MDA 多重置换扩增技术ppt演示课件

多重置换扩增（MDA）技术对单 细胞基因组测序技术研究进展 1. 基因测序技术 目前应用的快速序列测定技术可以总的概括为两 种：合成法和降解法。基于Sanger等（1977）提 出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解 法这两种基本思想。 传统用于DNA测序的方法有毛细管微阵列电泳测 序和焦磷酸测序等，这些方法往往技术要求高、 成本贵，而且容易出错。 2. 截至2007年，第二代基因测序方法已经普遍推广应用，极 大地降低了测序的成本和时间，实现了高通量测序。 2008年又提出了更快更好的第三代测序方法-单分子测序 （SMS） 3. 基因测序技术 基因测序需要一定量的DNA模板，所以测序前需对微生 物进行分离和培养，但是环境中大多数的微生物是不可 培养或对培养条件要求很高的，这无疑给测序增添了难 度。 单细胞全基因组测序技术：通过一种叫做全基因组扩增 技术，不需要进行微生物培养，可以直接扩增放大单个 细菌中的DNA获得作为模板所需的微克DNA 。 4. 单细胞全基因组测序 单细胞全基因组测序技术：是在单细胞水平对 全基因组进行扩增与测序的一项新技术。 其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组 DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组 之后通过外显子捕获进而高通量测序用于揭示 细胞群体差异和细胞进化关系。 5. 全基因组扩增技术 全基因组扩增技术主要分为两种类型： 一是基于热循环以PCR为基础的扩增技术，如简并 寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)、连接反应介导的PCR (LM-PCR)、扩增前引物延伸反应 (PEP)等； 一是基于等温反应不以PCR为基础的扩增技术，如 多重置换扩增 (MDA) 和基于引物酶的全基因组扩增 (pWGA)。 6. 通过MDA扩增DNA 多重置换扩增(Multiple dilacement amplification，MDA)是1998 年由耶鲁大学Lizardi博士首次提出。这种恒温扩增的方法依赖 于链置换扩增原理，利用噬菌体29DNA聚合酶，高度扩增 DNA。该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增 100Kb 的DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3 -5外 切酶活性，错误率仅为5 x 10-6，大约比Taq DNA聚合酶低100倍 ，因此可以保证扩增的高保真性。 29DNA聚合酶强大的向前延伸活性和高保真度，使得通过 MDA可从极少量的DNA样本获取大量高质量的DNA，是到目 前为止对整个基因组覆盖最广、各位点扩增偏倚最小的WGA方 法。 7. 目前单细胞微生物可以通过对多重置换扩增反应（ MDA）得到 的扩增DNA进行测序。 在细菌中几个飞克 (10-15g)的DNA能扩增得到微克(10-6g)的高分 子量DNA，扩增得到的DNA 适合DNA文库的构建和Sanger测序。 MDA生成的DNA也可直接作为模板供焦磷酸测序。 单个细胞间基因序列的联系也是一个功能强大的工具，它可用 于对从环境DNA的提取物（宏基因组序列）得到的多重有机体 通过鸟枪法测序来指导构建基因芯片。 8. 多重置换扩增（MDA）的示意图： 首先随机六碱基引物在多个位点与模板DNA退火，接 下来Phi 29 DNA 聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制， 它沿着DNA模板合成DNA,同时取代模板的互补链。被置换 的互补链又成为新的模板来进行扩增，因此最终我们可以 获得大量高分子量的DNA. 模板 引物 引物 9. 多重置换扩增 (MDA) MDA是目前公认的最好的单细胞基因组扩增技术，它能对全基因组进 行高保真的均匀扩增，扩增出10100kb大小的片段，能提供大量均一 完整的全基因组序列。 但是MDA也有一些缺点，特别是显著的非特异扩增，往往空白对照样 品也总是“无中生有”地产生大量的DNA，另外就是仍然存在序列偏 差。尽管各种改进的策略正在逐步减少这些缺陷，高覆盖率、高保真 性及高特异性的扩增仍然是亟待解决的问题。 