV阴性GPP发病年龄偏早，诱发因素多 为上呼吸道感染 。 v遗传异质性后述。 中华医生网收集编目 / qHLA复合系统 vHLA位与人6P21.31上,全长3600Kb,只占整个人 类基因组的1/3000,是人类基因组中最复杂的 遗传系统。 v目前已鉴定出224个基因座位,128个有功能性 产物表达,其中39.8%基因产物直接参与免疫应 答及调节。因而HLA系统多与免疫性疾病有关 。 v与疾病关联最密切的一区域，现已肯定50多种 疾病与HLA基因明显关联，即 HLA复合体与疾 病关联程度超过人类基因组任何一个区域。 中华医生网收集编目 / vHLA-DQB1位于HLA-II类基因DQ亚区，目前已 鉴定的DQB1等位基因达25个，对应的血清特 异性抗原只有9种，即25个等位基因编码的 抗原只有9种特异性。 vDQB1与DQA1分别编码DQ分子的链和链。 已发现DQB1等位基因与多种疾病关联。最典 型的例子是与IDDM的关联。如果DQ链第 57位氨基酸是D，则对IDDM呈抗性；若为D 以外的其它氨基酸，则表现为易感性。 中华医生网收集编目 / q研究HLA与疾病相关，实质上是研究疾病 发生发展的遗传倾向，因而属于病因学 研究。 q研究方法通常有关联分析和连锁分析。 中华医生网收集编目 / v关联分析是比较来自同一群体中无亲缘关 系的患病个体与非患病个体(对照)在某一 遗传标记位点(marker locus)上的特定等 位基因(如HLA等位基因)与疾病性状的相关 程度。一般通过患病人群和健康人群作HLA 分型后，用统计学方法(通常用2-tesf) 进行判别，故属于病例对照研究，又称 群体相关研究（population association studies）。 中华医生网收集编目 / v若发现标记位点的特定等位基因频率在患 病组与对照组之间有显著性差异，则表明 该特定等位基因与所研究的疾病性状相关 联，提示标记位点可能含有一个疾病易感 基因或与易感基因紧密连锁。关联程度通 过计算相对危险度(relative risk,RR)来 估计。 中华医生网收集编目 / q关联分析结果的判定 v发现某种HLA等位基因或抗原与某种疾病关 联(有统计学意义)并不意味着携带该基因 就一定患病，关联结果有两种可能的解释 。 v一种可能：关联成分与疾病易感性有关(原 发关联)。 v另一种可能：关联成分与疾病易感性无关 ，而仅仅是遗传标记，但由于该基因位点 存在与HLA连锁不平衡的其他未知基因，可 能也造成机体对疾病易感。 中华医生网收集编目 / v如HLA-DQB1*0405在IDDM发病中起关作 用，但此基因又与HLA-DRB1*0901及 HLA-B*4601呈连锁不平衡，使人误认 为HLA-DRB1*0901或HLA-B*4601与疾病 关联，实际上只有HLA-DQB1*0405属于 该病的原发关联成分，其它2个等位基 因属于次级关联。 中华医生网收集编目 / q关联分析的实际意义 v关联分析可提示相关位点或特定的等位基 因的传递方式及效应性质。如正相关，促 发病；负相关，保护不发病。并可由亚型 分析发现其遗传异质性(如I型与II型银屑病 )。 v 关联分析虽只能将致病基因粗略地定位于 某个位置，却能为以后的基因精确定位、 克隆等研究提供重要依据和线索。 中华医生网收集编目 / qHLA的分型技术 v 血清学方法：只能检测HLA基因产 物即HLA抗原宽特异性，不能检测 HLA基因本身的多态性。 v 细胞学方法：由于分型细胞来源困 难，且只能检少数HLA-DW、HLA-DPW 抗原，现已基本不用。 中华医生网收集编目 / v分子生物学技术：即DNA水平的HLA分型 技术。可检出HLA多态性，可识别同一位 点的不同等位基因，随着PCR技术方法的改 进和发展，其精度和分辨水平越来越细， 有助于深入研究HLA基因的结构和功能。 v常用的方法：包括PCR-RFLP(限制性片段 长度多态性)、PCR-SSO(序列特异寡核苷酸 探针)、PCR-SSP(序列特异性引物)及PCR- SBT(序列直接分型)等。 中华医生网收集编目 / vPCR-SSP基本原理：PCR反应的特异性取决 于扩增引物与模板DNA的精确匹配。