论文-李永辉-益智中圆柚酮治疗肾损伤的药效研究

益智中圆柚酮治疗肾损伤的药效学研究李永辉1,2，张俊清1,2（1.海南省热带药用植物研究开发重点实验室，海口，571199；2.海南医学院药学院，海口，571199）【摘要】目的：对圆柚酮治疗慢性肾脏疾病的药效进行评价，阐述益智补肾缩尿的物质基础。方法：采用腺嘌呤诱导的CKD大鼠模型，对益智中圆柚酮的肾损伤保护作用进行研究，分别测定24小时尿量、尿蛋白（UP24h）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、硫酸吲哚醇（IS）的含量以及对肾脏病理切片进行观察，以确定圆柚酮对CKD的治疗作用。结果：与模型组比较，圆柚酮各剂量组大鼠肾组织病理切片形态均有不同程度的改善，其中圆柚酮高剂量组圆柚酮中剂量组黄葵胶囊组圆柚酮低剂量组，且高剂量组大鼠血清中BUN和IS及尿蛋白含量中低剂量组降低更明显；与高剂量组相比，中剂量组血清中Scr降低较明显。结论：圆柚酮对CKD呈现明显的量效关系，高剂量组药效强于低剂量组。【关键词】圆柚酮；慢性肾脏疾病；药效学；病理切片； 慢性肾脏疾病(Chronic Kidney Disease,CKD)是一种多种原因诱导肾脏功能下降的疾病，近年来发病率呈现逐年上升的趋势，现已成为影响人类健康的一类常见病和多发病1-3。目前，慢性肾病的治疗主要为控制患者症状，降低蛋白尿的形成，在临床上取得了一定的疗效，但仍有较多的患者疗效不佳。肾脏疾病的临床研究发现，中药在改善患者临床症状、控制蛋白尿、减少血尿、保护肾功能和减轻西药的副作用方面呈现了较好的优势4。益智性温味辛，归脾肾经，具有温脾，暖肾，固气，涩精的功效。临床上用于治疗冷气腹痛，中寒吐泻，多唾，遗精，小便余沥，夜多小便等证。益智做为传统肾脏用药5-7，在临床上广泛用于慢性肾脏疾病的治疗，然而对其药效物质基础及作用机制研究甚少。本课题组在多年益智研究工作的基础上，发现其主要成分圆柚酮对CKD的具有较好的治疗作用。因此，本实验以腺嘌呤诱导的大鼠肾损伤模型，对圆柚酮的药效学进行评价，以期阐明益智补肾缩尿的物质基础及其作用机制，为益智的临床应用提供实验支撑。1 材料与方法1.1动物 健康SD雄性大鼠48只，体重( 180-220g)，SPF级，长沙市天勤生物技术有限公司提供，合格证号SCXK( 湘) 2009-0012，常规适应性饲养1周，无不良反应者进入实验。1.2 药品与试剂 圆柚酮由李永辉提供，HPLC含量大于98%，批号：；黄葵胶囊，江苏苏中药业集团生产，批号15052703；尿素氮试剂盒（批号：20150605)及肌酐试剂盒（批号：20150616)，尿蛋白定量试剂（批号：:2150603）均由南京建成生物工程研究所提供；，腺嘌呤（RealJimer，批号641255）。其它试剂购于上海化学试剂公司。1.3 仪器 GS-15型低温离心机，Beckman公司 ；DW-40L262型低温冰箱， 海尔；PL203型电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；e2695液相色谱仪，Waters公司生产。1.4 造模 取SD大鼠（180-220g），随机分为6组，分别为：正常组、模型组、黄葵胶囊组、圆柚酮高剂量组、圆柚酮中剂量组和圆柚酮低剂量组，模型组和实验组大鼠按150mg/kg灌胃腺嘌呤混悬溶液造模，连续造模14天后，将大鼠置于代谢笼中，分别收集正常组、模型组和实验组的24h尿量，模型组和实验组24h尿量大于正常组为造模成功。正常组给予生理盐水，模型组继续按照150mg/kg腺嘌呤灌胃，实验组同时给予150mg/kg的腺嘌呤溶液和圆柚酮不同浓度的样品溶液。1.5 分组及给药 模型成功后，将大鼠48只，随机分为6组，即正常组、模型组、阳性药物组、圆柚酮化合物分高、中、低三个剂量组，每组8只。正常组（灌生理盐水），模型组（按150mg/kgd灌腺嘌呤混悬液），黄葵胶囊组（按0.75mg/kgd灌胃给药），圆柚酮高剂量组（按20mg/kgd灌胃给药），圆柚酮中剂量组 （按10mg/kgd灌胃给药），圆柚酮低剂量组 （按5mg/kgd灌胃给药），各组每日灌胃1次，不限制饮食和水，干预周期为2周，期间不使用抗CKD药物。1.6 检测指标1.6.1 尿蛋白 2周末，分别将各组大鼠置于代谢笼内，禁食不禁水，收集24 h尿液，计24 h尿量，充分混匀后，于1300r/min离心5 min，收集上清液，通过尿蛋白定量试剂测定24 h尿蛋白量。 