肝炎的分子诊断与临床应用ppt演示课件

肝炎分子诊断项目开展介绍 1 1 . . 目 录 1、了解肝炎分子诊断 2、分子诊断在HBV中的临床应用 3、分子诊断在HCV中的临床应用 4、ADICON已开展的肝炎分子诊断项目 2 2 . . 我国乙肝病毒感染率概况 3 3 . . 20062010年全国乙型病毒性肝炎防治规划 显示，中国是乙型肝炎病毒感染和发病人数最多的国 家，全国有6.9亿人曾感染过乙肝病毒，其中1.2亿人 长期携带乙肝病毒。 目前全国慢性乙肝病人2000万人，每年死于与乙 肝相关的肝病患者达28万例，发病率和死亡率都位居 前三位。每年造成的直接经济损失约达3600亿元人民 币。 我国乙肝病毒感染率概况 4 4 . . 什么是分子诊断 在临床上应用核酸（DNA/RNA) 和分子生物 学技术, 在基因水平诊断和监控疾病情况和 疗效，评估疾病的检测方法。 5 5 . . 分子技术在乙肝诊断与治疗中应用 HBV 分子诊断的 临床应用 高灵敏度 HBV DNA定量 HBV 感染监测 药物疗效检测 感染早期检测 HBV 基因分型 病情预后发展 检测 抗病毒药物效 果预测 P区耐药检测 抗药性监测 治疗药物选择 S 区变异 确定隐觅性病毒 变异 判断疫苗效果 判断肝炎预后 C区启动子变异 确定病毒变异 类型 判断治疗效果 确定治疗方案 6 6 . . 高灵敏度乙肝DNA检测 n高精度病毒载量检测系统 （ COBAS AmpliPrep/Cobas TaqMan ） 7 7 . . 高灵敏度乙肝DNA检测优势 n定量PCR技术检测 患者的血清HBVDNA含量，能更准确地反映病毒复制程度 ，对HBV相关疾病的诊断、治疗、判断预后意义重大。 nQF-PCR是国内常用的定量检测 血清HBVDNA水平的方法，COBAS 系统是美 国食品药品监督管理局(FDA)批准用于血清HBVDNA定量检测 的方法。它具有 灵敏度高，线性范围广，实时监 控，重复性好，可检测 A、B、C、D、E、F、 G、前C区变异等多基因型DNA载量优点。 n由于本QF-PCR试剂 盒的线性范围为 1.0x 103 copiesmL1.0x 108 copiesmL ，对于低于1.0 x 103 copiesmL标本的检测结 果不能给出具体拷贝值 ，有存在 漏检的可能。 而COBAS 系统线 性范围为 20-1.7108 IU/mL，因此， COBAS 系 统更能准确反映血清HBV DNA含量。 8 8 . . COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 检测灵敏度20 IU/mL 线性范围20 1.7 x 10 8 IU/mL 检测基因型A-H 检测样 本量650 mL Sample Type血清或EDTA抗凝血浆 SFDA注册证Q3 9 9 . . Cobas 高灵敏度 乙肝：20 IU/mL 准确判断治疗起点/终点 线性范围 乙肝：20-1.7108 IU/mL 极佳的重复性，结果可靠 正确指导抗病毒治疗 每批试剂均使用 WHO标准品校准 保证定量结果的准确性 和可溯源性 每个样本使用同 源性内标定量 避免结果不准确 采用AmpErase酶 减少交叉污染 目前在国内唯一满足治疗指南和专家共识的HBV DNA和 HCV RNA检测试剂1010 . . HBV DNA 监测的重要性 口服核苷（酸）类似物疗效评估 部分病毒学应答 60 2,000 IU/mL 加其他药物治疗 每3个月监测HBV DNA 开始治疗- 基于 HBV DNA、 ALT水平和疾病发展阶段 治疗第12周评估是否存在原发性无应答 (较基线下降2,000 IU/mL 改用或加用更强药物 每6个月监测HBV DNA *Keefe, E. Clin Gastro Hepatology. 2007; (5):890-897. 抗病毒治疗应将HBV DNA降至尽可能低的浓度，理想是低于实时定量 PCR方 法（灵敏度10-15 IU/mL）的最低检出限1 1. EASL HBV Guidelines. J Hepatology. 2009;50:277-242 1111 . . CHB疾病管理:治疗目标 HBsAg 清除及血清学转换 治疗终点 ALT正常 组织学改善HBV DNA 降低/消失 HBeAg 血清学转换 HBeAg消失 cccDNA 清除 *Lok, A.S.F et.al. “Chronic Hepatitis B: Update 2009.” HEPATOLOGY, Vol 50, No. 3, 2009, pgs 8-9 1212 . . 治疗终点 n 2009年EASL指南提出的治疗终点： n最理想的治疗终点：持续的HBsAg 消失，伴 或不伴抗HBs 抗体出现。 