应用 SSP引物使HLA分型特异性转化为由PCR反 应特异性来决定，因为SSP引物序列与特异 性等位基因的核苷酸序列完全匹配，只要控 制好PCR反应条件，就使每对SSP仅能扩增 某一特异性HLA等位基因，扩增产物通过琼 脂糖电泳或荧光检测，便可测定其特异性， 从而达到对HLA等位基因分型的目的；同时 反应体系中加入了参照引物，扩增HLA区域 内一段保守序列，又可避免假阴性结果。 中华医生网收集编目 / vHLA与银屑病的相关性研究 vRussell(1972)首次报道了HLA-B17与 银屑病明显相关。 v银屑病与HLA的相关已明确，即至少有 一个银屑病基因位于HLA位点或在附近 。 v比较一致的意见认为:PsV与HLA-A1、 B13、B17、Cw6、DR7等相关。 中华医生网收集编目 / vI型银屑病(40岁以前发病)主要表达HLA- Cw6、HLA-B57、HLA-DR7； vII型银屑病(40岁以后发病)则高度表达HLA -Cw2。 v最近翟宁等发现HLA-DQB1*0602与东北汉人 PsV关。刘涛峰等则发现皖汉人PsV与HLA- DQA1*0201明显相关。 中华医生网收集编目 / v Dausset等(1977)首次报道了GPP与HLA- A13、B17、B27相关后， v Karvonen和 Zachariae等 随后证实HLA-B27 与GPP强相关，与PsV不相关；从而首次揭 示了PsV与GPP的遗传背景具有差异性。 中华医生网收集编目 / v Ocklawaha等（1996）对日本541例GPP的 流行病学研究发现： v GPP与HLA-A2、B14、B35有弱相关； v PsV阳性的GPP与 HLA-A1、B37、DRw10显 著相关；PsV阴性的GPP不与它们相关， v 从而首次揭示PsV阳性的GPP与PsV阴性的 GPP 具有遗传异质性。 中华医生网收集编目 / vOzawa等则首次从DNA水平上研究发现 HLA-DQB1*0303与PsV阴性的GPP显著相关 。 v进一步验证了PsV阳性的 GPP与PsV阴性的 GPP 的遗传异质性。 v我国只有宋芳吉报道北方汉族GPP患者与 HLA-B13显著相关， v国内尚未有HLA-II基因与GPP相关的研究 文献。 中华医生网收集编目 / 目 的 本文采用PCR-SSP技术，对山东籍汉人 GPP患者和健康对照进行HLA-DQB1等 位基因分型研究，目的在于 ： 中华医生网收集编目 / 1)探讨山东汉人GPP与HLA-DQB1等位基因的 相关性。从而从DNA水平上探讨GPP可能的 发病机制。 2) 获得山东汉人对GPP易感或保护的相关基因 。 3)验证PsV阳性GPP与PsV阴性GPP遗传异质性 ；以及探讨GPP各临床类型的遗传背景是否 具有差 异性，从而为临床分型提供依据。 4) 长远目的为研究中国汉人与GPP相关性提供 一 些遗传学数据。 中华医生网收集编目 / 材料与方法材料与方法 q实验仪器与材料 DNA扩增仪 稳压电泳仪 紫外线分析仪 台式高速离心机 旋涡混合器 移液器(2l，20l，200l各一个) 序列特异性引物（SSP） PCR反应 Buffer TaqDNA聚合酶 中华医生网收集编目 / q实验对象 v病例资料：38例GPP均来自1990年以来， 曾在我院住院治疗(包括多次住院)并确 诊的GPP患者和近2年来门诊新发现并 确诊的GPP患者，所有患者均为山东 籍汉族人，性别、年龄不限。 v对照资料：94例全部来自山东中医药大学 ，山东籍汉族大学生及教职工自愿健康献 血员，彼此间无血缘关系，个体及家族中 无 银屑病及其病史。 中华医生网收集编目 / q标本收集：病例及对照每人均采取周 围静脉全血2ml，置于含有ACD 0.5ml 塑料试管里，稍混匀加盖后，-80超 低温冰箱保存。 qDNA抽提：应用上海生工提供的抽提试 剂盒。 中华医生网收集编目 / q PCR反应体系：每个PCR反应体系为25l。其 中含有10PCR Buffer 2.5ml；0.4 mol特 异性引物；0.2 mol内对照引物；200 mol的dNTP；1.5 mmol MgCl2；1 u Tag DNA 酶；2l 模板DNA。 qPCR反应参数：第一步94预变性5 min。