1.6.2 肾功能 大鼠空腹6小时后，乙醚麻醉，腹主动脉取血，分离血清，通过尿素氮试剂盒和肌酐试剂盒分别检测血尿素氮( blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐( serum Creatinine,SCr)。参照文献8采用HPLC荧光法测定血浆中硫酸吲哚酚的含量：Phenomenex Luna色谱柱（4.6150mm，5m），流动相为乙腈-水-三氟乙酸(15: 85: 0 .2 ，V/V/V)；流速：1 mL/min；柱温：30；激发波长280 nm，发射波长390 nm。1.6.3 病理切片 药物对腺嘌呤致肾损伤的肾组织学实验中病理切片委托南京医科大学病理教研室检测。观察指标包括（1）肾小球有无增生或萎缩；（2）肾小管有无扩张、管型和尿酸盐沉积；（4）间质有无炎细胞浸润、纤维组织增生等病变。根据病变由轻到重的程度，依次定量为轻微或极少量“0.5分”，轻度或少量“1分”，中度或较多“2分”，重度或多量“3分”， 极重度或大量“4分”,正常“0分”累加所有分数，并计算出每组每只动物的均分（SD），分值越高提示炎症病变程度越严重。1.7 统计学处理 数据以SD表示，用SPSS 13.0软件进行统计分析，多样本均数的比较采用单因素方差分析，两两比较用t检验P0.05表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 尿蛋白 结果显示与正常组相比，模型组的24 h尿蛋白定量给药后明显升高；与模型组相比，给药2周后各给药组则明显降低，其中圆柚酮高剂量组较低剂量组降低明显，见表1。表1不同剂量圆柚酮对CKD大鼠24h尿蛋白的影响(SD，n= 8)Table1 Effect of different doses of nootkatone on 24h urine protein in CKD rats组别剂量（mg/kg）给药两周尿蛋白/mg正常组-435.87213.02模型组1501306.03153.30#黄葵胶囊组0.75681.19248.14*圆柚酮高剂量组20937.31231.29*圆柚酮中剂量组10968.51241.53*圆柚酮低剂量组51056.18251.23#与正常组比较P0.01，*与模型组比较P0.052.2 肾功能 结果表明与正常组相比，给药后各组小鼠的SCr、BUN、IS升高明显; 与模型组相比，各给药组中圆柚酮低剂量组小鼠的IS略微升高，其他给药组小鼠的SCr、BUN、IS降低明显，其中高剂量组大鼠血清中BUN、IS降低较低剂量组明显，而低剂量组血清中SCr较高剂量组降低明显，见表2。表2不同剂量圆柚酮对CKD大鼠的BUN、Scr、IS影响(SD，n= 8)Table 2 Effect of different doses of nootkatone on BUN、Scr and IS in CKD rats组别剂量（mg/kg）给药两周BUN(mmol/l)Scr(umol/l)IS(ng/ml)正常组-13.873.82199.1959.391117.8963.29模型组15036.4215.01#368.6682.01#3652.551990.79#黄葵胶囊组0.7514.695.54*236.5669.27*1802.14905.77圆柚酮高剂量组2029.5410.44287.3855.96*2665.39937.77*圆柚酮中剂量组1032.199.85271.5642.572814.571042.57圆柚酮低剂量组535.7911.84264.3578.543731.262288.71#与正常组比较P0.05，*与模型组比较P圆柚酮中剂量组黄葵胶囊组圆柚酮低剂量组，见图1、表3。 图1 不同剂量圆柚酮对腺嘌呤致CKD实验病理切片图(HE染色)Figure 1 Histopathology of nootkatone on adenine-induced CKD experimental ratsA.正常组 B.模型组 C.黄葵胶囊组D.圆柚酮高剂量组 E.圆柚酮中剂量组 F.