东方百合AFLP分子标记技术体系的建立.doc

东方百合aflp分子标记技术体系的建立摘要: 本研究以索蚌（sorbonne）、康斯坦撒（constantza）及其杂交f1代为材料构建了东方百合扩增片段长度多态性 (aflp)分析体系.采用改进的 ctab方法, 从东方百合中提取基因组 dna, 琼脂糖凝胶电泳主带清晰、dna 纯度高、较少降解、不含酶反应抑制剂, 可被 m se 和 pst 两种限制性内切酶完全酶切。通过酶切连接、预扩增、选择性扩增、银染等试验过程, 成功建立了东方百合 aflp 反应体系, 得到了清晰的指纹图谱, 试验结果重复性好.关键词：东方百合；aflp；dna提取 establishment of aflp molecule labeling technique system of oriental hybridsabstract in this paper，we used sorbonne，constantza and its f1 hybrids as materials. aflp ( amplified fragment length polymorphism ) analysis system for oriental hybrids was established in this study.the improved method of ctab-dna isolation was used to extract genome dna from oriental hybrids. high quality genome dna was obtained. strips in agarose electrophoresis were clear and less decomposed. these dna samples with high purification were intact without containing inhibitor of enzyme reaction and could be completely digested by restriction enzymes such as mse and pst inter sweet cultivars. the system suitable for silver stained aflp analysis were established successfully by processes like restriction enzymes digesting ligating reaction, amplification reaction, and selective amplification. sharp fingerprintings were obtained by these processes, and the reproducibility was high.key words:oriental hybrids; aflp; dna isolation 东方百合学名“oriental hybrids”，是由天香百合、鹿子百合、日本百合、红花百合与湖北百合的杂交获得的栽培杂种系。因其花形大、花色艳丽、姿态高雅、香味浓郁备，深受市场欢迎，逐渐取代亚洲百合，成为最重要的百合组。荷兰和美国成为世界百合的培育中心，已培育出数以千计的品种，几乎垄断了国际百合种球市场。我国有着丰富的野生百合资源，全世界百合约有97个种，而起源于我国的就有47个种和18个变种，约占世界百合属植物的一半，其中有36个种和15个变种为中国特有种。但是缺少拥有自主知识产权的优良百合品种，种球几乎完全依赖进口，而进口的种球种性退化快，严重制约着我国百合产业化的发展。. 随着分子生物学的发展, 出现了多种分子标记技术, 使从基因组水平探讨东方百合遗传变异成为可能. 扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism , aflp)是1992年由荷兰keygene公司zabeau和vo s在pcr和rfl p的基础上发展起来的新一代分子标记技术1.它既克服了rfl p技术复杂, ra pd稳定性差、标记呈显性遗传的缺点,同时又兼有二者之长,具有分辨率高、稳定性好、高效率和高灵敏度等优点,实验结果稳定可靠2,3. a fl p产生丰富而稳定的遗传标记,可以用于遗传多样性、基因追踪、基因定位、分类、系统发育、品种鉴别、遗传图谱构建等各个领域4.目前a fl p技术在植物中的应用非常广泛,除了在小麦、水稻、玉米、大豆、花生等农作物中的应用外,在蔬菜、花卉以及其他观赏树木中的应用也非常广泛5,6.本研究以形态标记法选育出的东方百合为试验材料, 通过对 aflp反应体系各关键影响因素进行优化, 建立东方百合 aflp反应体系, 从而为构建东方百合的遗传图谱及分子标记辅助育种奠定了基础.1. 材料与方法1. 1 试验材料1.1.1植物材料供试材料为材料为索蚌（sorbonne）、康斯坦撒（constantza）及其杂交f1代，均为试管培养保存。（种植于南京林业大学花卉实验室温室）1.1.2试剂限制性内切酶eco r、mse(mb i)、引物、接头.