四川省中医科研课题申请书—电针促进老年痴呆大鼠海马神经元突触可塑性的神经细胞粘附机制.doc

四川省教育厅自然科学科研项目申报书项目类别重点项目青年基金项目国家自然科学基金预研项目重点专项项目名称：电针促进老年痴呆大鼠海马神经元突触可塑性的神经细胞粘附机制起止时间：2004.01-2006.12承担单位：成都中医药大学项目负责人：余曙光学科门类：中医学（针灸推拿）学科情况：国家级重点学科、省重点学科国家中医药管理局三级实验室、省重点实验室填报日期：2003.05四 川 省 教 育 厅 制填报说明1、 申报书适用于四川省教育厅资助自然科学研究项目2、 封面“项目类别”只能选填一种，在该项目类别前中画“”。3、 学科情况注明是否国家、省部级重点学科、重点实验室。4、 申报书填写要求用a4纸计算机打印。一式三份通过学校科技处统一报送省教育厅科技处。5、 有未尽事宜，可另附材料说明。一、目的意义和国内外研究现状分析（一） 目的意义通过本课题的研究，更进一步从神经细胞粘附的角度深入探讨电针促进老年痴呆海马神经元突触可塑性发挥的作用机制，为针灸促进神经可塑性的发挥介导神经变性疾病的神经康复提供科学的实验依据。（二）国内外研究现状分析目前研究发现，海马神经元的突触丢失和突触可塑性的变化在老年痴呆的病理过程中占据着重要的地位，它可能是老年痴呆学习记忆功能障碍的神经生物学基础1，2。有临床研究显示,在众多的治疗老年痴呆的药物中3，能够对海马神经元突触可塑性施加影响的药物如神经生长因子（nerve growth factor, ngf）、黄皮酰胺等对老年痴呆的治疗有着良好的应用前景4,53。 因此，如何促进老年痴呆发生后海马残存神经元突触可塑性的发挥，成为了世界范围众多研究者们正在进行不断深入探索的难点和热点问题；同时，随着针灸对老年痴呆研究的逐步深入，在临床已经具有一定疗效的基础上，对其机制的研究已经成为当务之急。目前，已有研究者从行为学6、神经递质7，8（ach、eaas等）、血浆no9、细胞因子10、自由基11等方面进行过相关探讨，但针灸对老年痴呆是如何发挥治疗作用的机制方面，尚未达成共识。我们在国家自然科学基金资助课题“电针对老年痴呆大鼠海马神经元突触可塑性的影响及机制”研究中初步证实，电针 “百会”、 “涌泉”、“太溪”、“血海”后，能够促进c-fos蛋白表达，诱导内源性ngf的合成，从而增大突触数密度和面密度，降低突触平均面积，促进海马神经元突触形态可塑性的发挥，提高老年痴呆大鼠的学习记忆能力；并提出，针灸促进海马神经元突触可塑性的发挥可能是针灸促进老年痴呆后神经变性康复的关键环节之一12。随着研究的不断深入，最近有研究提示，突触形态可塑性的发生除了需要ngf等神经营养因子的营养作用外，神经元细胞之间的粘附现象及其在突触可塑性的作用研究近年来格外引人瞩目，并认为这可能是突触形态可塑性发挥的又一重要的、关键性环节，而这种粘附现象的发生， 神经细胞粘附分子（neural cell adhesion molecules, ncams ）的作用尤为重要13-16。迄今为止，研究者们采用多种技术手段所积累的有关ncams参与神经系统可塑性的大量资料显示，ncam参与可塑性主要有两个机制1721：其一为ncam通过介导细胞骨架动力改变，从而参与活动依赖的突触重建。其二对胞内信号系统的影响。这种胞内信号有如下特点：就是胞内信号的改变可反馈到突触后膜，通过ncam调控细胞与细胞的粘附，以迅速地改变突触的结构和效率。若给予胞内蛋白水解酶calpain水解ncam后，则较快地解除和重新组织突触的结构联系。同时，研究发现，海马突触前后膜上存在大量的ncam，在持续性突触发生时表达增强22。表达增强后，通过三种可能的方式介导神经元细胞粘附23：(1)相邻细胞上的两个ncam分子通过各自的ig结构域的相互作用实现ncam的亲同性结合；(2)通过两个ncam分子的5个免疫球蛋白结构域反平行结合来实现；(3)两个ncam分子上的igi和ig结构域igll和ig2、ig1和igi2的交互结合。在ncam介导神经细胞粘附促进突触可塑性发挥的影响因素中，有人认为多聚唾液酸(polysialic acid，psa)是关键因素之一。de-stefano等24指出，psancam不仅参与了发育过程中的突触重建，而且在损伤诱导神经元可塑性方面也起着重要作用。如psa为齿状回颗粒细胞苔藓纤维生长所必需，缺乏psa-ncam的小鼠苔藓纤维不成束，可严重影响海马ca3区突触的产生。然而另外的研究却提示25，ncammrna的表达诱导可能是nf-b上调表达后的结果。综上所述，我们认为，针灸通过突触可塑性的发挥，促进老年痴呆等神经变性疾病的神经康复除了诱导内源性ngf合成外，还可能通过上调nf-b和/或psa的表达，诱导ncam的合成与表达，促进神经元细胞粘附，促进神经元突触重建，从而改善突触的正常功能，有利于针灸促进老年痴呆后神经变性的神经康复。