n满意的治疗终点：在HBe Ag 阳性患者中，出 现持续的HBeAg 血清转换 n次级的满意治疗终点：尽可能降低病毒DNA 水平（降至实时定量 PCR检测限以下：10- 15IU/ml） 1313 . . HBV基因分型 根据HBV全基因核苷酸序列的差异，分为不同 基因型:A.B.C.D.E.F.G.H共8个型 不同的基因型具有不同地域分布 我国主要是BC型为主，偶有A型 北方C型 1414 . . HBV基因分型检测临床意义 特征基因型 B型C型 感染性低高 HbeAg阳性率低高 HbeAg自然清除时间短长 HBV DNA载量低高 致病性轻重 HCC发生率低（低年龄组高）高（高年龄组高） 干扰素治疗完全应答率高低 抗病毒治疗效果高低 肝癌手术治疗预后好差 癌栓栓塞治疗效果好差 1515 . . HBV变异的基础 n乙肝病毒:高变异性 1/105 n24h 一万亿-十万亿拷贝*变异：一千万一亿 n复制过程:DNA-RNA-DNA nHBV逆转录酶:缺乏严格的校正机制 n变异:自然变异,免疫压力等等 1616 . . 原本有效的药物 对发生耐药变异后的病毒束手无策 变异前，药物有效抑制病毒变异后，药物对病毒束手无策 乙肝病毒P区耐药 1717 . . P区耐药位点检测 1818 . . HBV病毒耐药性检测 n长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引 起耐药的基因突变位点主要集中于P区 n原因：抗病毒药物作用在病毒P区药物靶点上 ，引起相关基因变异，使得药物与相关靶点作 用下降，进而产生耐药。 1919 . . 抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临 床耐药 原发无应答 病毒学（部分） 应答 临床耐药 2020 . . 抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临床耐药 2121 . . 病毒耐药的临床影响 耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低 耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处 病毒反弹, 血清转氨酶升高, HBeAg血清转换率降低 肝脏病理进展 肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡 肝移植后肝炎复发率增高 公共卫生危害 耐药病毒株的传播 免疫逃逸 LiawLiaw et al. 1999 et al. 1999. Hepatology . Hepatology 30: 56730: 567 2222 . . 病毒的水平越低，耐药发生的几率越低 2323 . . 初治患者耐药发生率 拉米夫定,阿德福韦,恩替卡韦为基因型耐药发生率, 替比夫定为因耐药发生的病毒学反弹发生率 2424 . . P区耐药位点检测 n长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药 的基因突变位点主要集中于P区 n耐药基因分析在临床药物选择上的应用 目前最常见P区耐药位点11个 （169、173、180、181、184、194、202、204、 233、236、250） 2525 . . 拉米夫定 M204I/V L180M V173L 恩曲他滨 V173L L180M M204I/V 阿德福韦 A181V N236T 恩替卡韦 T184A（G/I/S) M250V 特比夫定 M204I/V 常用抗病毒药物的耐药位点 2626 . . 常见变异的交叉耐药性 敏感界于中间耐药 2727 . . 抗病毒药物的选择和使用 1.一种药物产生耐药时，需要用具有不同耐药 位点药物代替 2.为减少耐药情况，建议从治疗开始就使用 具有两种不同耐药位点药物一起治疗 3.由于抗病毒药物的耐药以及治疗的长期性 ，在治疗过程中应该定期检查，或是在发现 药物治疗效果不佳时需排除产生耐 药的可能 2828 . . 药物治疗慢性乙肝患者管理路线 图 检测 检测 检测 检测 2929 . . 耐药检测项目 n目前检测的变异位点： P区耐药位点11个 （169、173、180、181、184、194、202、 204、 233、236、250） n专门检测LAM变异位点：180，181，204，173 n专门检测ADV变异位点：181，233，236 3030 . . 艾迪康医学检验中心P区基因变异检验报告单样张 3131 . . 丙型肝炎病毒 l传播途径:主要血液/体液传播(似HBV) l是引起输血后慢性肝炎和肝硬化主要原因 l无症状HCV携带者和慢性丙肝者多见 l感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上 l免疫力不牢固 黄病毒科 丙型肝炎病毒属 球形有包膜的RNA病毒，直径50nm 病毒基因为单股正链RNA，链全 长约10Kb 3232 . . HCV RNA