第 二步94 变性30 s55-60退火50 s72延伸30s32个循环。第3步72延伸 5min。第4步4保存2 h。 中华医生网收集编目 / q读取及判断结果：每条泳道内必须出 现阳性对照带(796 bp)，在其前方对应欲 检测等位基因大小的位置出现明亮的带时 判为阳性；如果未出现阳性对照带，视为 PCR反应不成功,需重新扩增。电泳图象 ，见图-1，-2，-3，-4， 中华医生网收集编目 / M DQB1*0603、 0201、 0602 200bp 100bp 中华医生网收集编目 / M DQBM DQB 1 1 *0501*0501、 06020602 AC/GPP 无PsV史及家族史 200bp 100bp 中华医生网收集编目 / M DQB M DQB 1 1 *0602*0602、 03030303 成人GPP 有关节型银屑病史 200bp 100bp 中华医生网收集编目 / M DQB1*0603、0201 儿童GPP PsV、家族史阳性 200bp 100bp 中华医生网收集编目 / q统计学处理 v采用2检验：对患者组与对照组的HLA- DQB1等位基因逐一进行关联分析。应用 SPSS 10.0软件包，把相关数据输入计算机计 算出相关参数2、P和RR值。 v校正Pc(P correction)由Bonferrn法计算， 即PC = P所检测的等位基因数。 v以PC0.05作为显著性检验水准。 中华医生网收集编目 / v等位基因频率(Allelic frenquency,AF)依 据Hardy-Weinberg平衡定律，由公式 AF=1-(1-antigen frequency )1/2计算，其中 antigen frequency为检测阳性数占检测总 数的百分数。 中华医生网收集编目 / 结结 果果 q临床情况 v一般情况：病例组38例，男26例，女12例 。发病年龄最小2月，最大72岁，平均29岁 ；其中12岁以下发病的儿童8例。病程最短 21天，最长30年。PsV病史阳性18例(包括1 例关节型银屑病)，PsV病史阴性20例。有 PsV家族史9例。对照组94例，男59例，女 36例，平均年龄21岁。 中华医生网收集编目 / v临床类型：Von Zumbusch型27 例；LGPP 6 例；妊娠期GPP 3例；AC/GPP 2例； 8例 儿童均为 Von Zumbush型。 v9例做病理检查，表现为角化不全，表皮内 中性粒细胞移入，角层下棘层上部Kogoj微 脓肿，棘层不同程度的肥厚；真皮浅层血 管扩张，周围淋巴细胞、中性粒细胞浸润 。 中华医生网收集编目 / q 实验结果， 见： 表1 表2 表3 表4 中华医生网收集编目 / 表1 GPP患者与对照组 HLA-DQB1等位基因频率分布比较 等位 基因 患 者 组 对 照 组 n=38 n=94 2 P PC RR 频数 频率 频数 频率 DQB1*0602 11 0.157 10 0.055 DQB1*0603 11 0.157 7 0.038 DQB1*0604 1 0.013 23 0.131 DQB1*0201 15 0.222 7 0.038 6.78 0.009 0.117 3.42 10.6 0.001 0.013 5.06 8.674 0.003 0.039 0.08 19.98 0.0004 0.005 8.10 中华医生网收集编目 / HLA- DQB1 等位基 因 PsV阳性 GPP(n=18)对照组(n=94) 2 P PC RR 频数 频率频数 频率 DQB1*0602 3 0.087 10 0.055 0.11 0.436 5.668 1.68 DQB1*0603 9 0.292 7 0.038 19.00 0.0004 0.005 12.42 DQB1*0201 13 0.472 7 0.038 38.91 0.0004 0.005 32.31 表2 PsV阳性GPP与对照组 基因频率分布比较 中华医生网收集编目 / 表3 PsV阴性GPP与对照组 基因频率分布比较 HLA- DQB1 等位基因 PsV阴性 GPP(n=20) 对照组 (n=94) 2 P PC RR 频数 频率频数 