对此，目前尚未见相关研究报道。值得进一步深入研究，以期从神经元细胞粘附的角度进行深入探讨针灸促进神经元突触形态可塑性的机制。参考文献1.maren s，baudry m. properties and mechanism of long-term synaptic plasticity in the mammalian brain:relationship to learning and memory. neurobiol learn mem,1995,63:1 2.redaman s.the hippocampus ,long-term potentiation and memory. clin exp pharmacol phychol,1996,23:9613.盛树力主编.老年痴呆从分子生物学到临床诊治.科学技术文献出版社.北京；，4.olson l, et al. j neurol transm,4:795.陈可冀主编.跨世纪脑科学.老年痴呆发病机理与诊治.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.北京；，2516.韩景献.李平.刘庆忠等.针刺对快速老化痴呆模型小白鼠行为学影响的实验研究.中医杂志.；（）：7.赵纪岚.余曙光.周奇志.等.针刺对老年大鼠及老年小鼠中枢神经递质的影响.成都药大学学报.；（）：8.石学敏. 韩景献.李平.等.针刺老化痴呆鼠脑兴奋性氨基酸水平影响的实验研究.中国针灸.；：9王舒.赵俊宏.杨增瑞等.针刺血浆及心肌影响的实验研究.针刺研究.；：10.黄诚.陈汉平.秦秀娣等.针刺抑制老年大鼠脑与垂体细胞因子基因表达. 针刺研究.；： 11.高尚仁.王米渠主编.书法针刺调治老年痴呆的行为及细胞水平研究.香港大学出版社.香港；：12.罗松.廖方正.余曙光.电针对老年痴呆大鼠海马神经元突触形态可塑性的影响机制.成都中医药大学博士论文.200313.kiryushko d, kofoed t, skladchikova g, et al. a synthetic peptide ligand of neural cell adhesion molecule (ncam), c3d, promotes neuritogenesis and synaptogenesis and modulates presynaptic function in primary cultures of rat hippocampal neurons.j biol chem.2003;278(14):12325-3414.son h, seuk kim j, mogg kim j, et al.reciprocal actions of ncam and tpa via a ras-dependent mapk activation in rat hippocampal neurons.biochem biophys res commun 2002;298(2):262-815.fercakova a.cell adhesion molecules in the neural development and plasticity. bratisl lek listy 2001;102(12):552-516.panicker ak, buhusi m, thelen k, et al.cellular signalling mechanisms of neural cell adhesion molecules.front biosci. 2003;8:d900-11 17.jones l s. integrins: possible funtions in the adult cns.tins,1996,19(1):6818.schmidit r, brysch w, rother s，et al. inhibition of memory consolidation after active avoidance conditioning by antisense intervention with ependymin gene expression. j of neurochemistry,1995,65(12):146519.rose s p. cell adhesion molecules and the transition from short-to long-term memory. j physiol paris,1996,90(3):38720.muller d, wang c, toni n，et al. psa-ncam is required for activity-induced synaptic plasticity. neuron, 