、taq酶、t4连接酶1.1.3仪器 bio-mini dna/ rna/ protein分析仪、pcr仪、d yy-6c型电泳仪、垂直电泳系统 (bio-radpower pac 3000)、台式离心机及其它常用仪器。1. 2 试验方法1. 2. 1 dna 的提取 分别采用改良ctab法( 广东野百合 dna 提取和 rapd 条件的优化)和国产试剂盒提取试管培养新鲜叶子的dna，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度，终浓度稀释到100ng/l.两种方法提取的dna都按1.2.2-1.2.3步骤进行aflp反应，以比较哪种方法适合aflp技术。1.dna提取步骤(粗提)(l)取lg新鲜百合叶片(去掉基部叶脉密集部分)放入研钵中，加入液氮，反复研磨3一4次至叶片成很细的粉末为止;(2)将研磨成后的实验材料转入10rnl的离心管中，加入4ml65预热的ctab充分混匀，65水浴45一60分钟，期间振摇3次使提取液与实验材料充分反应;(3)加入等体积的氯仿/异戊醉(24:l)，轻缓颠倒离心管混匀，室温下静止10min，12000r/min离心10min;(4)将上清液转入另一离心管中，重复步骤(3)操作一次;(5)将上清转入新的离心管中，加入1/10体积的3m的naac，再加入一20冷却的异丙醉，轻缓颠倒混匀后冰上静止30min;(6)6000r/min离心3一5min，弃上清后将沉淀转入lml的新离心管中;(7)加入1ml75%无水乙醉漂洗3次;(8)加入 1ml75%无水乙醉漂洗1次:(9)沉淀放置于室温或65恒温箱至酒精味消失，加500ul灭菌te溶解，备用。2.dna粗提物的纯化(1)加入 2ulrnase置于37恒温箱中放置60min或者过夜;(2)取2ul处理后的dna溶液电泳检测，观察rna是否去除完全；(3)加入500ul碱酚:氯仿:异戊醉(25:24:l)，振摇使其充分混匀，静止l0rnin，12000r/min离心10min;(4)取上清于一新的1ml离心管中，重复步骤(3)操作一次，如果上清比较透明则可以不进行本次操作;(5)取上清于一新的1ml离心管中，加入灭菌te至总体积为500ul，再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:l)，混匀后室温下静止10min，12000r/min离心10rnin:(6)取上清于一新的1ml离心管中，加入40ul3m的naac和一20预冷的无水乙醇800ul，冰上静止30min;(7)用手指轻轻弹出沉淀中的气泡，6000r/min离心3一5min;(8)弃上清，加入1ml75%无水乙醇漂洗3次;(9)加入1ml75%无水乙醇漂洗1次;(10)沉淀放置于室温或65恒温箱至酒精味消失，加500ul灭菌te溶解。1. 3 aflp反应体系的建立1. 3. 1 dna 样品酶切连接 酶切与连接采用invitrongen公司的aflp core reagent kit（包含ecor i/msei，t4连接酶和接头），体系与步骤参照产品说明书：（1） 酶切体系：2.5l dna,5l 5x reaction buffer,2 l ecor i/msei,加distilled water至总体为25l.（2） 37c温浴2小时，然后70c灭活15分钟,使内切酶彻底失活，置于冰上。（3） 在第二步的酶切产物中加入24 l adapter/ligation solution和1 l of t4 dna ligase，总体积为50l。（4） 20c温浴2小时。（5） 产物用te稀释10倍，-20c保存。 1. 3. 2 dna 片段的预扩增与选择性扩增反应体系和反应程序参照vos和柯贤锋等方法，稍作改动。引物由英俊公司合成。表1 预扩增反应体系（preamplification reactions）componentsvolume(l)ddh2o12.710xpcr buffer2mse-c primer(10lmol/l)1ecor-a primer(10lmol/l)1dntps mix(10mmol/l)0.5mg(25mm)1.6taq(5u/l)0.2ligated dna（dilution 10 times）1预扩增反应程序：72c 2min;94c 30 s;56c 1 min;72c 1 min 30 s;30轮循环；72c 10 min;4c forever.反应产物去5l经1%琼脂糖凝胶电泳检测，1:20稀释用于选择性扩增。表2 选择性扩增反应体系（selective amplification reactions）componentsvolume(l)ddh2o11.710xpcr buffer2mse selective primer(10mol/l)1ecor selective primer(10mol/l)1dntps mix(10mmol/l)0.5mg(25mm)1.6taq(5u/l)0.2preamplified dna( dilution 20 times)2选择性扩增反应程序：94c 5 min;94c 30 s;65c 30 s 以后每轮循环降低0.7c，72c 1 min 30 s,12轮循环；94c 30 s;56c 30 s;72c 1 min.24轮循环；72c 6 min; c forever. 