另外，对测序得到 的大量数据结果的专业分析也是一个重大的挑 战。 单细胞全基因组测序正在从基础研究走向临床应用。 10. 多重置换扩增技术（MDA） 多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）的 技术： 不需要进行微生物培养，可以直接扩增放大单个细菌中的DNA 获得作为模板所需的微克DNA 。 整个实验包括： 环境样品的准备、单细胞分离、MDA扩增DNA、DNA测序 等。 11. 12. 环境样品的处理 富集环境样品中的微生物片段以利于分离单个细胞。 分离单细胞前土壤先经过密度梯度离心预处理。如果 是水样本，假如对生物体浓度有要求则要考虑附带过 滤。 离心、液体加压冲击法、过滤和静电沉积法 。 液压冲击型空气收集器可使细胞悬浮在用于分离单细 胞的溶液中，可高效地捕获液体基质中1-10m的微 粒。 13. 分离单细胞 根据所需要的生产量、环境以及靶生物体等情况，可以通过采 用稀释法、荧光活性细胞筛选（FACS）、显微操作和微流体分 离到单个细胞用于MDA，采用FACS可以在一分钟内分离到上 千个细胞。 单细胞分离结合荧光原位杂交（FISH）可以富集特异的菌属， 机械的显微操作（基于体外受精的装备）结合现代研究显微镜 方法可以高效地分离到单细胞，如跟FISH结合从环境样本中筛 选出特异的种类用于MDA扩增单细胞DNA实验。 14. 细胞分选细胞分选 15. 流式细胞仪的测量对象 大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围：0.2uM-300uM。 对象类型 细胞类型： （1） 高等真核细胞； （2）酵母； （3）细菌； （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。 16. 全基因组扩增(WGA)是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技 术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA 的总量。 该技术通过对微量组织样本，甚至单个细胞的整个基因组DNA扩增， 再将其扩增产物作为模板，进行后续分析，进而完成多位点、多基因 以及全基因组DNA 组成的研究。 WGA技术发展至今主要IRS-PCR(interspersed repeat sequence PCR )、 LA-PCR(1inker adaptor PCR)、Alu PCR、T-PCR (tagged random primer PCRT-PCR)、扩增前引物延伸(primer extension preamplification， PEP)和简并寡核苷酸引物PCR (degenerate oligonucleotide primer-PCR ，DOP-PCR)。但是，由于发生非特异性扩增，位点覆盖不完全， DNA 产物片段小于1 kb等缺点，限制了这些方法的应用。 17. 初始模板量分别为：0.1ng,1ng,10ng,100ng，产量均为40g左右。 MDA 反应的产量 受起始DNA浓度的 影响较小，Dean等 通过对不同量的模 板DNA进行MDA 反应，发现终产量 较一致。这对于大 范围的遗传学应 用十分有利，因为 不需要测量或平衡 DNA浓度而直接进 行扩增，而能产生 同样量的DNA。 18. MDA的应用 SNPs和STRs基因型检测 基因拷贝数改变的检测 DNA测序 总的来说，MDA 由于其基因型的可靠性、高敏感性、高基因组覆盖 率以及较低的扩增偏向性等优点，使得该方法成为目前最有优势的 WGA方法。MDA 已经广泛的应用于包括定量PCR、SNP基因型分 析、Southern印迹分析、染色体图谱中。 19. 基于MDA的单细胞测序 主要研发人：深圳华大基因研究院 技术看点：将多重置换扩增(MDA)和测序技术相结合。 技术简介： 本技术基于多重置换扩增(MDA)，并对该方法的扩增均一性、灵敏度、特异性等 方面进行了全面评估。这种将多重置换扩增和测序技术相结合的单细胞测序方 法不仅具有更高的分辨率和基因组覆盖度，而且具有更好的敏感性和特异性。 该方法从单核苷酸水平上为各种复杂疾病和生物学过程的研究开辟了新思路。 