频率 DQB1*0602 8 0.225 10 0.055 8.60 0.003 0.039 5.60 DQB1*0603 2 0.051 7 0.038 0.00 0.657 8.541 1.38 DQB1*0201 2 0.051 7 0.038 0.00 0.657 8.541 1.38 中华医生网收集编目 / HLA- DQB1 等位基因 PsV阳性 GPP(n=20) PsV阴性 GPP(n=20) 2 P PC RR 频数 频率频数 频率 DQB1*0602 3 0.087 8 0.225 1.50 0.160 2.08 0.30 DQB1*0603 9 0.292 2 0.051 7.37 0.007 0.091 9.00 DQB1*0201 13 0.472 2 0.051 15.35 0.0004 0.005 23.40 表4 PsV 阳性GPP与PsV 阴性GPP基因频率比较 中华医生网收集编目 / 讨讨 论论 q本实验结果显示 vHLA-DQB1*0201、0603的频率在患者中显 著升高，与对照组比较均有显著性差异 (RR=8.10，PC0.01；RR=5.06，PC0.05) 。 v表明携带DQB1*0201、0603这两个等位基 因的山东汉族人群患GPP的风险性高于其 他人群。 中华医生网收集编目 / 进一步分析： vDQB1*0201、0603多呈杂合态表 达(9/15，9/11)。 v而对照组无一例表达。 v表明杂合体(0201/0603)患GPP的 风险性最高。 中华医生网收集编目 / vHLA-DQB1*0602的频率患者组较对照组也明 显升高(RR=3.42，P=0.009)，但校正后无 统计学差异(PC=0.117)。 v本研究认为扩大样本量后，可能会出现阳 性关联。 v依据是：DQB1*0201、0603、0602这3个等 位基因编码的DQ分子有共同的结构。 中华医生网收集编目 / v如：Khandnja发现，96%抗dsDNA抗体阳性 的SLE患者携带DQB1*0201或DQB1*0602， v随后他发现这2个基因编码的DQ链第14位 aa都是甲硫氨酸，第26位都是亮氨酸，而 其它DQB1等位基因在这2个位置的氨基酸差 异较大。 v提示这2个基因编码的抗原分子含有与致病 肽结合的共表位。 中华医生网收集编目 / vHjelmstrom研究发现DQB1*0201、0603与MG 强相关。 v他采用同源模型技术构建出这2个等位基因 编码的DQ2和DQ6分子结构。 v提出了P7和P9 2个共同的可能的易感肽链 结合区。 中华医生网收集编目 / v本实验对3份DQB1*0201阳性的扩增DNA测序 结果： v3份扩增DNA碱基序列在第30位都由正常的T 变为G。在第45位，2份由T变为G，1份由A 变为C。与人类基因库提供的氨基酸序列比 对，本实验在第21-23位的氨基酸序列与正 常比较差异较大。 v我们还不敢判定这些碱基和氨基酸的异常 与GPP关系有多大，但至少带给我们一点启 示。 中华医生网收集编目 / v本实验显示，患者组中DQB1*0604的频率明 显低于对照组(RR=0.08，PC0.05)，表明携 带DQB1*0604的山东汉人患GPP的风险性较 小。 v国外研究表明，携带DQB1*0604的白人对 MG抵抗。 v但DQB*0604是否是山东汉人或国人对GPP 抵抗的保护性基因，有待于进一步研究。 中华医生网收集编目 / v通过以上分析，结合本科题研究。 v 推测：DQB1*0201、0603、0602这3个 等位基因编码的DQ2和DQ6分子链中可 能存在着与GPP易感的肽链结合区。 中华医生网收集编目 / q PsV阳性GPP与对照组比较 DQB1*0201、0603的频率在PsV阳性GPP组 中显著高于对照组(RR=32.31，PC=0.005； RR=12.42，PC=0.005)。 q PsV阴性GPP与对照组比较 DQB1*0602频率显著高于对照组(RR=5.6， PC=0.039)。 中华医生网收集编目 / qPsV阳性GPP与PsV阴性GPP比较 DQB1*0201、0603的频率在PsV阳性GPP组 高于PsV阴性组（RR=23.