反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳和6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。2 结果与分析2.1 dna提取如图1，改良ctab法提取的dna浓度高，最高能能达到1000ng/l,但是点样孔亮，且dna带型不够平整，表明氯仿多次抽提后任然有多糖等杂质。如图2，试剂盒提取的dna虽然浓度没有ctab法提取的高，但是点样孔干净，带型平整，说明多糖等杂质去除干净。图1 改良ctab法提取的dna图2 试剂盒提取的dna dna2.2酶切与连接酶切连接产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，如图3，片段在100bp-1000bp呈现弥散带，亮度均一，表明酶切充分。500bp100bpm 1 2图3 酶切连接产物1000bp2.3预扩增如图4所示，预扩增产物在100bp-1000bp之间呈现弥散带，有几条主带，点样孔干净，表明预酶切充分，连接完全，富集效率高，可作为选择性扩增的模板。500bp1000bpm 1 2 3 4 5图4 预扩增产物100bp2.4选择性扩增 预扩产物必须经过稀释后才能做为选扩模板，稀释倍数受实验材料和预扩效果的影响。经过比较发现:稀释倍数在20一70倍的稀释倍数之间差异不太明显，但是30倍主带相对明显，所以选择稀释倍数为30倍。3.小结与讨论1) 实验材料收集问题。实验材料是实验进行的根本，实验样本采集地点，生境和数量取决于实验目的，同时又对实验结果的准确性和科学性有着重大影响.2) aflp实验操作问题。a下lp实验过程复杂，工作量大，成本较高。因此为了避免失误造成工作量的增加和药品的浪费，要尽量在每一步完成时都进行检测。首先，高质量的基因组dna提取非常重要。因为dna纯度不高会影响酶切连接顺利进行。为了酶切充分只能增加酶的用量和酶切时间，这样即浪费时间又浪费药品。另外扩增试剂的污染是非常值得注意的问题。aflp模板和引物较多，容易造成污染从而产生假阳性，所以加样时要特别小心，并做阴性对照防止假阳性的干扰。3) 电泳是 aflp 结果检测中最关键的一步. 凝胶电泳一般用 5%的 page胶、80w 恒功率、1. 52. 5 h, 结果是带型清晰, 分辨率在 50 800 bp. 若功率过高, 板易炸裂. 若扩增产物信号较弱, 变性时可抽去石蜡油或打开离心管的盖子, 使样品部分蒸发, 增加其浓度. 本试验是在冬季进行, 所得到的胶板常会因温度过低而变得模糊, 温度成为影响银染结果最主要的因素. 因此, 除了尽量让胶板制作时的环境温度保持较高外, 还用加热法使电泳缓冲液达到 50后再倒入电泳槽中预电泳. 显影时, 为保证条带清晰, 把胶版先放入预冷的 1/2显影液中,充分振荡, 当出现第一批条带后再缓慢注入另一半显影液.aflp 过程中高质量的基因组 dna 是基础, 引物组合的选择是难点, 预扩和选扩是重点, 最后一步电泳和银染是关键点. 可见 aflp 技术程序的繁琐和复杂, 因此从 dna的提取到电泳银染每个环节都必须严格要求、反复摸索才能获得最佳结果.4) 东方百合资源保护及利用。我国目前的百合育种远远落后于世界先进国家(如美国、日本、荷兰等)，且百合资源在没有得到利用的情况下被破坏和流失的现象非常严重。分子标记在百合遗传育种中的应用主要集中在突变体的鉴定与筛选方面，并取得了一定的成果。目前a fl p技术在花卉中的应用非常广泛，因此建立野百合a fl p反应体系对百合遗传多样性研究及亲缘关系的鉴定具有重要意义。为了跟上世界百合研究及开发利用的形势，保护、研究、开发和利用我国丰富的百合资源并开展百合新品种的选育工作显得非常重要和迫切。参考文献: 1鞠秀芝，杜胜利等.aflp技术及其常见问题与解决方案j.天津农业科学，2004，10（4）：6-9 2王斌,翁曼丽.aflp的原理及其应用j.生物技术通报,1996,12(5):27-30 3夷东明,黄仁敏.aflp分子标记及其在植物育种上的应用j.生物工程进展,1997,17:11-164赵桦，张羽.三种百合科植物的染色体组型分析j.汉中师范学院学报(自然科学).1996(l):55一595rajan kumar mishra, swati sen mandi. genetic diversity estimates for darjeeling tea clones based on amplified fragmentlength polymorphism markersj. journal of tea science,2004,24(2):86-92 6张 镝 ，丁 毅基于 afip标记 的中国西藏近缘 野生大麦遗传多样性 分析 j遗传，2007，29(6)：725-7307 暴朝霞,黄宏文.板栗主栽培品种的遗传多样性及其亲缘关系分析j.园艺学报,2002,29(1):13-198 margues c m,araujo j a,fereira j g, et al,aflp genetic maps of eucalyptus gl