技术论文： Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative Neoplasm Single-Cell Exome Sequencing Reveals Single-Nucleotide Mutation Characteristics of a Kidney Tumor MDA的应用 20. MDA的应用 2012年，华大基因首次利用以MDA为基础的单细胞测序技术对原发性血小板 增多症(essential thrombocythemia, ET)病人的单个骨髓细胞进行了测序并分析 ，筛查出在ET发病和进展中的驱动基因, 从而证实ET为单克隆来源的疾病1。 同时，也将该方法与经典方法进行比较，从而建立了具有高敏感性、高特异 性、假阳性率低等特点的单细胞测序方法，为分析疾病的遗传学结构特征及 克 隆进化过程提供了新的思路。同样的方法也用于分析单个肾癌细胞的单核 苷酸突变特征，从而在更高的分辨能力上为评价基因改变的复杂性提供了更 为优化的方法 1Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative Neoplasm 21. 近来对MDA 方法的改进： 减少MDA的反应体积：通过减少污染的扩增DNA和非特异性的合成，如引 物二聚体，本质上就是通过消除不必要的反应体积增强特异性的扩增。 通过使用60 nl微流控反应可提高扩增的特异性。 在MDA中，分支的DNA 中间体的形成可导致在一些对初始模板DNA链的 延长，然后被置换并对一个不同的模板延长，其结果是形成嵌合体。完 整的MDA反应物和S1核酸酶处理后可以消除DNA的单链形式，这可使使嵌 合体达到80的减少。 对嵌合体形成酶路径的了解目前正被用来减少嵌合体的发生。 22. 微流控芯片 微流控芯片采用类似半导体的微机电加工技术在芯片上构建微流路系统,将实验 与分析过程转载到由彼此联系的路径和液相小室组成的芯片结构上。加载生 物样品和反应液后,采用微机械泵、电水力泵和电渗流等方法驱动芯片中缓冲 液的流动,形成微流路,于芯片上进行一种或连续多种的反应。激光诱导荧 光、电化学和化学等多种检测系统以及与质谱等分析手段结合的很多检测手 段已经被用在微流控芯片中,对样品进行快速、准确和高通量分析。 微流控芯片的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复 合体系的微全分析系统。微型反应器是芯片实验室中常用的用于生物化学反 应的结构,如毛细管电泳、聚合酶链反应、酶反应和DNA 杂交反应的微型反应 器等。 23. 近日， Nature出版集团旗下刊物Scientific Reports刊发南方科技大学 副教授贺建奎课题组最新研究成果单细胞基因组扩增法的定量评估 及其在检测单个海马神经元基因拷贝数变异的应用，从多个角度评 估了三种最常用的单细胞基因组扩增方法。经过细致比较发现， MALBAC和GenomePlex WGA4的方法在拷贝数变异检测方面明显优于 MDA方法。 (Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles,多重退火和 成环循环扩增技术)MALBAC:哈佛大学终身教授、美国科学院院士谢晓 亮（Sunney Xie）教授研发。 技术论文：PMID: 23258894 24. Amplification of Break-points PacBio RS测序系统是基于单分子实时测序技术（SMRT）和纳米微孔应 用的第三代测序平台。SMRT技术以单分子为单位，实时地传导、记 录并分析带荧光标记的测序反应；纳米微孔技术保证了单一荧光信号 强大的稳定性和准确率。 许多实体瘤和恶性血液病患者的癌症基因组中都存在着肿瘤抑制基因 缺失和其他染色体重组现象，而重组的断点在个体间存在着很大差异 ，例如常见的CDKN2A基因缺失。结构变异中断裂位点的特征可以作 为一种有用的肿瘤生物标记物1。 1.Amplification and thrifty single-molecule sequencing of recurrent somatic structural variations 25. Amplification of Break-points 文章中提出了一种专门针对异质性肿瘤和生殖细胞样本中SV断 点的方法，称为AmBre（Amplification of Break-points）。 AmBre方法是通过PCR扩增SV（structure variation）断裂位点片 段，然后用Pacific Bio