圆柚酮低剂量组表3 不同剂量圆柚酮对腺嘌呤致CKD实验病理检查评分结果(SD，n= 8)Table3 Results of pathological examination of nootkatone on adenine- induced CKD组别剂量（mg/kg）病理结果得分正常组-0.600.55模型组15011.200.45#黄葵胶囊组0.757.50 1.96*圆柚酮高剂量组205.200.76*圆柚酮中剂量组105.300.89*圆柚酮低剂量组55.501.27*#与正常组比较P0.01，*与模型组比较P0.013 结论 慢性肾脏疾病(Chronic Kidney Disease.CKD)，由于肾功能减退，肾脏不能在白天将体内代谢产物完全排出，需在夜间继续排泄，以致夜尿增多。蛋白尿是 CKD一个重要的致病因素，也是其临床诊断的早期主要线索。同时大量蛋白尿又可进一步激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，使肾小球间质补体生成，增加细胞因子、炎症因子的产生，最终导致肾功能的加重受损9。西医治疗慢性肾炎蛋白尿所采用的手段有激素、免疫抑制剂、ACEI/ARB类药物等，虽然临床上取得了一定的疗效，但西药的疗程漫长，停药后易于反跳，副作用也较多，患者的依从性较差。黄葵胶囊属于单方纯中药制剂，性味甘、寒，无毒，主要功效为解毒消肿、清利湿热、活血化瘀，还能有效消除氧自由基10在临床上广泛用于慢性肾病的治疗，因此本实验选择了黄葵胶囊做为阳性对照药。陈萍等人11认为黄葵胶囊对肾病治疗机制有：抑制免疫反应、减轻炎症反应、改善肾纤维化、保护肾小管上皮细胞。益智具有暖肾固精缩尿、温脾止泻摄唾之功效，用于治疗肾虚遗尿，小便频数，遗精白浊，脾寒泄泻，腹中冷痛，口多唾涎等症12。益智的化学成分多样，其中倍半萜类化合物为主要特征成分13。本文对倍半萜类成分的主要化合物圆柚酮进行了抗CKD的作用研究。研究发现，与模型组相比，圆柚酮高剂量组可以明显减少血液中尿素氮、肌酐、硫酸吲哚醇，增加尿量；通过病理切片可以看到圆柚酮高剂量组能够在一定程度上改善肾组织。提示圆柚酮可能是益智补肾缩尿的主要活性成分。参考文献1 Stack AG, Casserly LF, Cronin CJ, Chernenko T, Cullen W, Hannigan A, Saran R, Johnson H, Browne G, Ferguson JP. Prevalence and variation of Chronic Kidney Disease in the Irish health system: initial findings from the National Kidney Disease Surveillance ProgrammeJ. BMC Nephrol. 2014, 15:185.2 De Nicola L, Donfrancesco C, Minutolo R, Lo Noce C, Palmieri L, De Curtis A, Iacoviello L, Zoccali C, Gesualdo L, Conte G, Vanuzzo D, Giampaoli S; on behalf of the ANMCO-SIN Research Group. Prevalence and cardiovascular risk profile of chronic kidney disease in Italy: results of the 2008-12 National Health Examination SurveyJ. Nephrol Dial Transplant. 2014, pii: gfu383.3 Zhang L, Wang F, Wang L, Wang W, Liu B, Liu J, Chen M, He Q, Liao Y, Yu X, Chen N, Zhang JE, Hu Z, Liu F, Hong D, Ma L, Liu H, Zhou X, Chen J, Pan L, Chen W, Wang W, Li X, Wang H. Prevalence of chronic kidney disease in China: a cross-sectional surveyJ. Lancet. 2012, 379 (9818): 815-822.4刘平夫. 慢性肾炎蛋白尿的中医辨治J.长春中医药大学学报,2013,29（3）:447.5汪庵. 本草易读M.北京:人民卫生出版社,1987:161. 6汪昂. 本草备要M.北京:中国中医药出版社,2009:126.7缪希雍. 神农本草经疏M.北京:中医古籍出版社,2002:217.8 吴淳 , 石成钢 , 李梅,等. HPLC-FLU 法测