1996,17(9):41321.luthi a. hippocampal long term potentiation and neural cell adhesion molecules l1 and ncam. nature,1994,372(5):777.22. tieuk，yuphneurd celladhesionmoleculesin：boultin aa，baker cb，bateson anneuromethods vol 33：cell neurobiology techniquesnewjersey：humana press，199910310723. kasperc，rasmlisenh，kastrup js，etalstructural basis of cell一cell adhe8ion by ncamnature structural biol，2000，7：38739324. de-stefano me，leone l，paggi ppolysialylated neural cell adhesion molecule is involved in the neuroplasticity induced by axonal injury in the avian ciliary ganglionneurosci，2001，103：1093110425. carol s. simpson.brian j. regulation of neuronal cell adhesion molecule expression by nf-b. j. biol. chem.;275( 22): 16879-16884二、研究方案及可行性分析1、 研究目标、研究内容(一)研究目标（1） 通过本课题的研究，从海马神经元细胞粘附的角度揭示电针促进老年痴呆海马神经元突触形态可塑性发挥的作用机制；（2） 从psa、nf-b的角度揭示二者对电针促进ncam介导海马神经元细胞粘附的调控作用。（二）研究内容a. 电针对老年痴呆大鼠海马神经元突触形态可塑性的影响研究运用光镜和电镜技术结合，在光镜确认海马神经元的基础上，再用电镜，从突触前膜、突触间隙、突触后膜的突触数密度、突触面密度、平均面积等突触的超微结构进行电针促进突触可塑性的观察。b. ncam在电针促进老年痴呆大鼠海马神经元突触形态可塑性中的作用研究运用免疫组化、原位杂交结合图像分析技术进行海马神经元ncam及其mrna在研究各组（空白组、模型组、模型针刺组、模型假手术针刺组）中表达情况的比较研究。c. psa、nf-b对ncam介导海马神经元细胞粘附，促进突触形态可塑性发挥中的调控作用研究运用免疫组化、原位杂交结合图像分析技术研究比较psa、nf-b在实验各组海马神经元中的变化情况，揭示ncam介导神经元细胞粘附的调控机制。2、拟采取的研究方法、技术路线和试验方案（一）研究方法、试验方案（1）动物造模a.造模方法： 以sd大鼠为对象，采用穹窿-海马伞损害模型的造模方法。具体为：动物经腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，固定于脑立体定位仪上，颅顶区被皮，常规消毒手术区皮肤，无菌下操作，沿颅顶中线作长2cm切口，用湿棉球分离骨膜。于前囟后2.0mm，中线旁1mm处，用牙科钻或自制颅钻打开颅骨，仔细切开硬脑膜，暴露大脑皮质，用特制的宽2mm双刃刀片，按照脑立体定位仪图谱（paxinos g and watson c）于前囟后2mm，中线左侧1mm处置刀于脑表面，然后操作定位仪降刀4.1mm，并向外向内各移动1mm和0.5mm。然后再降刀1mm，外移1.5mm，此时上下抽动刀片数次，依次切断胼胝体缘、扣带回、背侧穹隆-海马伞。留刀3min后退出刀片。（详见：he ys， yao zb，gu ym， et al.ngf promotes collateral sprouting of cholinergic fibers in the septohippocampal cholinegic system of aged rats with fimbria transection. brain res 1992，586：27-35 ）b.模型选择依据：采用损伤穹隆-海马伞方法所制备的老年痴呆模型，除了会导致突触的大量丢失、突触数密度和面密度的下降，还会出现残留的突触在功能上的代偿，而且该模型病理变化肯定，实验效果好，因此，是研究老年痴呆与突触可塑性的一个较为理想的动物模型。（2）实验分组随机分为空白组、模型组、假手术组和模型电针组。（3）治疗方法造模后7天对治疗组进行治疗，穴位选择：百会、涌泉（参考人体穴位和中国兽医针灸学），以hans电针仪进行治疗，频率2-100hz，电压2-4v，留针 30分钟，每日1次，连续治疗3个月。（4）测试指标a. 行为学指标：采用morris水迷宫，进行电针对老年痴呆大鼠的治疗效应评价。b. 海马突触形态可塑性测试指标：突触数密度、面密度、平均面积，突触前后终末平均面积、平均周长，突触前终末内线粒体的体密度、突触数密度、体积，突触界面曲率，神经纤维出芽，侧棘的形成等。研究采用透射电镜结合体视学的方法进行。c. 海马神经元ncam及mrna的检测：采用免疫组化、原位杂交结合计算机图像分析。d. 海马神经元psa、nf-b及mrna的检测：采用免疫组化、原位杂交结合计算机图像分析。（5）统计分析：采用spss11.0统计软件包进行数据统计分析。 （2）.技术路线 s d 大 鼠 模 型 组 空 白 组 行为学测试 治疗效应评价 接受相应处理3个月后，动物处死，取海马组织 观察电针海马神经元细胞粘附、促进突触形态可塑性的影响 介导海马神经元神经细胞粘附的作用机制 ncam、psa、nf-b及mrna电镜结合体视学方法观察突触超微结构 免疫组化、原位杂交结合计算机图像分析 数据统计，资料整理、结题 3、项目实施进度安排2004.012004.06 课题继续进行国内外研究进展追踪，做好仪 器设备和试剂等方面的准备工作；2004.072005.02 完成电针对海马神经元突触形态可塑性的研究；2005.032006.09 完成电针促进海马神经元突触可塑性的神经元细胞粘附机制研究；2006.102006.12 完成数据处理、撰写论文、组织鉴定。4、本项目的特色与创新之处本课题在国家自然科学基金研究的基础上，追踪国内外研究前沿，首次从神经细胞粘附的角度进行电针促进海马神经元突触形态可塑性作用机制的研究，为老年痴呆等神经变性疾病神经康复针灸机理的研究提供更加充分的实验依据和提供新的研究思路。三、最终成果形式及成果预期水平（一） 最终成果形式（1） 以论文形式在国内外相关核心刊物公开发表2-3篇；（2） 培养博硕士研究生各1名。（二）成果预期水平 课题完成后，申请科技进步奖，达到国内领先。四、成果转化措施及社会、经济效益分析（限应用型项目填写）五、现有工作基础和条件1、 与项目有关的前期研究状况（） 已经完成国家中医药管理局青年基金课题（编号：）：针刺治疗老年性痴呆的实验研究 。该课题研究的主要内容如下：. 针刺对老年痴呆大小鼠学习与记忆功能的影响；. 针刺对老年痴呆模型大鼠、小鼠脑内乙酰胆碱脂酶活性的影响；. 针刺对老年大小鼠中枢神经递质的影响；. 针刺对老年痴呆大鼠海马电图的影响；. 针刺对老年痴呆大鼠海马皮层电图的影响；. 针刺对老年痴呆大鼠自由基代谢的影响；. 针刺对老年痴呆大鼠血浆中分子物质含量的影响；. 针刺对老年痴呆大鼠血液流变性的影响。（2）完成书法针刺老年痴呆细胞行为学的影响（临床观察）.高尚仁.王米渠主编.书法针刺老年痴呆细胞行为学的探索.香港大学出版社.（3）已经完成“电针对老年痴呆大鼠海马神经元突触可塑性的影响及机制”（国家科学基金自然基金），正准备结题。该课题研究结果显示，以穹窿海马伞损害作为老年痴呆模型，电针 “百会”、 “涌泉”、“太溪”、“血海”后，能够促进c-fos蛋白表达，诱导内源性ngf的合成，从而增大突触数密度和面密度，降低突触平均面积，促进海马神经元突触形态可塑性的发挥，提高老年痴呆大鼠的学习记忆能力，实现针灸对老年痴呆的治疗效应；并提出，针灸促进海马神经元突触可塑性的发挥可能是针灸促进老年痴呆后神经变性康复的关键环节之一。（4）发表文章：针灸“涌泉穴”对老年大鼠自由基代谢的影响.中国中医老年学杂志，1994；（1）：35针刺对老年大鼠及老年小鼠中枢神经递质的影响.成都中医药大学学报，1999；22（3）：30针刺治疗老年性痴呆的作用机制探讨，成都中医药大学学报，1996；（2）：35针刺对老年大鼠血液流变性影响的实验研究，成都中医药大学学报，1997（1）：22针刺对老年大鼠及老年小鼠中枢神经递质的影响.成都中医药大学学报.1999（3）：针刺对老年痴呆模型大小鼠ache的影响.针灸临床杂志，2002；10针刺对老年痴呆大鼠海马、皮层电图的影响，中国中医基础医学杂志，2002；12针刺对老年痴呆患者认知功能及ache的影响，上海针灸杂志，2001；32、 现有研究条件，尚缺少的实验条件和解决途径（1）拥有日本尼康倒置显微镜、颅立体定位仪、显微操作仪、冰冻切片机、超薄切片 机、照相显微镜、计算机图象分析系统、培养室、超净工作台、低温冰箱等； （2）拥有国家中医药管理局三级实验室、四川省省级重点实验室针灸学实验室 （3）尚缺少免疫组化及原位杂交试剂，已经联系妥当； （4）电镜工作将在本校电镜室进行，已经联系妥当。六、项目负责人承担的其它研究项目项目来源项目名称起止年月负责或参加进展或完成情况国家自然科学基金电针对老年痴呆大鼠海马神经元突触可塑性的影响及机制2001.12003.12负责已经完成，正准备结题国家中医药管理局电针对帕金森小鼠snc多巴胺神经元突触形态与功能可塑性的